Name: Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Leer bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering met lage concentraties cryoprotectieve agentia. Deze methode verbetert celviabiliteit en metabole activiteit voor hepatocytentransplantatie en bio-artificiële leverapparaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 en R01DK114506) en het Amerikaanse ministerie van defensie (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wordt sterk erkend.

De primaire hepatocyte isolaties voor dit protocol werden uitgevoerd door de Cell resource core (CRC) bij Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Het Animal Protocol (#2011N000111) werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Massachusetts General Hospital.
1. bulk druppel verglazing
<ol><li>Bereid de vitrificatie-oplossingen.
	<ol>
<li>Voeg 40 mg bovien serumalbumine (BSA) toe aan 17,0 mL van de Universiteit van Wisconsin oplossing (UW) om vitrificatie oplossing 1 (v1) te maken. Steriel filter de V1-oplossing met een 0,22 μm-filter en bewaar bij 4 °C. Opmerking: UW is een veelgebruikte orgaan conserverings oplossing. Het bevat 50 g/L hydroxyethyl zetmeel, 35,83 g/L lactobionic acid, 3,4 g/L kalium fosfaat monobasic, 1,23 g/L magnesiumsulfaat heptahydraat, 17,83 g/L raffinose pentahydraat, 1,34 g/L adenosine, 0,136 g/L Allopurinol, 0,992 g/L totaal glutathion, 5,61 g /L kaliumhydroxide en natriumhydroxide om de pH op 7,4 aan te passen.</li>
		<li>Combineer 7,0 mL van UW, 6,5 mL DMSO, 6,5 mL ethyleenglycol (bv), 40 mg BSA, en 5,48 g sucrose om vitrificatie oplossing 2 (v2) te maken. Steriel filter de v2-oplossing met een 0,22 μm-filter. Laad 3,5 mL steriele gefilterde v2-oplossing in een doseerspuit van 3 mL en bewaar deze bij 4 °C. Opmerking: om het oplossen van de Ocmw's te vergemakkelijken, worden oplossingen in grotere hoeveelheden bereid dan vereist.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid het verglazing apparaat van de bulk druppel.
	<ol>
<li>Om de mengnaald voor te bereiden, moet u eerst langs één zijde van de buitenste grijze huls van de mengnaald snijden en vervolgens de huls open buigen om deze van de mengnaald te verwijderen.</li>
		<li>Schuif 2 25 mm silicone buis secties over de inlaten van de mengnaald en bevestig hun positie met lijm (Figuur 1A).</li>
		<li>Snijd de naald tot een lengte van 20 mm (d.w.z. de lengte van de binnenste Meng spiraal) zoals afgebeeld in Figuur 1a. Opmerking: de mengnaald lengte is evenredig aan het volume in de naald en kan daarom worden gewijzigd om de blootstellingstijd van de hepatocyten te regelen tot de hoge CPA-concentratie oplossing.</li>
		<li>Steek de afsluit opening van de mengnaald in een injectienaald van 20 G (Figuur 1B). Opmerking: de grootte van de injectienaald beïnvloedt de grootte van de druppel.</li>
		<li>Steriliseer de mengnaald assemblage door Autoclaveren.</li>
		<li>Vul een steriele Dewar met vloeibare stikstof. Steriliseren de buitenkant van de Dewar met isopropanol voor het plaatsen van de Dewar in een steriele laminaire flow Cell cultuur kap. Opmerking: verontreiniging is een belangrijke overweging bij directe blootstelling van de druppels aan vloeibaar stikstof. Hoewel er geen besmetting met niet-gesteriliseerde vloeibare stikstof in het huidige protocol was, kan vloeibare stikstof worden gefilterd of bestraald om de steriliteit te garanderen indien nodig16.</li>
		<li>Plaats een trechter met dezelfde buitendiameter als de binnendiameter van de vloeibare stikstof-Dewar in een conische buis van 50 ml om het druppel verzamelapparaat te maken (Figuur 1C−E).</li>
		<li>Dompel de druppel verzameling apparaat in de vloeibare stikstof door het langzaam in de uiteindelijke verticale positie te drukken met behulp van grote Tang. Zorg ervoor dat de conische buis in een verticale positie op de bodem van de Dewar rust (Figuur 1D−E). Opmerking: de trechter moet in de conische buis worden gestoken en rusten. Het gehalte aan vloeibare stikstof moet 1 cm onder de inlaat hoogte van de trechter liggen, zoals weergegeven in Figuur 1D.</li>
		<li>Monteer een spuitpomp in verticale positie op de wand van de celcultuurkap door een snaar van de voeten van de spuitpomp te binden aan schroeven die uitsteken van de celcultuurkap wand.</li>
		<li>Plaats de vloeibare stikstof Dewar met de druppel opvanginrichting onder de verticaal gemonteerde spuitpomp (Figuur 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Pre-incuberen met Ocmw's.
