Nanoscopische beeldvorming van menselijke weefsel secties via fysische en isotrope expansie

We presenteren expansiepathologie, kortweg ExPath, een lage kostenmeting voor het beeld biomolecule van belang in de standaard klinische weefselsecties, met nanoschaal precisie. ExPath omzeilt de diffractielimiet van conventionele lichtmicroscopie door de klinische weefselsectie chemisch te bezielen met een waterzwellbare hydrogel, en vervolgens de behandelde monsters fysiek en gelijkmatig uit te breiden met ongeveer honderd keer, waardoor eerder overlapte fluorescerende biomoleculen kunnen worden gescheiden en waargenomen met een conventionele optische microscoop. ExPath stelt gebruikers in staat om nanoschaalconfiguraties van ziektegerelateerde biomoleculen in weefselmonsters te bestuderen, zonder te hoeven investeren in nieuwe imaging hardware.

Dus, het mogelijk maken van nieuwe inzichten van de ziekte en het bevorderen van nieuwe diagnose. Deze methode kan worden toegepast op een breed scala van weefseltypes en worden gebruikt om nieuw inzicht te geven in de pathogenese van verschillende complexe ziekten, zoals kanker, hersenziekte, auto-immuunziekte, en anderen. Visuele demonstratie is belangrijk om te illustreren hoe de kritieke stappen goed te doen, zoals de bouw van de geling kamer en het hanteren van de gelled monster voor en na Proteinase K spijsvertering.

Begin met het omzetten van het weefsel van belang in een ExPath compatibel formaat. Als u met FFPE klinische monsters werkt, plaatst u de dia met het monster in een 50ml conische buis en voegt u 15 ml Zylene toe. Dop de buis en plaats deze horizontaal op een orbitale shaker op ongeveer 60 rpm gedurende drie minuten.

Herhaal de was met nog eens 15 ml Zylene. Was vervolgens de dia in een reeks ethanolverdunningen, volgens de handschriftrichtingen. Als u met gekleurde en gemonteerde permanente glijbanen werkt, plaatst u elke dia in een conische buis van 50 ml en bedek deze met Zylene.

Verwijder voorzichtig de afslag slip met een scheermesje. Verwerk de dia vervolgens op dezelfde manier als de FFPE-klinische monsters. Als u werkt met niet-bevestigde bevroren weefselglijbanen in oct-oplossing, bevestig het weefsel in aceton gedurende tien minuten op 20 graden Celsius en was de monsters vervolgens drie keer gedurende tien minuten per wasbeurt met 1X PBS-oplossing.

Als de verwerking eerder vaste en bevroren klinische monsters, laat de dia's gedurende twee minuten op kamertemperatuur om de OTC-oplossing smelten, dan was het monster met 1X PBS drie keer, gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voer na de conversie van de indeling het ophalen van antigen uit op alle monsters. Verhit 20 millimolar Citrate oplossing tot 100 graden Celsius in een magnetron en plaats de dia in de oplossing.

Breng de container onmiddellijk over in een incubatiekamer en broed het dertig minuten bij 60 graden Celsius uit. Om het monster te bevlekken, gebruikt u een hydrofobe pen om een grens rond het weefselgedeelte op de dia te tekenen. Plaats de glijbaan in een petrischaaltje en vervolgens het weefsel met een blokkerende buffer gedurende een uur bij 30 graden Celsius.

Vervolgens, incubeer de weefsels met de primaire antilichaam oplossing voor ten minste drie uur bij kamertemperatuur of 37 graden Celsius. Na de incubatie, was het weefsel drie keer met blokkerende buffer, en incubeer het in secundaire antilichaamoplossing minstens één uur bij kamertemperatuur, of 37 graden Van Celsius. Herhaal de wasbeurten met de blokkerende buffer en voer vervolgens fluorescerende beeldvorming uit met behulp van een conventionele breedveldmicroscoop of een ander beeldvormingssysteem naar keuze.

Bereid verankeringsoplossing voor volgens de manuscriptinstructies. Plaats de glijbanen in een petrischaaltje van 100 ml, pipet de verankeringsoplossing over het weefsel en broed ze minstens drie uur bij kamertemperatuur uit. Bereid vervolgens de oplossing voor geling volgens de aanwijzingen van het manuscript.

