Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

We hebben een montagemethode ontwikkeld voor time-lapse beeldvorming die onbeperkte groei van fragiele zebravisembryo's mogelijk maakt en tegelijkertijd in een volledig vaste positie houdt. Deze montagemethode is snel, eenvoudig en goedkoop en werkt voor lab imaging op elke omgekeerde microscoop. We ontwikkelden deze methode voor beeldvorming van levende zebravisembryo's, maar het kan worden aangepast voor beeldvorming van andere kleine aquatische diermodellen.

Begin met het fokken van de volwassen zebravis. Plaats 's middags de vis in kweektanks bij een man-op-vrouw verhouding van één-op-twee. Bereid vervolgens een voorraadoplossing van 1% laag smelt in embryomedia en los deze op door het te verwarmen in een magnetron.

Aliquot de agarose oplossing in 1,5 milliliter buizen. Maak een voorraad oplossing van 4%tricaine in gedestilleerd water en bewaar de agarose en tricaine op vier graden Celsius. Tricaïne is giftig en moet worden gewogen en bereid in een rookkap.

Na de paring, oogst de zebravis embryo's in E3 in een petrischaaltje en broed ze op 26,5 graden Celsius gedurende ongeveer 28 uur voor de montage. Verdoven de embryo's met 0,02%tricaine en dechorionate ze onder een microscoop door zachtjes aangrijpen en trekken van de chorion uit elkaar om het embryo vrij te geven. Net voor montage verwarm je de agarose-oplossing tot 65 graden Celsius en laat het afkoelen tot ongeveer 30 graden Celsius, zodat het embryo niet wordt beschadigd door de hitte en tricaïne toe te voegen aan de agarose-oplossing.

Gebruik 35 millimeter glazen bodemschotels met een nummer nul coverglass bodem. Plaats voorzichtig een gedechorioneerde embryo met een van de zijkanten naar de onderkant van de schotel met een glazen pipet of een micropipet, verwijder dan voorzichtig de resterende E3 met een micropipet. Voeg de eerste agarose oplossing aan de kleine goed gemaakt door de coverglass bevestigd aan de onderkant van de schotel om het embryo te dekken ervoor te zorgen dat de agarose de kleine put bedekt, maar niet overloopt.

Bedek de kleine put met een coverglass om een smalle agarose gevulde ruimte met het embryo tussen de twee coverglasses te creëren. Plaats een laag van 1%agarose oplossing op de top van de coverglass over de bodem van de schotel die de coverglass op zijn plaats zal houden als het stolt. Vul vervolgens het resterende gedeelte van de schotel met E3 met 0,02% tricaine om het systeem gehydrateerd te houden.

Om de optimale agaroseconcentratie voor laag één te identificeren, monteer je de embryo's in toenemende concentraties van agarose en voer time-lapse beeldvorming uit om de concentratie te identificeren die embryovervorming en beweeglijkheid minimaliseert, test dan een fijner concentratiebereik op basis van de resultaten. De meest kritieke stap van dit protocol is het identificeren van de optimale concentratie van agarose voor laag één. Test verschillende nanoconcentraties van agarose zoals 0,030%0,032%, enz.

om de optimale concentratie te vinden. Gebruik een microscoopstadium met een couveuse van 28,5 graden Celsius en beeld voor maximaal 55 uur om timelape-beeldvorming van de embryo's uit te voeren. Om tegelijkertijd verschillende embryo's in beeld te brengen, gebruikt u een podiumadapter die meerdere gerechten bevat en draai de gerechten één voor één zodat de embryo's horizontaal worden geplaatst.

Selecteer een lage vergrotingsdoelstelling, lokaliseer vervolgens de embryo's met behulp van het oculair en lijn ze uiteindelijk horizontaal uit door de gerechten te draaien. Nota van de locatie van de embryo's in de software en maak een bestandsnaam voor het automatisch afvleven van de gegevens. Stel de pinholegrootte, scansnelheid, afbeeldingsgrootte en zoom in.

