Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

Cochleaire oppervlaktepreparaten maken visualisatie van de gehele lens van het orgaan van Corti mogelijk met behulp van immunohistochemie en confocale beeldvorming. Het is in grote lijnen gebruikt voor onderzoek naar specifieke cochleaire pathologieën van belang. We zullen de cochleaire microdissectionmethode aanpassen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de aanhankelijkheid van een stuk cochleair epitheel tot 10 millimeter ronde covers voor de immunolabeling procedure, terwijl het vermijden van weefselverlies tijdens de meerdere wasstappen. Daarnaast kunnen cochleaire pathologieën, cochleaire oppervlaktevoorbereiding, ook worden gebruikt voor de beoordelingsexpressie en haarcelregeneratie. Basismicroscoop vaardigheden zijn nodig voor deze techniek en visuele demonstratie van de methode kan helpen om ervoor te zorgen dat elke stap correct wordt uitgevoerd.

Het aantonen van de procedure zal Qiaojun Fang zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Voor temporele botextractie, onmiddellijk post-mortem trek de huid anteriorly om het schedelbot bloot te stellen en gebruik schaar om het bot te snijden van het achterste aspect naar voren langs de middellijn van de schedel. Gebruik tangen om het hersenweefsel te verwijderen voordat u de duim en wijsvinger gebruikt om de temporele botten van muizen van drie maanden of ouder handmatig te verwijderen.

Plaats de botten in een petrischaal met een diameter van 30 millimeter met verse ijskoude 4%PFA en PBS onder een dissectiemicroscoop en verwijder de stapes uit het ovale venster. Prik het ronde raammembraan met nummer vijf tangen en gebruik een 27-meter naald aan een spuit van één milliliter met verse 4%PFA om een klein gaatje in de top van het slakkenvlies te maken. Doorsnee het slakkenvlies voorzichtig en langzaam met een fixatieve oplossing via de ronde en ovale ramen totdat de oplossing uit het kleine gaatje aan de top is gewasserd.

Breng vervolgens maximaal twee geperfundeerde slakkenhuis over in individuele 20 milliliter scintillatiefolie met 10 milliliter van 4%PFA per flacon en roer de monsters voorzichtig gedurende twee uur bij kamertemperatuur, gevolgd door 's nachts opslag bij vier graden Celsius op een rotator. De volgende ochtend was je het slakkenkastje met drie wasbeurten van vijf minuten met verse PBS per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt 20 milliliter van 4%EDTA toe aan elke flacon en draai de monsters 48 uur bij vier graden Celsius met zachte agitatie.

Raak aan het einde van de incubatie het benige vestibulaire gedeelte van elk slakkenkeltje aan met tangen om de elasticiteit van de monsters te beoordelen. Als de botten elastisch zijn in plaats van stevig, is het slakkenbeen ontkalkt. Vervang de EDTA voor elk monster door verse PBS.

Voor microdissection van het cochleaire epitheel, pak het vestibulaire gedeelte van het temporele bot met tangen en gebruik een scalpel om de apicale draai in een hoek van 45 graden te snijden. Snijd verticaal langs de zwakke lijn tussen het ronde raam en het ovale venster om het slakkenvlies te scheiden van het vestibulaire gedeelte en oriënteer het cochleair gedeelte met de basale draai naar de bodem en het midden draait naar de bovenkant van de petrischaal. Snijd vanuit deze positie de benige capsule en de zijwand van de middenboel naar het einde van waaruit de apicale sectie werd verwijderd en blijf snijden om het middelste gedeelte volledig te scheiden van de basale en haakgebieden.

Het plaatsen van de basale en haak gedeelte met de basilaire membraan site gericht op de bodem van de schotel, verticaal snijd de medialis af van de haak regio om de medialis te verwijderen en snijd de basale en haak regio's om de haak gedeelte te scheiden. Om vervorming van het weefsel te voorkomen, snijd de medialis af van het haakgebied voor de scheiding van de basale draai en haak regio. Snijd de relatief grote delen van benige capsule en laterale wandweefsel van de middelste draai en het houden van de laterale muur met tangen om de benige capsule en laterale wand uit te lijnen met de onderkant van de petrischaal, snijd deze weefsels van de basilaire membraan kant.