Verwijder overtollige verankeringsoplossing uit de weefselsectie en plaats de glijbaan terug in de petrischaal. Voeg verse koude geling oplossing aan het monster en incubeer het mengsel gedurende dertig minuten, op vier graden Celsius. Om een kamer op de dia rond het monster te bouwen, maak spacers door dun stukjes afdekglas te snijden met een diamantmes.

Zet de afstandhouders aan weerszijden van het weefsel met water vast en plaats voorzichtig een coverglass deksel over de glijbaan, om te voorkomen dat luchtbellen over het weefsel worden gevangen. Vervolgens, incubeer het monster op 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving voor twee uur. Verwijder het deksel van de gelingkamer door voorzichtig een scheermesje onder de coverslip te schuiven en het langzaam van het geloppervlak te tillen.

Trim de lege gel rond het weefsel om het volume te minimaliseren, zorg ervoor dat de gel asymmetrisch snijden om de oriëntatie te volgen. Verdun Proteinase K een tot tweehonderd in de spijsvertering buffer, zorg ervoor dat voldoende oplossing voor te bereiden om volledig onder te dompelen de gel. Vervolgens, incubeer het monster met de oplossing in een gesloten container voor drie uur op 60 graden Celsius.

Als het monster niet loskomt tijdens de spijsvertering, gebruik dan een scheermesje om het voorzichtig te verwijderen. Gebruik een zachte verfborstel om het monster over te zetten in 1X PBS in een container die compatibel is met het gewenste beeldvormingssysteem en groot genoeg is om de volledig geëxpandeerde gel tegemoet te komen. Was het monster in PBS gedurende tien minuten en indien gewenst restain het met 300 millimolar DAPI.

Vouw de monsters uit door het monster drie tot vijf keer per wasbeurt met een teveel aan dubbel gedestilleerd water te wassen. Voer vervolgens fluorescentiebeeldvorming uit. Als dit protocol met succes wordt uitgevoerd, worden monsters na mechanische homogenisatie als een platte en transparante gel weergegeven en kunnen ze met een factor 3 tot 4,5 in water worden uitgebreid.

Een vijf micrometer dik FFPE niermonster werd 4,5 keer uitgebreid, wat resulteerde in een resolutie van 63 nanometer met behulp van een 0,95 NA doelstelling. Het weefsel werd vervolgens omgezet in een uitbreiding pathologie compatibel formaat en bevlekt met antilichamen voor Alpha Actinin 4 en Vimentin, DAPI om nucleair DNA te visualiseren, en Wheat Germa Glutenin om koolhydraten te labelen. Spinnende schijfconfocale microscopie werd vervolgens gebruikt om het monster in beeld te brengen.

Het nierweefsel werd vervolgens volledig uitgebreid in water en opnieuw afgebeeld. Kraken, vervormingen en verlies van gelabelde doelen kunnen het gevolg zijn van onvoldoende verankering of homogenisatie. Hematoxylin en eosin gekleurd normaal borstweefsel werd behandeld als een FFPE monster, uitgebreid, gelabeld met DAPI, en afgebeeld op een draaiende schijf confocale microscoop.

Ongefixeerde en bevroren nierplakjes werden ook verwerkt met behulp van dit protocol. Het weefsel werd gefixeerd in koude aceton en gekleurd met Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI en Wheat Germa Glutenin. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om de timing van de gelatiestap te onthouden.

Voortijdige gelatie kan vervormingen veroorzaken, expansie beperken en leiden tot verlies van doelmoleculen. Na deze procedure kan fluorescerende beeldvorming worden uitgevoerd op een microscoop na de spijsvertering en uitbreiding van het monster. ExPath kan breed worden toegepast in zowel pathologieën als daarbuiten.

Omdat het onderzoekers in staat stelt om subtiele details te visualiseren in de weefselmonsters van belang. Daarom kan het onderzoekers helpen om nieuwe inzichten te krijgen in de pathogenese van ziekten of mechanismen van biologische processen.