Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Met TRAP-seq kunnen we het RNA isoleren van specifieke celtypen, zoals de hepatocyten die opnieuw in gewonde lever komen om de veranderingen in genexpressie in die cellen te analyseren. Het vereist geen stappen om ongewenste cellen uit het weefsel te verwijderen. Het celtype-specifieke RNA wordt geïsoleerd door affiniteitszuivering van hele orgaanlysates.

Deze techniek helpt ons bepalen hoe specifieke cellen reageren op verwondingen, die kunnen helpen bij het identificeren van nieuwe strategieën of geneesmiddelen om leverziekte te bestrijden. Dit kan worden gebruikt om te bepalen hoe levercellen reageren op verschillende soorten leverletsels. Momenteel zijn er weinig opties voor ernstige acute leverletsels en deze methode zal helpen om aanwijzing ons in nieuwe behandelingen.

Deze methode is ontstaan in de hersenen. In de lever, we voor ogen het zou kunnen worden gebruikt om dynamische veranderingen in een verscheidenheid van celtypes te onderzoeken, de hepatocyten, galkanaalcellen, Kupffer cellen, en endotheelcellen om er een paar te noemen. Demonstreren van de procedure zal Amber Wang, een afgestudeerde student en mijn mentee.

Om te beginnen, resuspend magnetische kralen door zachte pipetting. Verzamel de kralen op een magnetische standaard voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant. Verwijder vervolgens de microcentrifugebuis van de magnetische standaard en voeg een milliliter PBS toe, gevolgd door pipetten op en neer om de kralen te wassen.

Plaats de buis terug op de magnetische standaard voor meer dan een minuut om de kralen te verzamelen en verwijder de PBS. Om eiwit L-gecoate kralen voor te bereiden, voeg 16 microliter biotinylated eiwit L toe aan de opnieuw opgespente en gewassen magnetische kralen en voeg 1X PBS toe om het uiteindelijke volume een milliliter te maken, bij gebruik van een 1,5-milliliter microcentrifugebuis, of 1,5 milliliter, bij gebruik van een twee-milliliter microcentrifuge buis. Broed de magnetische kralen met biotinylated eiwit L gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur op een buis rotator.

Plaats vervolgens de buis meer dan een minuut op de magnetische standaard en verwijder de supernatant om het eiwit L-gecoate kralen te verzamelen. Haal de microcentrifugebuis van de magnetische standaard en voeg een milliliter PBS toe met een BSA-buffer van 3%, gevolgd door minstens vijf keer zachte pipetten om de eiwit L-gecoate kralen te wassen. Nogmaals, plaats de buis op de magnetische standaard voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant om de gecoate kralen te verzamelen.

Herhaal de BSA wassen nog eens vier keer. Voeg vervolgens 50 microgram antilichamen voor GFP-antilichaam 19C8 en GFP-antilichaam 19F7 toe aan het eiwit L-gecoate kralen en broed gedurende een uur bij vier graden Celsius op een buisdrammer. Om de affiniteitsmatrix te verzamelen, plaatst u de buis meer dan een minuut op de magnetische standaard en verwijdert u de supernatant.

Haal de buis uit de buurt van de magnetische standaard en voeg een milliliter zoutbuffer toe. Voorzichtig pipet op-en-neer om de affiniteit matrix te wassen en herhaal de zoutarme buffer wassen nog eens twee keer. Resuspend de kralen in 200 microliters van low-salt buffer, om 200 microliters van affiniteit matrix te maken.

Stel eerst de weefselmolen in zodat de PTFE-glasbuizen tijdens de homogenisatie op ijs kunnen worden geplaatst. Vul vier milliliter koude lyse buffer in de PTFE glazen buizen. Leg de lever op een petrischaaltje.

Gebruik een mes om 200 tot 500 milligram leverstukken te isoleren en in de PTFE glazen buizen te gaan. Plaats het resterende leverweefsel in een voorgekoelde microcentrifugebuis en flash freeze in vloeibare stikstof. Homogenize de monsters in een motorisch aangedreven homogenisator, beginnend bij 300 rpm gedurende ten minste vijf slagen om hepatocyten te scheiden van de leverstructuur.

Laat de glazen buis telkens zakken. Voorkom beerting, die eiwitverdenaturatie kan veroorzaken, door de stamper onder de oplossing te houden. Verhoog vervolgens de snelheid naar 900 rpm om de leverweefsels volledig te homogeniseren voor ten minste 12 volledige slagen.