Vervolgens plat het monster te oriënteren van de zintuiglijke haarcel oppervlak kant omhoog en trim weg de rest van de benige capsule en laterale muur. Gebruik vervolgens tangen om het tectorialmembraan te verwijderen om het middelste gebied volledig te scheiden en de benige capsule, lateraal wandweefsel en tectoriale gebieden van de resterende bochten te verwijderen, zoals zojuist is aangetoond. Wanneer alle cochleaire bochten zijn ontleed, verspreid 0,5 microliter cel- en weefselkleven op het midden van een ronde 10 millimeter coverslip en laat de lijm drie tot vijf minuten drogen bij kamertemperatuur.

Plaats de gedroogde coverslips in de petrischaal en plak alle vier de stukken van elk zintuiglijk epitheelmonster op één coverslip. Gebruik vervolgens tangen om één rand van elke coverslip te grijpen om de exemplaren over te brengen in individuele putten van een celkweekschotel met vier putten voor immunotikken. Voor immunotikettering van oppervlaktecochleaire synapspreparaten wast u elk zintuiglijk epitheel drie maal gedurende vijf minuten in verse PBS per wasbeurt, gevolgd door de behandeling van elk monster met twee milliliter van 2%niet-ionische oppervlakteactieve stoffen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.

Aan het einde van de incubatie, aspiraat de oppervlakteactieve oplossing van elke put en blok elke niet-specifieke binding met 100 microliter van het blokkeren oplossing per goed gedurende een uur op de rotator met zachte agitatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de blokkerende incubatie, was de monsters drie keer met PBS zoals aangetoond onder zachte agitatie voordat het etiketteren van elk epitheel met 100 microliters van de primaire antilichamen van belang gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende dag, was de monsters drie keer met verse PBS en zachte agitatie per was en etiket de monsters met 100 microliter van de juiste secundaire antilichamen van belang voor twee uur op 37 graden Celsius beschermd tegen licht.

Aan het einde van de incubatie, was de monsters met drie vijf minuten wasbeurten in verse PBS per wasbeurt voordat u elke coverslip op individuele glazen microscoop dia's met de monsters naar boven. Voeg vervolgens zorgvuldig acht microliters van een geschikt montagemedium toe in het midden van elke coverslip en gebruik tangen om nog eens 10 millimeter coverslip op elk monster te monteren. Sluit vervolgens de zijkanten van elke coverslip sandwich met duidelijke nagellak, plaats de monsters in een kartonnen dia map, en bewaar de dia's op vier graden Celsius.

Hoewel de dissectie van volwassen muisbrochleer voor oppervlaktepreparaten niet eenvoudig is, zouden onderzoekers die nieuw zijn bij de techniek de methode moeten kunnen leren na het oefenen met 10 tot 15 oren. Immunolabeling van oppervlaktepreparaten van onbehandelde 10 tot 12 weken oude CBAJ-muizen met CTBP2 en GluA2 toont aan dat respectievelijk presynaptische linten en postsynaptische terminals zich onder de binnenhaarcelkernen bevinden en naast elkaar staan met functionele synapsen aan. Immunolabeling voor myosine 7A en contrastaining met falloidin en DAPI onthult de aanwezigheid van sensorische haarcellen, waaronder de buitenste haarcellen en binnenhaarcellen en hun kernen.

Immunolabeling voor myosine 7A en contrastaining met falloidine toont geen verschillen in immunoreactiviteit of uniformiteit met of zonder het gebruik van cel- en weefselkleef. Bovendien tonen scanning elektronenmicroscopie van oppervlaktepreparaten van onbehandelde zes- tot acht weken oude C57-zwarte 6-muizen een goed georganiseerde V-vormige stereocilia van buitenste haarcellen in drie rijen van het monster. Vergeet niet om het cochleair te vullen met fixatieve oplossing voorzichtig en langzaam door de ronde en ovale ramen totdat de oplossing wast uit het kleine gaatje aan de top.

Voordat u het haakgebied scheidt van de basale draai, moet u de medialis van het haakgebied afsnijden om de verwijdering van de medialis te vergemakkelijken.