	<ol>
<li>Na het verkrijgen van vers geïsoleerde rat hepatocyten, Tel de voorraad concentratie door Trypan blauwe uitsluiting en 40.000.000 levensvatbare Hepatocytes nemen. Opmerking: voorzichtige behandeling van hepatocyten in suspensie is essentieel om celdood te voorkomen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 50 x g gedurende 5 minuten zonder rem.</li>
		<li>Aspireren de supernatant en respenderen de hepatocyten in 3,4 mL v1 oplossing.</li>
		<li>Incuberen op ijs gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Voeg 150 μL DMSO en 150 μL EG toe aan de hepatocyten en meng zachtjes.</li>
		<li>Incuberen op ijs gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Nogmaals, Voeg 150 μL DMSO en 150 μL EG toe aan de hepatocyten en meng zachtjes.</li>
		<li>Laad 3,5 mL in een 3 mL spuit.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer vitrificatie uit.
	<ol>
<li>Plaats de spuit met voorgeïnde hepatocyten en de v2-oplossing spuiten op de spuitpomp adapter.</li>
		<li>Bevestig twee vrouwelijke Luer Lock slang Barb adapters aan de spuiten en schuif de Siliconen slang van de mengnaald over de Barb fittingen (Figuur 1F).</li>
		<li>Plaats de hele assemblage in de spuitpomp (Figuur 1E).</li>
		<li>Drie min na de laatste toevoeging van DMSO en bijvoorbeeld aan de hepatocyten, start de pomp bij 2 mL/min.</li>
		<li>Stop de pomp nadat alle hepatocyten zijn toegevoegd aan de vloeibare stikstof.</li>
	</ol></li>
</ol>2. cryogene opslag
<ol><li>Prik 10 kleine gaatjes in de deksel van een conische buis van 50 mL met een 20 G naald en wikkel de buitenkant van het deksel met een flexibele film, zoals afgebeeld in Figuur 1B. Dit creëert een ventiel dat de ontsnapping van verdampende overgebleven vloeibare stikstof mogelijk maakt.</li>
	<li>Om de verglaasd hepatocyten druppels te verzamelen, Verwijder eerst de trechter uit de vloeibare stikstof Dewar. Gebruik vervolgens lange tang om de conische buis te nemen die de druppeltjes uit de vloeibare stikstof bevat en giet langzaam de overtollige vloeibare stikstof uit de conische buis.</li>
	<li>Sluit de conische buis met het geperforeerde deksel en plaats direct de gesloten conische buis met verglaasd hepatocyten druppels terug in de vloeibare stikstof Dewar.</li>
	<li>Overdracht van de conische buis van de vloeibare stikstof in een vloeibare stikstof damp Cryotank.</li>
</ol>3. opwarmen van de verglaasd hepatocyten druppels
<ol><li>
Bereid de opwarmings oplossing voor.
	<ol>
<li>Los 17,13 g sucrose op in 100 mL DMEM hepatocyte cultuur media om de opwarmings oplossing te maken. Steriel filter de opwarm oplossing met een 0,22 μm filter en warm tot 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opwarmen van de hepatocyten.
