Name: Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer CRISPR/Cas9-genoombewerking in zwak elektrische vissen uit de families Gymnotiformes en Mormyridae. Dit protocol genereert mutanten voor onderzoek naar genfunctie en fenotypische variatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de heroïsche inspanningen van Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, en Hope Healey voor hulp bij het verzamelen van vis, gegevensverzameling en vroege Protocol ontwikkeling. We willen ook de drie reviewers bedanken voor hun suggesties voor het manuscript. Wij geloven dat het eindproduct van betere kwaliteit is na het aanpakken van hun opmerkingen. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Science Foundation #1644965 en #1455405 aan JRG, en de natuurwetenschappen en Engineering Research Council DG subsidie aan VLS.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De fenotypische rijkdom van zwak elektrische vissen, samen met een recente proliferatie van genomics bronnen, motiveert een sterke behoefte aan functionele genomische gereedschappen in het zwak elektrische vismodel. Dit systeem is bijzonder aantrekkelijk vanwege de convergente evolutie van talrijke fenotypische eigenschappen in parallelle lijn afstanden van vissen, die gemakkelijk in het laboratorium worden bewaard.
Het hier beschreven protocol demonstreert de werkzaamheid van de CRISPR/Cas9 t...

Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Twee lijnen van schip vis, Osteoglossiformes en Siluriformes, evolueerde electroreception parallel, en vijf lijnen van teleosts (Gymnotiformes, mormyrids, en de geslachten astroscopus, Malapterurus en Synodontis) evolueerde elektro genese parallel. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen1,2,3.
Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades, die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en4te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling1,5 ,6, systemen en circuits neurowetenschappen7,8,9,10, cellulaire fysiologie11,12, ecologie en energetica13 ,14,15,16,17, gedrag18,19en macro-evolutie3,20,21 .
Meer recentelijk is er een proliferatie van genomische, transcriptomische en proteomische middelen voor elektrische vissen1,22,23,24,25,26, 27,28. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten opgeleverd met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten1,2,3,28,29 ,30. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-tools31.
Een dergelijk hulpmiddel is de recent ontwikkelde geclusterd regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen gecombineerd met Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) techniek. Crispr/Cas9 is een genoom editing tool die wijdverbreid gebruik is ingevoerd in zowel model32,33,34 en niet-model organismen35,36,37 alike. CRISPR/Cas9 technologie heeft zich ontwikkeld tot een punt waar een laboratorium dat in staat is tot moleculaire biologie gemakkelijk genspecifieke sondes kan genereren, genaamd Short Guide RNAs (sgRNAs), tegen lage kosten met behulp van een niet-kloon methode38. Crispr heeft voordelen ten opzichte van andere knock-out/knockdown-strategieën, zoals morpholinos39,40, transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (Talens) en zink vinger nucleasen (zfns), die kostbaar zijn en tijdrovend om te genereren voor elk doel gen.
Het CRISPR/Cas9 systeem functioneert om genen knock-outs te maken door een specifieke regio van het genoom te targeten, geregisseerd door de sgRNA-reeks, en waardoor een dubbel-stranded pauze ontstaat. De dubbel-stranded breuk wordt gedetecteerd door de cel en activeert endogene DNA reparatie mechanismen bij voorkeur met behulp van de niet-Homologous end aansluiten (NHEJ) traject. Dit traject is zeer foutgevoelig: tijdens het herstelproces zal het DNA-molecuul vaak inserties of verwijderingen (indels) op de dubbel-streng break site opnemen. Deze indels kunnen resulteren in een verlies van functie door ofwel (1) verschuivingen in het open Lees frame, (2) inbrengen van een voortijdige stop codon, of (3) verschuivingen in de kritische primaire structuur van het genproduct. In dit Protocol maken we gebruik van CRISPR/Cas9 Editing om puntmutaties in doel genen te targeten met behulp van de NHEJ in zwak-elektrische vissoorten. Hoewel deze methode van mutagenese eenvoudiger en efficiënter is dan andere technieken, wordt naar verwachting een bereik van fenotypische ernstcategorieën in F0veroorzaakt, dat wordt toegeschreven aan genetisch mosaicisme41,42,43 ,44.
Selectie van organismen Met het oog op de vergemakkelijking van toekomstige studies naar de vergelijkende genomica van zwak-elektrische vissen, moest een representatieve soort voor zowel gymnotie-en mormyrids voor protocol ontwikkeling worden geselecteerd. Na besprekingen tijdens de 2016 elektrische vissen bijeenkomst in Montevideo, Uruguay, was er consensus in de Gemeenschap om soorten te gebruiken die al in het laboratorium konden worden gefokt en die genomische middelen beschikbaar hadden. De gymnotiform Brachyhypopomus gauderio en de mormyrid Brienomyrus Brachyistius werden geselecteerd als soorten die aan deze criteria voldoen. Bij beide soorten zijn natuurlijke aanwijzingen voor het opwekken en handhaven van fokomstandigheden gemakkelijk in gevangenschap te nabootsen. B. gauderio, een gymnotie soort uit Zuid-Amerika, heeft het voordeel van lage veehouderij eisen: vis kan worden gehouden op relatief hoge dichtheid in relatief kleine (4 L) tanks. B. gauderio heeft ook een snelle generatie omzet onder interne omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden kan B. gauderio in ongeveer 4 maanden van ei tot volwassen ontwikkelen.
