Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Live celbeeldvorming maakt het mogelijk om dynamische cellulaire processen na verloop van tijd in één cel te observeren. Deze benaderingen zijn krachtig voor het beoordelen van de omstandigheden die van invloed zijn op het dynamische proces van celdeling en het onthullen van de effecten die defecten in mitose hebben op de proliferatie en levensvatbaarheid van dochtercellen. Fototoxiciteit die het gevolg is van blootstelling aan licht tijdens beeldvorming is een belangrijke uitdaging in verband met dit protocol.

Daarom moeten de belichtingstijden en het beeldinterval en -duur worden geoptimaliseerd. Met behulp van aseptische techniek en een bioveiligheid niveau twee veiligheidskast, gebruik maken van een steriel wegwerpglas Pasteur pipet om het medium aan te trekken uit de kweekplaat met de cellijn die de uitdrukking constructie van belang. Was de cellen kort met 10 milliliter steriele PBS met wervelende en behandel de cellen met twee milliliter van 0,05% trypsine.

Voeg na twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius acht milliliter vers medium aan de plaat toe om de reactie te stoppen en de losgemaakte cellen opnieuw op te zetten met zachte pipetting. Breng de celoplossing over naar een steriele buis van 15 milliliter en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspend de pellet in 10 milliliter PBS en centrifugeren de cellen opnieuw.

Resuspend de pellet in 10 milliliter medium voor het tellen en verdunnen van de cellen tot een een tot twee keer 10 tot de 5e cellen per milliliter van de celcultuur gemiddelde concentratie. Zaad vervolgens 500 microliter cellen in elke put van een steriele 12-well imaging bodemplaat en plaats de plaat in de celcultuur incubator om de cellen te houden aan het oppervlak van de plaat. Niet meer dan 30 minuten voor beeldvorming, voeg een relevante concentratie van een mitotische drug toe aan een of meer van de putten en voeg een gelijk volume van het remmerverwijding toe aan hetzelfde aantal putten als de controles.

Om de microscoop voor te bereiden op beeldvorming, plaats de plaat op het stadium van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge resolutie camera, een milieukamer voorverwarmd tot 37 graden Celsius en een leveringssysteem voor bevochtigde 5%kooldioxide. Selecteer een 20 keer luchtdoelstelling met een numeriek diafragma van 0,5 en uitgerust voor het contrastrijke fluorescentie- en fasecontrast, of heldere veldbeeldvorming en bekijk de cellen om de cursus aan te passen en focus te vinden om cellen in beeld te brengen. Als u de optimale belichtingstijden wilt instellen voor heldere veld-, GFP- en RFP-afbeeldingsverwerving, selecteert u de respectievelijke filterkubussen met de juiste excitatie en emissie voor de fluorofooren die worden afgebeeld en klikt u op Afspelen.

Als het signaal niet intensief genoeg is, past u de automatische belichting aan en selecteert u in elk fluorofofkanaal de juiste binning in het vervolgkeuzemenu Opmaak. Selecteer en kalibreer de microscoop fase aan de multi-well schotel volgens de instructies van de fabrikant en gebruik de beeldacquisitie software te markeren of anderszins selecteer de putten die zullen worden afgebeeld. Open het besturingselementpaneel gegenereerde punten en selecteer Onder Werkgebied Beperkt en Grens om het coördinatenselectiegebied te beperken om de grenzen van de put uit te sluiten.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu Gebiedsbeperking de optie Hele ruimte en selecteer een willekeurige puntplaatsing. Stel het aantal in op zes en klik op Randomize om het aantal en de verdeling van de punten te selecteren die per put moeten worden vastgelegd. Klik vervolgens op en voer de waarden in het controlepaneel van de tijdreeks in om het tijdsinterval en de duur voor het verzamelen van de afbeeldingen te selecteren en in te voeren.

Als u de RFP-H2B-gelabelde chromatine wilt visualiseren, selecteert u de afbeeldingen die zijn vastgelegd met de RFP-filterkubus op zijn plaats en identificeert u een cel die mitose invoert, zoals aangegeven door de initiële chromatineverdichting en kerncentpeverdeling om de mitotische timing van de metafase-uitlijning en het begin van de anafase in afzonderlijke cellen te bepalen. Volg de cel van belang door opeenvolgende tijdstippen in de verkregen film om het aantal tijdpunten of minuten te bepalen van mitotische invoer totdat RFP-H2B-gelabelde chromatine de uitlijning op de celevenaar tijdens de metafase voltooit. Om de mitotische timing, mitotische trouw, en cel lot te controleren, blijven de cel te volgen door middel van opeenvolgende tijdstippen om de tijd coördinaat waarop anafase chromosoom segregatie is duidelijk en / of wanneer chromatine decompaction en nucleaire envelop reformatie heeft plaatsgevonden te identificeren.

Visualiseer vervolgens RFP-H2B om cellen in elke populatie te identificeren die mitotische defecten vertonen, waaronder achterblijvende chromosomen en chromatinebruggen tijdens de scheiding van anafasechromosoom. Door het visualiseren van alpha tubulin-EGFP, kan worden opgemerkt dat cellen die zinsverdeling verstoring ervaring ondergaan dynamische veranderingen als spindel pull focus wordt bereikt en een bipolaire mitotische spindel wordt gevormd ter voorbereiding van celdeling. Gelijktijdig met spindelassemblage kan chromosoombeweging worden gevisualiseerd met RFP-H2B om de chromosoomuitlijning en segregatietrouw te beoordelen.

Met behulp van live celbeeldvorming benaderingen, deze representatieve resultaten tonen aan dat cellen met een normale centrosome inhoud in staat zijn om verder te gaan van nucleaire envelop afbraak door middel van metafase uitlijning en anafase begin om een bipolaire verdeling te bereiken in minder dan 30 minuten. In aanwezigheid van extra centrosomen is bijna 50% van de cellen in staat om een voorbijgaande multipolaire mitotische spindel te overwinnen en een bipolaire as te vormen in volledige celdeling. De resterende cellen zijn niet in staat om een bipolaire spindel te bereiken en als gevolg daarvan, exit mitose door middel van een multipolaire verdeling.

Ongeacht of spindelbipolaireiteit wordt bereikt, vertonen cellen met extra centrosomen een aanzienlijk verhoogde duur van mitose in vergelijking met cellen met twee centrosomen. Wat aangeeft dat de dynamiek van mitotische progressie kan worden gewijzigd, zelfs wanneer veranderingen in de mitotische uitkomst niet zichtbaar zijn. Bij het definiëren van belichtingstijden voor fluorescerende kanalen, optimaliseert u de belichtingstijden om de fototoxiciteit te beperken.

Ook camera pixel binning kan worden geselecteerd om lagere belichtingstijden te gebruiken. Deze procedure heeft toepassingen in farmacologische screenings, invasie, en migratie analyse. Deze benaderingen kunnen ook worden gebruikt om de werkzaamheid van medicamenteuze behandelingen of de dynamiek van cellulaire beweeglijkheid te onderzoeken.