	<ol>
<li>Neem de conische buis met verglaasd hepatocyten van de Cryotank en vervoer het in een vloeibare stikstof Dewar naar de cel cultuur kap.</li>
		<li>Draai de dop lichtjes los en plaats de conische buis terug in de vloeibare stikstof.</li>
		<li>Voeg de verglaasd hepatocyte druppeltjes toe aan een leeg bekerglas, voeg ogenblikkelijk de warme (37 °C) opwarm oplossing toe en roer onmiddellijk 10 sec. Opmerking: het is van cruciaal belang om snel te werken om bevriezing tijdens het opwarmen te voorkomen. Afhankelijk van de onderzoekseisen kunnen enkele tot alle verglaasd druppels tegelijk worden opgelicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De opwarm oplossing lossen.
	<ol>
<li>Verdeel de herverwarmende oplossing met hepatocyten over 2 50 mL conische buizen.</li>
		<li>Centrifugeer de twee conische buisjes gedurende 2 minuten bij 100 x g bij 4 °c zonder rem.</li>
		<li>Zuig de supernatant op om een totaal volume van 12,5 mL te gebruiken met het Afstudeer teken van de conische buis als referentie en voeg 12,5 mL ijskoude DMEM per conische buis toe om de opwarmings oplossing te verdunnen tot 50%.</li>
		<li>Respendeer de hepatocyten en incuberen op ijs gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Voeg 25 mL ijskoude DMEM per conische buis toe om de opwarm oplossing te verdunnen tot 25%.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 50 x g bij 4 °c zonder rem.</li>
		<li>Aspireren de supernatant en respenderen de hepatocyten in 2 mL van het gewenste kweekmedium voor gebruik. Opmerking: dichtheidsgradiënt centrifugeren kan worden gebruikt om dode hepatocyten uit de celsuspensie te verwijderen indien gewenst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+and+bioartificial+liver+devices%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li>
<li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+transplantation%3A+Hepatocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li>
<li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li>
<li>Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cryopreservation%3A+is+it+time+to+change+the+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).</li>
<li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation%3A+An+emerging+paradigm+change%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li>
<li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li>
<li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+encapsulating+droplet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).</li>
<li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li>
<li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-%CE%BCl+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li>
<li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+banking+in+living+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530(2011).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li>
<li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Droplet+Vitrification%3A+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li>
<li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li>
<li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant+Toxicity%3A+Facts%2C+Issues%2C+and+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen. Drs. de Vries, Weng, toner, Tessier en Uygun hebben voorlopige octrooiaanvragen die relevant zijn voor deze studie. Dr. Uygun heeft een financieel belang bij Organ Solutions, een bedrijf dat zich richt op het ontwikkelen van orgel conserverings technologie. Alle interesses van de onderzoeker worden beheerd door de MGH en partners HealthCare in overeenstemming met hun beleid van belangenconflicten.

Cryopreservation van hepatocyten door Slow-bevriezing resulteert in verminderde levensvatbaarheid en metabole functie. Vitrificatie biedt een veelbelovend alternatief voor klassieke cryopreservering, omdat het bevriezen van letsel volledig wordt vermeden9. Echter, pre-incubatie met Ocmw's is nodig om de kritische koelsnelheid te verlagen8. Bijgevolg wordt de vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit17 en beperkt tot kleine monstervolumes. In inspann...

Verlies van de levensvatbaarheid van de cel en metabole functie na cryopreservatie van hepatocyten is nog steeds een belangrijk probleem dat de klinische toepassingen beperkt1,2,3. De benchmark methode van hepatocyte cryopreservatie is traag invriezen, die wordt uitgevoerd door het pre-incuberen van de hepatocyten met CPA (dimethylsulfoxide [DMSO], glucose en albumine) en daaropvolgende gecontroleerde snelheid bevriezing (bij ongeveer 1 °c/min) tot cryogene temperaturen4,5. Ondanks veel gerapporteerde optimalisaties blijven CPA-toxiciteit samen met schadeveroorzakende osmotische onevenwichtigheden tijdens het invriezen en mechanische stress van ijsvorming fundamentele nadelen van traag bevriezen van6,7.