B. Brachyistius, een soort van mormyrid vis uit West-Centraal Afrika, rassen gemakkelijk in gevangenschap. B. Brachyistius is direct beschikbaar via de aquarium handel, is op grote schaal gebruikt in vele studies, en heeft nu een aantal genomische middelen beschikbaar. Hun levenscyclus overspant 1 − 3 jaar, afhankelijk van de laboratoriumcondities. De behoeften van de veehouderij zijn iets intensiever voor deze soort, waarbij een matig grote tank (50 − 100 L) nodig is vanwege hun agressie tijdens de fokkerij.
Laboratoria die andere soorten elektrische vissen bestuderen, moeten dit protocol gemakkelijk kunnen aanpassen zolang de soorten kunnen worden gefokt, en eencellige embryo's kunnen worden verzameld en gekweekt in de volwassenheid. De tarieven voor huisvesting, larvale veehouderij en in-vitro fertilisatie (IVF) zullen waarschijnlijk veranderen met andere soorten; Dit protocol kan echter worden gebruikt als uitgangspunt voor fokpogingen in andere zwak-elektrische vissen.
Een ideale genen target voor proof of concept: scn4aa Zwak elektrische mormyrid en gymnotiform vis genereren elektrische velden (elektro genese) door het ontladen van een gespecialiseerd orgel, genaamd de elektrische orgel. Elektrische orgel lozingen (Eod's) resulteren uit de gelijktijdige productie van actie potentialen in de elektrische orgel cellen genaamd elektro cyten. Eod's worden gedetecteerd door een reeks electroreceptors in de huid om hoge-resolutie elektrische beelden van de omgeving van de vis te creëren45. Zwak elektrische vissen zijn ook in staat om kenmerken van hun condetails te detecteren ' EOD golfvormen18 en hun afvoer snelheden46, waardoor eod's aanvullend kunnen functioneren als een sociaal communicatiesignaal analoog aan Bird Song of kikker vocaliisaties47.
Een belangrijk onderdeel van de actie potentiële generatie in de elektro cyten van zowel mormyrid als gymnotiform zwak elektrische vissen is de spanning-gated natrium kanaal NaV 1.42. Niet-elektrische teleosts uitdrukken twee paralogous gen-kopieën, scn4aa en scn4ab, codering voor de voltage-gated natrium kanaal NAV 1.430. In zowel gymnotiform en mormyrid zwak elektrische vissen kilometerstanden, scn4aa geëvolueerd snel en ondergaan talrijke aminozuursubstituties die invloed hebben op de kinetische eigenschappen48. Het allerbelangrijkste is dat scn4aa in beide lijn lijnen is compartimenaliseerd tot het elektrische orgel2,3. De relatief beperkte uitdrukking van scn4aa aan het elektrische orgel, evenals zijn sleutelrol in de generatie van eod's, maakt het een ideaal doelwit voor crispr/Cas9 knock-out experimenten, omdat het minimale schadelijke pleiotrope effecten heeft. Omdat zwak elektrische vissen beginnen met het ontladen van hun larvale elektrische orgels 6 − 8 dagen na bevruchting (DPF), is targeting van scn4aa uitermate geschikt voor snelle fenotypen na embryo-micro injectie.

<table><tbody><tr><td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N3236L</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glas capillaire met filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td><td>(O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm lengte)</td></tr><tr><td>Cas9 proteïne met NLS; 1 mg/mL</td><td>PNA Biology</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood & Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-654</td><td>aangeduid als "precision glass syringe" in het protocol</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>aangeduid als "delicate task wipe" in het protocol</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcriptie Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>NEB</td><td>B7003S</td><td>gebruikt voor in vitro splitsingsassay</td></tr><tr><td>OneTaq DNA kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Syndel USA</td><td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td><td>aangeduid als "spawning agent" in het protocol</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>aangeduid als "thermoplastic" in het protocol</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>WPI</td><td>SU-P97</td><td>sutter merk</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Herbruikbare naald- vereist aanpassing</td><td>Fisher Scientific</td><td>7803-02</td><td>Pas aan op 0,7 inch lang; puntstijl 4 en hoek 25</td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td>Gebruik met de 10x NEB buffer die is inbegrepen</td></tr><tr><td>Teflon gecoate gereedschappen</td><td>bonefolder.com</td><td>T-SPATULA4PIECE</td><td>aangeduid als "polytetrafluoretheen" in het protocol</td></tr></tbody></table>

