Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

Als een neurocognitieve aandoening prevalentie voortdurend toeneemt, ons doel is te verkrijgen, karakteriseren en op te slaan kwaliteit hersenweefsel monsters om nauwkeurige diagnose te bereiken en licht werpen op de neurodegeneratieve mechanismen. Gezien de hersensymetrie, onze bemonstering methodologie maakt het mogelijk alle meta studies worden uitgevoerd op histologisch goed gedefinieerde weefsels van beide hemisferen en de vele gegevens kunnen worden verzameld en gecorreleerd door middel van deep learning. Additieve effecten op hersenbeschadiging door meerdere pathologieën worden vaak waargenomen.

De definitieve diagnose vereist het combineren van klinisch syndroom met de neuropathologische bevindingen om ziektepathogenese te ontdekken, en mogelijke therapieën. Verse snijprocedures en macrosectiebeheer zijn lastig, maar zijn ook essentieel om goede resultaten te behalen. Een getraind en hecht team is cruciaal om deze moeilijkheden te overwinnen.

Ons protocol bevat een reeks stappen die nodig zijn zoogdier behendigheid, dus visuele demonstratie kan nuttiger zijn dan beschrijvende teksten voor onderzoekers die deze technieken onder de knie willen krijgen. Na het bevestigen van thanatografie, gebruik een scherpe scalpel om een hoofdhuid incisie te maken door de haarhuid en onderhuids weefsel op de coronale plaat van het puntje van het mastoïde proces aan de ene kant naar de andere, het passeren van het hoekpunt. Scheid de twee plooien van de hoofdhuid voorzichtig van de schedel en zet de incisie voort totdat het gele super orbitale vet zichtbaar wordt.

Reflecteer de hoofdhuid anteriorly en trek de andere sectie van weefsel posteriorly. Met behulp van een scalpel en tangen, oogst een kleine steekproef van de temporele spier aan elke kant van de schedel, het plaatsen van een exemplaar in 4% formaldehyde en de andere monster op vier graden Celsius. Met behulp van een elektrische zaag sneed de schedel in een V-snede aan de frontale kant en verwijder de skullcap.

Na het snijden van de hersenvliezen, oogst een stuk dura voor fixatie en een ander voor het bevriezen. Steek een 20 meter 3,5 inch naald bevestigd aan een 10 milliliter spuit door het corpus callosum om de derde ventrikel te bereiken en trek de zuiger te verkrijgen ongeveer 10 milliliter cerebrale spinale vloeistof. Beoordeel de uiterlijke kleur en troebelheid van vloeistof en meet de pH.

Trek voorzichtig aan beide frontale kwabben om de hersenen op te heffen en snijd beide optische zenuwen infundibulum, de interne halsslagaders en de derde, vierde, vijfde en zesde schedelzenuwen. Snijd het tentorium om de achterste fossa te bereiken en snijd de wervelslagaders en de onderste schedelzenuwen. Steek vervolgens de scalpel zo diep mogelijk door de foramen magnum om het meest caudale gedeelte van de medula te snijden en de hele hersenen voorzichtig te verwijderen.

Gebruik de scalpel om lijkt op het bot over meckel's grot en het verzamelen van de Gasserian ganglion van elke kant voor fixatie en bevriezing. Gebruik een chirurgische hamer en beitel om de benige sella turcica te breken en verwijder de hypofyse voor fixatie in 4%formaldehyde. Inspecteer de schedel en de hele hersenen op macroscopische veranderingen en vasculaire veranderingen.

Gebruik een meetlint om de dwarse en voorste houdingsdiameters van de hersenen te meten en de hersenen op een schaal te wegen. Haal de cirkel van Willis zorgvuldig op voor macroscopische beoordeling op de aanwezigheid van anatomische varianten, laesies of vaatstenose. Scheid en inspecteer de cerebrum, cerebellum en hersenstam voordat u de weefsels individueel weegt.

Verwijder een tot twee, twee tot vier centimeter vierkante stukken leptomeninges uit de convexity en bewaar de monsters in volledige hoge glucose DMEM cultuur medium op vier graden Celsius. Oogst de pijnappelklier voor fixatie in 4% formaldehyde en verwijder de reukbollen en optische zenuwen voor de fixatie en bevriezing van een van elk paar. Plaats de cerebrum, cerebellum, en hersenstam op ijs op vier graden Celsius.

Wanneer alle weefsels van belang zijn geoogst gebruik maken van een super lijm lijm om het bot opnieuw vast te maken en gebruik maken van een chirurgische naald, en niet-absorbeerbare hechtingen terug te steken van de hoofdhuid. Voor hersenbank dissectie gebruik maken van een ontleden mes om de hersenstam axiaal snijden en maak de eerste snede op het niveau van de rostral midbrain door de superieure colliculus om twee plakjes te verkrijgen om de substantia nigra bloot te stellen. Snijd de hersenstam in 10, acht millimeter plakjes die ervoor zorgen om bezuinigingen die door de rostral pons in de buurt van de superieure marges van de vierde ventrikel om de locus caeruleus observeren en door de medulla oblongata inferieur aan de akoestische stria, net boven de inferieure top van de vierde ventrikel om plakjes met inbegrip van de dorsale motor kern van de vagus te verkrijgen.