Vitrificatie biedt een voordeel ten opzichte van langzaam invriezen in dat letsel als gevolg van ijsvorming wordt volledig vermeden door een directe faseovergang van water in de glas staat6. Om de Glasovergangstemperatuur van zuiver water (-137 °C) te bereiken, moet het water echter worden gekoeld tegen snelheden in de volgorde van 1.000.000 graden Celsius per seconde (d.w.z. de kritische koelsnelheid) om ijsvorming boven de glazen overgangstemperatuur te voorkomen8 . Toevoeging van Ocmw's kan de kritische koelsnelheid verlagen en de Glasovergangstemperatuur van waterige oplossingen9verhogen. Echter, zelfs met hoge CPA-concentraties (bijv. 40% v/v DMSO of hoger) zijn de snelle koelsnelheden niettemin vereist voor een succesvolle verglavering van8,9.
De vereiste koelsnelheden en hoge CPA-concentraties resulteren in twee belangrijke nadelen van vitrificatie. Ten eerste, om snelle koeling mogelijk te maken, moeten de monsters een lage thermische massa hebben. Ten tweede, om hoge CPA-concentraties te bereiken terwijl osmotische schade wordt vermeden, moet de Ocmw's langzaam worden ingevoerd en volledig worden geëscaleerd tussen de intra-en extracellulaire compartimenten6. Dit verhoogt de blootstellingstijd van cellen tot toxische Ocmw's. Samen maakt dit de verglavering tot een omslachtig proces dat beperkt is tot enkele kleine samples (micro liters) tegelijkertijd. Droplet-vitrificatie is voorgesteld als een mogelijke oplossing voor deze beperkingen. Door minuscule cel-beladen druppeltjes (nanoliters) aan vloeibare stikstof bloot te stellen, wordt de koelsnelheid aanzienlijk verhoogd, waardoor een aanzienlijke reductie van de CPA-concentratie mogelijk is10,11,12 ,13,14. Hoewel meerdere hoogfrequente druppel genererende nozzles gelijktijdig kunnen worden gebruikt, beperkt de extreem kleine druppelgrootte de doorvoer tot micro liters per minuut10, wat een efficiënte verglazing van grote cellen uitsluit volumes met magnitudes hogere verwerkingssnelheden op de orde van milliliter per minuut.
Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen van vitrificatie kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes vitrificatie15. Deze nieuwe methode maakt gebruik van snelle osmotische dehydratie om een intracellulaire CPA-concentratie van 7,5% v/v ethyleenglycol en DMSO onmiddellijk voorafgaand aan vitrificatie te concentreren, waardoor de noodzaak van volledige evenwichting van toxische CPA-concentraties wordt geëlimineerd. De cellulaire dehydratie wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat door een korte blootstelling van de hepatocyten aan een hoge extracellulaire CPA-concentratie. Hoewel deze blootstelling snelle osmotische uitdroging veroorzaakt, is het te kort om de hoge CPA-concentratie te verspreiden in de cellen. Onmiddellijk na uitdroging worden de cellen geladen in druppels die rechtstreeks in vloeibare stikstof worden verglaasd. Deze methode elimineert de noodzaak van volledige intracellulaire opname van hoge CPA-concentraties, terwijl de hoge extracellulaire CPA-concentratie vitrificatie van groot formaat druppels mogelijk maakt, resulterend in hoge doorvoer volumes met minimale CPA-toxiciteit.
Druppel vitrificatie verbetert de levensvatbaarheid op de directe en lange termijn na conservering, evenals de morfologie en metabole functie van primaire rat hepatocyten in vergelijking met klassieke cryopreservatie door Slow-bevriezing15. Dit manuscript verschaft de methodologische Details voor bulk druppel verglazing van primaire rat hepatocyten.