uitschakeling van de vonk: crispr/cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen. Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling, systemen en circuits neurowetenschappen, cellulaire fysiologie, ecologie, evolutionaire biologie, en gedrag. Meer recentelijk is er een wildgroei van genomische middelen voor elektrische vissen. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten vergemakkelijkt met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-instrumenten. We rapporteren hier een volledig protocol voor het uitvoeren van CRISPR/Cas9-mutagenese die gebruik maakt van endogene DNA-herstelmechanismen in zwak elektrische vissen. We tonen aan dat dit protocol even effectief is in zowel de mormyrid-soort Brienomyrus Brachyistius als de gymnotiform Brachyhypopomus GAUDERIO door crispr/Cas9 te gebruiken om indels en puntmutaties te richten in de eerste Exon van de natrium kanaal gen scn4aa. Met dit protocol werden embryo's van beide soorten verkregen en gegenotypeerd om te bevestigen dat de voorspelde mutaties in de eerste Exon van het natrium kanaal scn4aa aanwezig waren. Het knock-out succes fenotype werd bevestigd met opnames met verminderde elektrische orgel ontlading amplituden in vergelijking met ongeinjecteerde grootte-gematchte controles.

De doellocaties van sgRNA werden geïdentificeerd binnen Exon 1 van scn4aa in zowel b. gauderio als b. Brachyistius , zoals beschreven in punt 1. De Sgrna's werden gegenereerd zoals beschreven in paragraaf 2. Na succesvolle sgRNA selectie en synthese (Figuur 1) werd in vitro decolleté getest (Figuur 2). De sgRNAs die in vitro snijden demonstreerden werd vervolgens geselecteerd voor micro injecties met één cel.
<p class="jove_content...

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

CRISPR/Cas9 genbewerking bij zwak elektrische vissen, met name in een vergelijkende context, zal onderzoekers in staat stellen hypothesen te testen over hoe specifieke genen en genetische variantie bijdragen aan fenotypische variatie. CRISPR/Cas9 is een efficiënte methode voor het genereren van gemuteerde F-zero embryo's. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om CRISPR-Cas9 manipulaties uit te voeren in twee convergent ontwikkelde soorten van zwak elektrische vissen.De sleutel tot het gebruik van deze aanpak met een aantal wijzigingen in andere elektrische vissen of andere vissoorten is de beschikbaarheid van transcriptomische of genomische middelen om sgRNAs te maken. Het uitvoeren van de microinjecties en het visualiseren van de cellen op een 3D-locatie binnen een 2D-vlak kan moeilijk zijn. Verkrijg een kleine zebraviskolonie voor eieren om algemene microinjectietechnieken te oefenen.Het aantonen van de procedure met Savvas Constantinou zal Jared Thompson, een technicus van mijn laboratorium. Na het huisvesten van de vissoorten van belang onder de juiste broedomstandigheden, identificeren vrouwelijke vissen die lijken aangetrokken. In B.gauderio, zal het vrouwtje gezwollen ges

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes a gene knockdown technique using translational blocking morpholinos microinjected in the one-cell stage of the cavefish. Morpholinos are DNA oligonucleotides that bind to the complementary sequence of target mRNA and block its translation to a protein. Consequently, morpholinos are used as molecular tools to stop or reduce a gene’s expression transiently.

Morpholino Mediated Gene Editing: A Gene Knockdown Technique Using Translational Blocking Morpholino Oligonucleotides in Single-Celled Cavefish Eggs

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

-Gen-targeting mutagenese is nu mogelijk in een breed scala van organismen, waarbij genoom montagetechnieken. Hier tonen we een protocol voor gerichte gen mutagenese met behulp van transcriptie-activator, zoals effector nucleasen (Talens) in Astyanax mexicanus, een soort vis dat oppervlak vis en cavefish omvat.

Genome bewerken in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Met behulp van transcriptie Activator-achtige Effector Nucleases (Talens)

Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo's met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo's waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Hier beschrijven we een genoombewerkingstool op basis van de temporele en voorwaardelijke stabilisatie van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerd eiwit 9 (Cas9) onder het kleine molecuul, Shield-1. De methode kan worden gebruikt voor gekweekte cellen en diermodellen.

Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie

Dit protocol beschrijft een aanpak om nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisembryo's te vergemakkelijken met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een fenotyperingspijplijn wordt gepresenteerd om de toepasbaarheid van deze technieken aan te tonen om een long QT-syndroom-geassocieerde genvariant te modelleren.

CRISPR-Cas9-gemedieerde nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisharten

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Leer CRISPR/Cas9-genoombewerking in zwak elektrische vissen uit de families Gymnotiformes en Mormyridae. Dit protocol genereert mutanten voor onderzoek naar genfunctie en fenotypische variatie.

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Meer video's verkennen