Selecteer vervolgens een hogere vergroting voor het vastleggen van beelden en de fluorescentiekanalen die moeten worden weergegeven. Pas voor elk kanaal het laservermogen en de hoogspanning van de detector aan om het best mogelijke dynamische bereik te verzamelen, terwijl verzadiging wordt vermeden en het bleken van foto's wordt beperkt. Vervolgens, om het hele embryo met een 10X-doelstelling in beeld te geven, stel de grote instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen in de software in om verschillende gezichtsvelden in beeld te krijgen en ze samen te naaien en de positie van het embryo aan te passen om er zeker van te zijn dat het binnen dit grote beeldgebied past.

Configureer de instellingen voor het vastleggen van Z-stacks op basis van de routebeschrijving van het manuscript. Om de focus van meerdere embryo's te behouden tijdens lange termijn time-lapse imaging, gebruik maken van een geautomatiseerde focus en aanpassen van de individuele offset niveaus voor elk embryo om zich te concentreren op het referentievlak. Stel vervolgens time-lapse parameters in de microscoopsoftware in op beeld voor een duur van 55 uur met intervallen van een uur.

Leg bij elke cyclus twee embryodatasets achtereenvolgens vast en sla gegevens automatisch op. Gebruik de microscoopsoftware om de beelden te verwerken. Als er meer dan één embryo is afgebeeld, maakt u onafhankelijke bestanden voor elk embryo door de gegevenssets te splitsen op basis van de locatie van de beeldvorming.

Converteer de 3D-tijdgegevenssets in 2D-tijdgegevenssets met behulp van projecties met maximale intensiteit of een vergelijkbaar gereedschap. Maak ten slotte filmbestanden door op te slaan als AVI en de optie geen compressie te selecteren met intervallen van 200 milliseconden voor een afspeelsnelheid van vijf frames per seconde. Deze gelaagde montagemethode maakt het mogelijk om zebravisembryo's in beeld te brengen terwijl ze kunnen groeien, maar tegelijkertijd hun beweging beperken.

Als de agaroseconcentratie te hoog is, worden de embryo's vervormd. Maar als het te laag is, zullen ze uit het gezichtsveld tijdens time-lapse microscopie. De optimale agaroseconcentratie bleek tussen 0,028 en 0,034% te liggen Levende transgene zebravissen die RFP uitdrukken in het gehele embryo en GFP in de endotheelcellen van de vasculatuur gedurende 55 uur werden afgebeeld waarin het intersegementale vat ontkiemde, sub-darm- en hoofdvaatculatuur ontwikkelde, en caudale adervlechtenamencondensatie met de romp van de verlengde romp plaatsvonden.

Embryo's die GFP en motorneuronen uitdrukken werden afgebeeld om de ontwikkeling van motorneuronen te visualiseren. De motorneuron axonen ontspruiten uit de ventrale neurale buis over de somites naar de ventrale kant van het embryo. De co-ontwikkeling van de dorsale ontkieking van motorneuron axonen in relatie tot de positie van intersegmentale vaten werd afgebeeld met behulp van een hogere vergroting.

Dit maakte het mogelijk om de fijnere details van ventrale axon ontkiemen evenals dorsale axon ontspruiten uit de neurale buis te visualiseren. Naarmate de somietaantallen toenam, breiden de somites zich ook in lengte en breedte uit. Dit proces werd afgebeeld met behulp van transgene embryo's uitdrukken GFP in de spieren.

Omdat de optimale concentratie van agarose zeer smal is, is het zeer gevoelig voor kleine variaties in metingen bij het voorbereiden van de voorraadoplossing van agarose en moet deze opnieuw worden gedefinieerd voor elke nieuwe batch agarose-oplossing. Het is belangrijk om de beeldvormingsparameters zorgvuldig in te stellen, waaronder beeldgrootte en resolutie, scansnelheid, zoom, detectorhoogspanning en laservermogen om consistentie tussen experimenten te garanderen en ook om de mogelijkheid van fototoxiciteit en fotobleken tijdens lange termijn time-lapse imaging te verminderen. Met behulp van deze montagemethode voor transgene zebravisembryo's, gevolgd door uitgebreide time-lapse beeldvorming van het hele organisme, kunnen we visualiseren hoe verschillende weefsels zich samen ontwikkelen.