<table><tbody><tr><td>BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Beker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW Koude Opslagoplossing</td><td>Bridge to Life</td><td>BUW-001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Vrouwelijke Luer naar 1/16" laagprofiel semi-rigide slangenbarbel, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Cryogene opslagtank / Cryotank</td><td>Chart Industries</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, poeder, hoge glucose, pyruvaat</td><td>Life Technologies</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>Extra lange pincetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifugebuizen - Platte topafsluiting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>Vislijn</td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>Airgas</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>Mix Tips, voor gebruik met 3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Polypropyleen Poedertrechter</td><td>ThermoFisher</td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>Naald 20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - Flexibele film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Vleesmes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriflip steriele filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (Kristal/Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flask Benchtop Vloeibare Stikstof Container</td><td>ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Vitrificatie is een veelbelovend ijsvrij alternatief voor klassiek langzaam invriezen (bij ongeveer 1 °C/min) cryopreservering van biologische monsters. Vitrificatie vereist extreem snelle koelsnelheden om de overgang van water in de glas fase te bereiken, terwijl schadelijke ijsvorming wordt vermeden. Hoewel pre-incubatie met cryoprotective agents (CPA) de kritische koelsnelheid van biologische monsters kan verminderen, zijn hoge concentraties in het algemeen nodig om ijsvrije cryopreservering door vitrificatie mogelijk te maken. Hierdoor wordt vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit en beperkt tot kleine monsters die snel kunnen worden gekoeld. Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes verglazing. Met behulp van deze nieuwe methode worden cellen eerst vooraf geïnincubeerd met een lage intracellulaire CPA-concentratie. Door gebruik te maken van snelle osmotische uitdroging, is de intracellulaire CPA direct voor vitrificatie geconcentreerd, zonder de noodzaak om toxische CPA-concentraties volledig te equilibraten. De cellulaire uitdroging wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat en geïntegreerd met continue hoge doorvoer generatie van groot formaat druppels die zijn verglaasd in vloeibare stikstof. Deze Ice-Free cryopreservatie-methode met minimale CPA-toxiciteit is geschikt voor grote celhoeveelheden en resulteert in een verhoogde levensvatbaarheid van hepatocyten en metabole functie in vergelijking met klassieke langzaam invriezing cryopreservatie. Dit manuscript beschrijft de methoden voor een succesvolle verglazing van de bulk druppel in detail.

Vers geïsoleerde primaire hepatocyten van vijf verschillende rat levers werden gebruikt voor een directe vergelijking van bulk druppel verglazing naar klassieke cryopreservatie met behulp van de vooraanstaande Slow-Vries protocollen gerapporteerd in de literatuur4, 5. Kortom, de hepatocyten werden opgeschort in uw aangevuld met BSA (2,2 mg/ml), glucose (333 mm), en DMSO (10% v/v) en bevroren met een gecontroleerde frequentie vriezer. Na opslag bij-196 °C werden ...

Dit manuscript beschrijft een ijsvrije cryopreservatie-methode voor grote hoeveelheden rat hepatocyten waarbij primaire cellen worden voorgeïnpoleerd met cryoprotective agenten in een lage concentratie en verglaasd in grote druppels.

Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrificatie wordt meestal behandeld door toxiciteit van cryoprotectieve middelen. En opnieuw ingevoegd in kleine monsters die snel kunnen worden gekoeld. Dit protocol maakt vitrificatie van grote celhoeveelheden mogelijk tijdens het gebruik van een lage CPA-concentratie tijdens pre-incubatie.Met behulp van snelle osmotische uitdroging, de lage inter-kelder CPA is geconcentreerd in de vloeistof apparaat direct voor vitrificatie. Dit elimineert de noodzaak van volledig evenwichts giftige CPA concentraties. Bulkdruppel vitrificatie kan levensvatbare en metabolisch actieve hepatocyten voor het gebruik van hepatocyten transplantatie en bio-kunstmatige lever apparaten die onze momenteel belemmerd door onvoldoende resultaten na cryopreservatie.Deze methode kan mogelijk worden aangepast voor vitrificatie van andere celtypen die in grote hoeveelheden moeten cryo-verduurzaamd zijn;zoals bloedproducten of stamcellen. Om te beginnen, maak vitrification Oplossing 1 door het toevoegen van 40 milligram BSA tot 17,0 milliliter van de Universiteit van Wisconsin Solution. Gebruik een filter van 0,22 micrometer om de oplossing te steriliseren en op te slaan op vier graden Celsius.Maak vitrification Solution 2 zoals beschreven in het protocol. En steriel filter het door een 0,22 micrometer filter. Laad 3,5 milliliter steriel gefilterde V2-oplossing in een spuit van drie milliliter en bewaar op vier graden Celsius.Ter voorbereiding van de bulk druppelglavermaak apparaat, eerst, gesneden langs de ene kant van de mengnaalden buitenste grijze huls. Buig de mouw open om deze uit de mengnaald te verwijderen. Snijd vervolgens de mengnaald tot een lengte van 20 millimeter en steek de cut-off uitlaat in een 20-meter injectienaald.Schuif twee 25 millimeter silicium buizen secties over de inhammen van de mengnaald. En zet hun positie vast met lijm. Steriliseren deze assemblage door autoclaving.Vul een steriele Dewar-kolf met vloeibare stikstof. En steriliseer de buitenkant met isopropanol voordat je het in een steriele Laminer flow-cell kweekkap plaatst. Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen als vloeibare stikstof kan ernstige brandwonden veroorzaken.Voor het maken van de druppel collectie apparaat steek een trechter met dezelfde buitenste diameter als de binnenste diameter van de Dewar, in een 50 milliliter conische buis. Druk met grote tangen het druppelophaalapparaat langzaam naar beneden in de vloeibare stikstof in de uiteindelijke verticale positie. Zorg ervoor dat de conische buis in verticale positie aan de onderkant van de Dewar rust.En het vloeibare stikstofniveau is een centimeter lager dan de rand van de trechter. Om een spuitpomp te monteren op een verticale positie op de muur van de celcultuurkap, bind een touw van de voeten van de spuitpomp aan schroeven die uit de muur van de celkweekkap uitsteken. Plaats vervolgens de vloeibare stikstof Dewar met het druppelverzamelapparaat onder de verticaal gemonteerde spuitpomp.Na het verkrijgen van vers geïsoleerde ratten hepatocyten, tellen de voorraad concentratie door tri-pan blauwe uitsluiting. En breng 40 miljoen levensvatbare hepatocyten over in een 50 milliliter conische buis. Centrifuge de hepatocyten op 50 keer G gedurende vijf minuten zonder pauze.Aspirate de supernatant. Schors de hepatocyten opnieuw in 3,4 milliliter V1 Solution. En drie minuten lang incuberen op ijs.Voeg vervolgens 150 microliter DMSO en 150 microliter eg-liters toe;meng voorzichtig en broed nogmaals gedurende drie minuten op ijs. Voeg 150 microliter DMSO en 150 microliter EG weer toe aan de hepatocyten en meng voorzichtig. Laad 3,5 milliliter van dit mengsel in een spuit van drie milliliter.Plaats de spuit met voorgebroede hepatocyten en de spuit met V2 Solution op de spuitpompadapter. Bevestig twee Vrouwelijke Luer Lock slang-barb adapters aan de spuiten. En schuif de silicium buizen van de mengnaald assemblage over de barb fittingen.Plaats deze hele montage in de spuitpomp. Drie minuten na de laatste editie van DMSO en EG aan de hepatocyten, start de pomp op twee milliliter per minuut. Immers hepatocyten zijn toegevoegd aan de vloeibare stikstof stoppen met de pomp.Met behulp van een 20-meter naald, punctie 10 kleine gaatjes in het deksel van een 50 milliliter conische buis. En wikkel de buitenkant van het deksel met een flexibele film, het creëren van een klep die het mogelijk maakt de ontsnapping van verdampende overgebleven vloeibare stikstof. Om de verglaasde hepatocyte druppels te verzamelen, moet u eerst de trechter uit de Dewar verwijderen met vloeibare stikstof.Vervolgens, met lange tangen, haal je de conische buis eruit die de druppels uit de vloeibare stikstof bevat en giet je langzaam de overtollige vloeibare stikstof uit de conische buis. Sluit de conische buis met het doorboorde deksel en plaats