Label alle plakjes op een rostral caudal manier als BS voor hersenstam gevolgd door Arabische cijfers. Gebruik na de laatste hersenstamsectie de aanduiding SC voor ruggenmerg, gevolgd door Arabische cijfers. Snijd het cerebellum op het sagittale vlak om de twee cerebellar hemisferen te scheiden op het niveau van de vermis en voer sagittale sectioning uit om vijf plakjes van elke hemisfeer te verkrijgen.

Noem alle segmenten van de vermis als CBR of CBL voor respectievelijk rechts en links en gebruik Arabische cijfers om elke sectie te identificeren. Vervolgens scheiden de twee hemisferen van de cerebrum door het corpus callosum op het sagittale vlak voor het snijden van de hemisfeer als enkelvoud langs de coronale vliegtuig passeren tussen de optische chiasm en de mammillaire lichamen door de frontale kwab temporale pool, voorste cingulate, voorste commissure, kern van mineur, en basale ganglia. Maak een tweede snede ongeveer een centimeter achterste zeggen door de mammillaire lichamen en bloot de basale ganglia, voorste thalamus sub thalamus, en amygdala.

Blijf snijden om de voorste en achterste regio's te ontleden tot 15 tot 21 centimeter plakjes zijn verkregen voor elke hemisfeer. Plaats het segment is op een vlakke ondergrond als ze worden bereikt na hun oorspronkelijke positie in de voorste achterste richting van de frontale naar de occipitale paal, met het gedeelte continu met de vorige dia's naar boven gericht. Wanneer alle segmenten zijn geplaatst selecteert u de belangrijkste secties die moeten worden vastgesteld voor histopathologie, met inbegrip van de eerder verworven secties en de hippocampal, pariëtale en occipital secties, en label de plakjes als L of R, gevolgd door Arabische cijfers met inbegrip van een etiket met vermelding van de vraag of het segment moet worden vastgesteld of bevroren.

Wanneer alle weefsels zijn gesectied en gelabeld, krijgt u een afbeelding voor elke reeks secties vóór de fixatie of bevriezing ervan. Om de monsters te bevriezen plaats de gereserveerde alternatieve weefselsecties op een voorgevro bevroren aluminium lade en bedek de secties met een in elkaar grijpende aluminium plaat om ze plat te houden. Bevries vervolgens de plakjes vloeibare stikstof gedurende drie minuten voordat u de bevroren monsters in een plastic zak met bijbehorende identificatiecodes en plaknummers voor een opslag in de juiste cryogene doos bij 80 graden Celsius plaatst.

Om de monsters vast te stellen plaats de gereserveerde alternatieve weefselsecties in afzonderlijke stukken gaas en plaats de plakjes in 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing voor vijf dagen in een vier graden Celsius koude ruimte. 24 van de 27 geoogste hersenen kregen de volledige neuropathologische karakterisering met een duidelijke klinische pathologische diagnose. Voorlopige kwantitatieve elektro-encefalogram analyse van een reeks van 36 hersenen donoren geeft aan dat de belangrijkste alfaritme percentage is aanzienlijk lager in grote neurocognitieve aandoeningen dan bij normale ouderen milde neurocognitieve stoornis.

Hier wordt een voorbeeld van een asymmetrische pathologie getoond met een rechteratrofie duidelijke macroscopisch met de ernstige ventriculaire dilataties waargenomen in de rechter coronale sectie in vergelijking met de linker. Een ander geval toont een infarct van de rechterhersenhelft, terwijl een ander exemplaar een duidelijke atrofie van het rechter mammillaire lichaam vertoont. Macrosecties kunnen worden gekleurd om myelineverlies of de verdeling van immunoreactiviteit binnen hemisferen te identificeren.

Deze monsters zijn van tweelingen die een klinisch begin van de ziekte van Alzheimer had in verschillende termijnen als gevolg van epigenetische en omgevingsfactoren. Niettemin, de microscopische analyse bleek een zeer vergelijkbaar neuropathologisch beeld wat wijst op een hoge ziekte van Alzheimer pathologie en amyloïde angiopathie. Bij deze twee patiënten kwam dezelfde klinische diagnose van de ziekte van Alzheimer echter niet precies overeen met de neuropathologische kenmerken, die een dementieduo in meerdere etiologieën aan het licht brachten.

Inderdaad, het eerste geval gepresenteerd Lewy lichamen in de gyrus enkele leugen en substantia nigra. En het tweede geval toonde Lewy lichamen geassocieerd met Lewy neurites in de amygdala en in minderjarigen kern. De foto van de plakjes is zorgvuldig voor een nauwkeurige identificatie van de anatomische gebieden tijdens de microscopische analyse.

De fixatie en bevriezing van singles plakjes zijn ook belangrijk voor het behoud van de weefselmicrostructuur Omics de topografie van genactivatie en eiwitdistributie en correleren deze gegevens met de histopathologie. Celculturen uit goed gekarakteriseerde weefsels, ook een onderzoek naar ziektepathogenese. Draag altijd voldoende persoonlijke beschermingsmiddelen als een verworven hersenweefsel wordt beschouwd als potentieel besmettelijk en omdat het gebruik van gevaarlijke instrumenten zoals scherpe instrumenten en vloeibare stikstof nodig is.