Visualisering van de morfologie van de astrocyten met behulp van Lucifer geel Iontforesis

Deze methode kan worden gebruikt om de visualisatie van zeer fijne astrocytenprocessen te vergemakkelijken voor de evaluatie van astrocytenneuronale interacties bij de synaps tijdens ziekte en stabiele toestanden. Deze techniek kan ook worden toegepast in elk muismodel, celpopulatie of hersengebied. Om een scherpe elektrode met een geschikte weerstand voor te bereiden, trekt u een borosilicaatglas single barrel elektrode met een gloeidraad op een micropipet trekker.

Bewaar de getrokken elektroden in een gesloten container om te voorkomen dat stof in de uiteinden komt en houd de elektroden vanaf de bodem van de doos verhoogd om te voorkomen dat de uiteinden breken. Om een elektrode te vullen met lucifer gele kleurstof oplossing, plaats een elektrode in de verticale positie met de tip naar beneden gericht, en pipette een tot twee microliters van lucifer gele oplossing in de achterkant van de elektrode. Wacht vijf tot tien minuten tot de oplossing via capillaire werking naar de punt is verplaatst voordat u de gevulde elektrode voorzichtig vastzet in een elektrodehouder die is aangesloten op een manipulator met de zilverdraad van de elektrodehouder in contact met de lucifergeel in de elektrode.

Voor de kleurstof uitwerptest, plaats voorzichtig een licht vaste hersenen slice in een glazen bodem schotel gevuld met 0,1 molaire PBS op kamertemperatuur en houd het plak op zijn plaats met een platina harp met nylon snaren. Sluit de elektrode aan op een spanningsbron en plaats de grondelektrode in het bad met de hersenschijf. Verplaats het doel van een confocale microscoop naar het hersengebied van belang en verlaag de elektrode in de oplossing met behulp van de 10X wateronderdompelingslens, die de elektrode naar het midden van het gezichtsveld verplaatst.

Onder heldere veldverlichting moet u de elektrode zorgvuldig onderzoeken met de 40X wateronderdompelingslens om ervoor te zorgen dat de elektrode helder en zonder vuil of bellen lijkt. Schakel over op confocale laserscannde microscopie met een laser van 488 nanometer. Zet de stimulator op 12 volt om de kleurstof uitwerping te testen.

Een grote fluorescerende kleurstofwolk moet zichtbaar zijn rond het puntje van de elektrode. Dan, onder helder-veld langzaam lager de elektrode in de richting van de slice, stoppen net boven het oppervlak. Om een astrocyt van belang te vullen met iontophorese, gebruik maken van de infrarood differentiële interferentie contrast om astrocyten te identificeren met langwerpige ovaalvormige somata ongeveer 10 micrometer in diameter, 40 tot 50 micrometer onder het snijoppervlak.

Dit is het stratum radiatum van de hippocampus direct onder de piramidale cellaag. Als we door het weefsel gaan, kunnen we bloedvaten, neuronen, astrocyten en andere celtypen zien. Zodra een astrocyt is geselecteerd, verplaats de cel naar het midden van het gezichtsveld en laat u de elektrodepunt langzaam in het segment zakken en navigeert door het weefsel totdat de elektrode zich op dezelfde vlakte bevindt als het cellichaam.

Zodra het cellichaam van de astrocyt duidelijk zichtbaar en geschetst is, langzaam en voorzichtig de elektrode naar voren, waardoor de elektrode wordt verplaatst totdat de punt de soma van de cel doorboort. Beweeg de focus van het doel langzaam op en neer om op te merken of de elektrode zich in de soma bevindt. Zodra de elektrodepunt zich in de cel bevindt, schakelt u de stimulator op 0,5 tot 1 volt in om continu stroom in de cel uit te werpen.

Met behulp van de confocale microscoop, bekijk de celfilm, het verhogen van de digitale zoom om de details van de cel te visualiseren en om ervoor te zorgen dat de punt van de elektrode zichtbaar is in de cel als dat nodig is. Wacht ongeveer 15 minuten tot de fijnere takken en processen worden gedefinieerd voordat u de spanning uitschakelt en de elektrodepunt voorzichtig uit de cel haalt. Als u de gevulde cel wilt weergeven, wacht u 15 tot 20 minuten voordat de cel terugkeert naar zijn oorspronkelijke vorm voordat u de instelling op de confocale microscoop aanpast om ervoor te zorgen dat de fijnere takken en processen worden gedefinieerd onder de doelstelling 40X.

Stel een Z-stack in met een stapgrootte van 0,3 micrometer, verplaats de doelstelling terwijl de weergave is totdat er geen signaal van de cel is en stel die stap in als de bovenkant. Beweeg dan het doel naar beneden, scherpstellen door de cel totdat er geen signaal en stel die stap als de bodem. Nadat de beeldvorming is voltooid, controleert u de elektrode op kleurstofuitwerping.

Als er een grote kleurstofwolk verschijnt, kan de elektrode worden gebruikt voor het volgende segment. Vervang anders de elektrode. Door het genereren van een maximale intensiteitsprojectie kan een gedetailleerd beeld van de structuur van een astrocyt in zijn domein worden waargenomen.

Een vier X magnitude zoom in de astrocyte onthult een maximale intensiteit projectie van een grote tak, verschillende secundaire takken, en de verdeling van de omliggende vertakkingen en folders. Hier wordt het originele beeld van een CA1 astrocyt getoond. Het cellichaam, de belangrijkste takken, processen en het gebiedsvolume dat door astrocyt wordt ingesloten worden gereconstrueerd in deze volgende beelden.

Nadat de reconstructies werden gemaakt, werden de volumes van de soma, de hele cel en het grondgebied gekwantificeerd. En het aantal grote filialen werd geteld. Als cytoskeletale eiwit dat tussenliggende astrocyten filamenten labels wordt uitgedrukt in de cel soma, grote takken, en sommige secundaire astrocyten takken, maar niet in de fijnere takken en processen.

In deze representatieve analyse werden geen significante verschillen gevonden in het aantal primaire takken dat wordt aangeduid met gliafzuurzuur eiwit en die visualiseren door lucifer geel. Verder waren het celgebied en het volume van het astrocyt gelabeld door gliafibrillair zuur eiwit aanzienlijk kleiner dan het gebied en het volume gevisualiseerd met lucifer geel, wat aantoont dat gliamzuurzuur eiwit een betrouwbare marker is voor het labelen van grote takken, maar niet nuttig is voor het bepalen van het totale gebied of volume van de cel. De hoeveelheid kleurstof die vrijkomt uit de elektrodepunt is afhankelijk van de elektrodeweerstand die hoog genoeg moet zijn om een gestage stroom van kleurstof te kunnen uitwerpen.

Toekomstige studies kunnen de verschillende componenten van astrocytenstructuur onderzoeken door superresolutie lichtmicroscopie of door immunohistochemische analyse van de expressie van specifieke eiwitten binnen de astrocytenstructuur.