de gesloten conische buis met verglaasde hepatocytedruppels direct terug in de Dewar met vloeibare stikstof. Breng ten slotte de conische buis van de vloeibare stikstof over in een vloeibare stikstof cryotank.Na het maken van de opwarmoplossing met sacharose en DMEM hepatocyte kweekmedia, gebruik je een filter van 0,22 micrometer om het te steriliseren. Dan warm het op tot 37 graden Celsius. Om de hepatocyten te warmen verwijder de conische buis met verglaasde hepatocyten uit de cryotank en transporteert deze in een vloeibare stikstof Dewar naar de subcultuurkap.Maak de dop licht los en plaats de conische buis terug in de vloeibare stikstof. Snel werken, voeg alle verglaasde hepatocyte druppels aan een lege beker, voeg dan snel 100 milliliter van 37 graden Celsius warme opwarmoplossing tijdens het roeren gedurende 10 seconden. Wanneer de druppels worden verwijderd uit vloeibare stikstof intra-est bevriezing optreedt binnen enkele seconden als de druppels niet snel worden opgewarmd.Daarom is het van cruciaal belang om de opwarmmedia direct toe te voegen aan de druppels tijdens het roeren. Verdeel de opwarmoplossing met hepatocyten in twee conische buizen van 50 milliliter. Centrifugeren de buizen gedurende twee minuten op 100 keer G bij vier graden Celsius zonder pauze.Aspirate de supernatants om een totaal volume van 12,5 milliliter met behulp van de buis afstuderen merk als referentie te verlaten. Om de opwarmoplossing tot 50% te verdunnen voeg 12,5 milliliter ijskoude DMEM per conische buis toe. Drie minuten opnieuw ophangen en uitbroeden op ijs.Om de opwarmoplossing te verdunnen tot 25%voeg 25 milliliter ijskoude DMEM per conische buis. Na vijf minuten centrifugeren bij 50 keer G bij vier graden Celsius zonder pauze, de supernatant aanzuigen en de hepatocyten opnieuw op te schorten in twee milliliters van het gewenste kweekmedium. Gemeten door tri-pan blauwe uitsluiting testen, die membraan integriteit bepaalt, bulk druppel vitrification resulteerde in een directe post-conservering hepatocyte levensvatbaarheid van 79%Dit was aanzienlijk hoger dan de 68%levensvatbaarheid na klassieke geoptimaliseerde cryopreservatie.De opbrengst van bulkdruppel vitrification was 56%, dat was 10% hoger en consistenter dan klassieke cryopreservatie. Met behulp van presto-lijm metabolisatie test in de lange termijn college en sandwich culturen, metabole activiteit op de hepatocyten werd gemeten om aanzienlijk hoger te zijn na bulk druppel vitrification dan na de klassieke cryopreservatie. Albumin synthese, als de meest gebruikte parameter van synthetische functie van hepatocyten, was groter door bijna twee keer na bulk druppel vitrification, dan na de klassieke cryopreservatie.Ureum productie werd gebruikt om hepatocyte ontgifting functie te meten in een een week cultuur. In bulk druppelvergladde hepatocyten was de ureumproductie aanzienlijk hoger dan die in klassieke cryopreserve hepatocyten. Voor consistente resultaten na bulkdruppel vitrification is het belangrijk om de timing precies te volgen tijdens de pre-incubatie van CPA's en het opwarmen zoals beschreven in dit protocol.Na het opwarmen van de verglaasde hepatocyte druppels zul je eindigen met een betere sizing suspensie die daarom op dezelfde manieren kan worden gebruikt alsof ze vers geïsoleerd zijn. Als een verbeterde conserveringsmethode kan bulkdruppel vitrification de beschikbaarheid pri-ma voor onderzoek en klinische toepassingen verhogen.

bulk-droplet-vitrification-for-primary-hepatocyte-preservation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van primaire muizenhepatocyten uit de lever en het elektropoderen van CRISPR-Cas9 als ribonucleoproteïnen en mRNA om een therapeutisch doelgen geassocieerd met een erfelijke stofwisselingsziekte van de lever te verstoren. De beschreven methoden resulteren in een hoge levensvatbaarheid en hoge niveaus van genmodificatie na elektroporatie.

Elektroporatie-gemedieerde toediening van Cas9 ribonucleoproteïnen en mRNA in vers geïsoleerde primaire muizenhepatocyten

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering met lage concentraties cryoprotectieve agentia. Deze methode verbetert celviabiliteit en metabole activiteit voor hepatocytentransplantatie en bio-artificiële leverapparaten.

Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering

Meer video's verkennen