Breng het lysaat in gelabelde en voorgekoelde buizen met niet meer dan een milliliter lysaat elk. Om te beginnen met nucleaire lysis, centrifugeren de lever lysaat op 2,000 keer g op vier graden Celsius gedurende 10 minuten, dan de overdracht van de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs. Voeg 1/9e van het supernatant volume van 10%NP-40 toe aan de microcentrifugebuis op ijs en meng de oplossing door de buis voorzichtig om te keren.

Draai snel de microcentrifugebuizen met een minicentrifuge naar beneden en voeg 1/9e van het monstervolume van 10% DOC. Meng door de microcentrifugebuizen voorzichtig om te keren en draai snel de microcentrifugebuizen naar beneden en broed gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer het kernlysaat op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en breng het supernatant over op nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuizen op ijs.

Neem voor elke buis 1% van het totale volume van de supernatant eruit als pre-immunoprecipitatiecontrole. Plaats de pre-immunoprecipitatie controles op een buis rotator op vier graden Celsius 's nachts. Wees extra voorzichtig met het voorzichtig opnieuw oplichten van de affiniteitsmatrix door pipetting en voeg vervolgens 200 microliters toe aan elk monster.

Incubeer de lysates op vier graden Celsius 's nachts met zachte mengen op een buis rotator. Om RNA te isoleren, draai je snel de buizen met de lysaten in de minicentrifuge naar beneden en verzamel je de kralen door minstens één minuut op het magnetische rek te plaatsen. Verzamel de supernatant in extra microcentrifugebuizen.

Voeg een milliliter verse zoutbuffer met veel zout toe aan elke buis, gevolgd door minstens vijf keer zachte pipetting zonder bellen te introduceren. Verzamel de kralen op de magnetische standaard op ijs voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant. Herhaal de wasstappen nog vier keer.

Verwijder vervolgens de microcentrifugebuizen van de magnetische standaard en plaats vijf minuten op kamertemperatuur om op te warmen. Resuspend de kralen in 100 microliters van lyse buffer met 0,7 microliter bèta-mercaptoethanol om gebonden RNA vrij te geven van de affiniteit matrix. Vortex de buizen voor ten minste vijf seconden op de hoogste snelheid en snel spin naar beneden.

Vervolgens, incubeer de buizen op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Plaats de buizen minstens één minuut op de magnetische standaard, verzamel vervolgens de supernatant en ga onmiddellijk door naar RNA-opruiming volgens het RNA-zuiveringsprotocol in de kit. Voer alle optionele stappen uit, inclusief DNase-vertering en alle RNA-elutiestappen, inclusief de aanbevolen voorverwarming van de elutiebuffer tot 60 graden Celsius.

In deze studie werden GFP-L10A-fusie en Fah-transgenes mede-geleverd binnen een transposon-bevattende plasmide valvector naar levers door hydrodynamische injectie. Het verwijderen van nitisinone veroorzaakte een toxisch leverletsel. Immunofluorescentie kleuring bevestigde de coexpressie van de FAH en GFP-L10A fusie-eiwit en de herbevolking hepatocyten na twee weken van leverherbevolking.

Het rustige monster produceerde de hoogste opbrengst van fusie-eiwit, omdat alle hepatocyten na AAV8-TBG-Cre injectie GFP-L10A uitdrukken. Omgekeerd was er nauwelijks RNA detecteerbaar in wild-type controles die niet over de GFP-L10A transgene, wat aangeeft dat de TRAP procedure is zeer specifiek en heeft een lage achtergrond. Toen TRAP werd gebruikt op leverweefsel dat herbevolking onderging met GFP-L10A-transduceerde hepatocyten, werd overvloedig RNA van hoge kwaliteit verkregen.

Daarentegen werd geen RNA-spoor gedetecteerd via Bioanalyzer voor het negatieve controlemonster. Gsta1 expressie werd veroorzaakt door meer dan tienvoudige in het herbevolken van hepatocyten in vergelijking met rustige hepatocyten, terwijl er geen drempelcyclus waarden werd gedetecteerd met TRAP-geïsoleerde RNA van het wilde type muis als gevolg van het ontbreken van input RNA. Bij het homogeniseren van het weefsel, zorg ervoor dat de stamper langzaam te verplaatsen om beerting te voorkomen.

Na het isoleren van het RNA kunnen hoge-doorvoer sequencing of qPCR worden uitgevoerd om genexpressie te analyseren. Met TRAP-seq hebben we nu een methode om RNA specifiek te isoleren van het herbevolken van hepatocyten en de verandering in genexpressie tijdens leverherbevolking te analyseren. Dit stelt ons in staat om genen te identificeren die tijdens dit proces worden gewijzigd en potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van leverletsel.

Cycloheximide en DTT, die aanwezig zijn in verschillende buffers, zijn beide giftig. Afval moet worden ingezameld en weggegooid volgens institutionele richtlijnen.