Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Goed gedifferentieerde SBNET cellen zijn langzaam groeiende en moeilijk te verspreiden. De weinige gevestigde cellijnen zijn niet direct beschikbaar voor onderzoekers. Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we dit 3D-cultuurprotocol.

Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de traditionele methode van het opzetten van een SBNET-cellijn is dat 3D-culturen kunnen worden verkregen en dat drugstesten binnen drie weken kunnen worden uitgevoerd. Deze methode kan worden toegepast op andere neuro-endocriene tumoren, zoals neuro-endocriene tumoren uit de alvleesklier. Na het verkrijgen van een resected patiënt SBNET monster, snijd het in vijf millimeter kubussen en bewaar het in 25 milliliter van DMEM F12 medium in een conische buis voor transport.

Broed de tumoren in wasmiddel bereid volgens manuscript richtingen gedurende 15 minuten. Breng ze vervolgens over naar een nieuwe schotel en maak ze gehakt tot minder dan een millimeter stukken met behulp van steriele gebogen schaar. Breng de gehakte weefsels in een nieuwe buis van 50 milliliter met 25 milliliter wasmiddel en centrifugeer het monster vervolgens 15 minuten bij vier graden Celsius op 500 g.

Gooi de supernatant weg en verhoog de pellets in 10 milliliter wasmedium met collagenase en DNase. Laat de gehakte tumoren te verteren op 37 graden Celsius met langzaam schudden gedurende 90 minuten. Het is belangrijk om de tumormonsters niet te verteren.

Te veel enzym of langere incubatietijd zal SBNET cellen doden. Nadat de spijsvertering is voltooid, centrifugeren de buis op 500 keer g gedurende 15 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in 15 milliliter wasmedium.

Plaats een 70 micrometer celzeef op een nieuwe 50 milliliter buis en breng 10 milliliter van de wasbuffer door de zeef. Draai de wasbuffer in de buis om te voorkomen dat de cellen aan de zijkanten blijven plakken. Vervolgens filter de celopening door de zeef.

Centrifugeren de cellen op 500 keer g gedurende 15 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in 200 microliter wasmedium. Plaats de buis op ijs en gebruik vijf microliter van de cellen voor het tellen van cellen met een hemocytometer.

Bereken het aantal cellen, herhaal vervolgens de centrifugatie om de supernatant te verwijderen en de cellen in vloeibare ECM opnieuw op te hoogten bij een concentratie van één miljoen cellen per milliliter. Breng vervolgens vijf tot 20 microliter SBNET-sferoïden in ECM over naar een 96-putplaat en plaats de plaat in een 37 graden Celsius-incubator om de vloeibare ECM te laten stollen. Voeg 200 microliters van SBNET cultuurmedium toe aan elke put met sferoïden of cultuur van de organoïden in stamcelmedia zoals eerder beschreven.

Gebruik een P1000 pipet om de organoïden over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter en de buis 1, 500 keer g gedurende een minuut te centrifugeren om de supernatant te verwijderen. Was de cultuur met een milliliter PBS en centrifuge opnieuw om de supernatant te verwijderen. Bevestig vervolgens de organoïden door 500 microliters paraformaldehyde toe te voegen en ze gedurende 15 minuten uit te broeden.

Na de incubatie, was de cultuur twee keer met een milliliter PBS. Voeg 500 microliter PBS toe met 3%BSA en 0,1%Triton X-100 om de cultuur te doordrenteren. Incubeer de buis gedurende vijf minuten en was de organoïden vervolgens drie keer met één milliliter PBS en 3%BSA.

Vervolgens, incubeer de cultuur met primaire antilichamen voor een uur dan herhaal de wasbeurten met PBS en BSA. Incubeer met de secundaire antilichamen en herhaal de wasbeurten om ervoor te zorgen dat alle supernatant aanzuigen en weggooien. Om de sferoïden in beeld te brengen, voeg je vijf microliters van montagemedium toe dat DAPI bevat en gebruik je een P20 pipet om vijf microliter van de sferoïden over te brengen naar een glazen glijbaan.

Verzegel de dia met een coverslip en afbeelding met een fluorescentiemicroscoop met behulp van de 10, 20 en 40X doelstellingen. Breek de ECM mechanisch met een P1000 pipet en breng deze over naar een steriele buis van 1,5 milliliter. Centrifuge de buis op 1.000 keer g bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens alle supernatant en plaats de buis op ijs. Voeg twee tot vier keer het volume van de nieuwe ECM aan de pellet en meng de inhoud van de buis door pipetten op en neer 10 keer om ervoor te zorgen dat de invoering van luchtbellen te voorkomen. Breng vijf tot 20 microliter van het ECM- en SBNET-mengsel over op een nieuwe 96-putplaat en laat de ECM stollen.

Bedek vervolgens de gestolde ECM met nieuw SBNET-medium en leg de plaat in de couveuse. Als sbnet-sferoïden naar een ander lab worden verzonden, brengt u de sferoïden met de nieuwe ECM over naar een T25-kolf en laat u de ECM stollen. Vul de kolf met SBNET sferoïde medium, schroef de dop stevig vast en bereid het verzendpakket voor.

Bij ontvangst van de sferoïde cultuur, verwijder de cultuur medium en herhaal de vorige stappen om de sferoïden terug in de cultuur. SBNET sferoïde groeisnelheid werd gemonitord met microscopische beeldvorming. Het duurt ongeveer 14 dagen voor SBNET sferoïden te verdubbelen in omvang wanneer de cultuur media wordt veranderd een keer per week.

Na 14 dagen in cultuur, SBNET sferoïden niet in omvang toenemen. De sferoïden waren bevlekt met antilichamen die specifiek zijn tegen synaptophysine, chromogranine A en SSTR2 en werden afgebeeld met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. De gegevens toonden aan dat deze markers zijn gelokaliseerd in het cytoplasma en op het membraan van SBNET cellen.

Om de specificiteit van de antilichamen te waarborgen, werden dezelfde kleuringsprocedures uitgevoerd op een organoïde lijn van een alvleeskliertumor die geen synaptophysine, chromogranine A en SSTR2 uitdrukt en er geen groen signaal werd gedetecteerd. Het belangrijkste voordeel van immunofluorescentie beeldvorming is dat het binnen vier uur kan worden uitgevoerd en vergelijkbare kleuringsinformatie kan geven als de immunohistochemie. Culturing SBNET als sferoïden is een waardevolle techniek voor het identificeren van geneesmiddelen die SBNET groei kunnen remmen.

De sferoïden werden behandeld met rapamycine en mTOR-remmer. Na vijf dagen vormde de met rapamycine behandelde sferoïde een druifachtige structuur en werd apoptotisch of necrotisch. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de celzeef en opvangbuis met wasmedium voor nat te maken.

Dit voorkomt dat SBNET-cellen zich aan de celzeef en de plastic buis kleven. Met dit protocol, wetenschappers en clinici kunnen vestigen SBNET sferoïde culturen van gereseceerde tumoren, delen ze met andere laboratoria, en gebruik ze voor het testen van FDA goedgekeurde geneesmiddelen.