Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Celvrije eiwitsynthese is een opkomende technologie in systemen en synthetische biologie voor de in vitro productie van eiwitten. Celvrije eiwitsynthesesystemen hebben geen celwand, dus we hebben directe toegang tot metabolieten. In dit protocol kwantificeren we de absolute metingen van 40 metabolieten die betrokken zijn bij het centrale koolstof- en energiemetabolisme, waardoor we het celvrije metabolisme kunnen karakteriseren.

Het protocol is gebaseerd op het uitzaaien van de verbindingen met aniline, die zorgt voor een betere scheiding en een hogere massa spectrometrie resolutie. Daarnaast gebruiken we interne standaarden met een isotopen die we aniline labelen, voor absolute kwantificering van de metabolieten. De getagde metabolieten coelute, die de effecten van ijzeronderdrukking elimineert.

Rekening laten met de nauwkeurige kwantificering van de verbindingen. Werken in een kap, combineren 550 microliter van de aniline, met 337,5 microliter van LC-MS grade water. En 112,5 microliter van 12 molair zoutzuur in een centrifugebuis.

Vortex goed, en bewaar de zes kies aniline oplossing op pH 4,5 en vier graden Celsius. Voor de bereiding van een zes molaire koolstof-13 aniline oplossing, bij pH 4.5, combineren 250 milligram koolstof-13 aniline met 132 microliter water, en 44 microliter van 12 molaire zoutzuur. Vortex goed, en bewaar op vier graden Celsius.

Om 200 milligram per milliliter EDC-oplossing voor te bereiden, los twee milligram EDC op in 10 microliter water voor elk te labelen monster. En vortex goed. Om monsters voor te bereiden, de eiwitten te doven en neerslaan in een celvrije eiwitsynthesereactie, door een gelijk volume ijskoude 100% ethanol toe te voegen aan de celvrije synthesereactie.

Centrifugeren het monster op 12.000 keer g, gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant van het monster over naar een nieuwe centrifugebuis. Als u het monster wilt labelen met koolstof-12-aniline-oplossing, brengt u zes microliter van het monster over in een nieuwe centrifugebuis en brengt u het volume op 50 microliter met water.

Voeg 5 microliter van 200 milligram per milliliter EDC-oplossing toe, meng de koolstof-12 aniline-oplossing goed en breng 5 microliter in de buis. Vortex de reactie met zachte schudden voor twee uur bij kamertemperatuur. Na twee uur, verwijder de buizen uit de shaker en breng ze in een rookkap.

Voeg 1,5 microliter triethylamine toe aan elke reactie om de aniline tagging reactie te stoppen en de verbindingen te stabiliseren. Centrifuge op 13, 500 keer g gedurende drie minuten. En red de supernatant.

Om de interne normen te labelen met koolstof-13 aniline-oplossing, verdun de interne voorraadoplossing tot 80 micromolar met een eindvolume van 50 microliter. Voeg vijf microliter van de 200 milligram per milliliter EDC-oplossing, en vijf microliters van de goed gemengde koolstof-13 aniline oplossing. Vortex de reactie met zachte schudden voor twee uur bij kamertemperatuur.

Na twee uur, verwijder de buizen uit de shaker, en voeg 1,5 microliter triethylamine aan de reactie in een rookkap. Centrifuge op 13, 500 keer g gedurende drie minuten en sla de supernatant. Om de gelabelde interne standaard en het getagde monster te goddelijk, meng je 25 microliters van elk in een autosampler flacon.

En analyseren door de LC-MS procedure. Vervolgens, om een standaardcurve voor niet-getagged metabolieten te maken, verdun eerst de voorraadoplossing van niet-getagged metabolieten tot verschillende concentraties, met een volume van 50 microliter. Voeg vijf microliter van de 200 milligram per milliliter EDC-oplossing, en vijf microliters van koolstof-12 aniline oplossing aan elke concentratie.

Vortex de reactie met zachte schudden voor twee uur bij kamertemperatuur. En ga verder met de triethylamine behandeling. En centrifugalisatie voordat het wordt geanalyseerd door de LC-MS zoals voorheen.

Na het initialiseren van LC-MS, volgens de instructies van de fabrikant, injecteren vijf microliter van het monster in de kolom. En het verwerven van de juiste m over z ion intensiteiten voor de koolstof-12 aniline gelabeld monster. Injecteer vervolgens opnieuw vijf microliter van hetzelfde monster.

En het verwerven van de m over z ion intensiteiten voor de carbon-13 aniline gelabelde normen. In dit protocol werden metabolieten die groene fluorescerende eiwitten uitdrukken in een celvrije eiwitsynthese op basis van E.coli gekwantificeerd. 40 metabolieten die betrokken zijn bij het centrale koolstof- en energiemetabolisme, werden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van interne normen.

Terwijl een standaardcurve voor vijf van de metabolieten die niet werden gelabeld met aniline werd ook ontwikkeld. De diverse metabolieten die betrokken zijn bij deze trajecten waren een klasse van fosforyleerde suikers, fosfor-carboxylzuren, carboxylzuren, nucleotiden, en co-factoren. Bovendien maakte de methode de scheiding van structurele isomerparen mogelijk, zoals glucose-zes fosfaat, en fructose-zes fosfaat in één LC-MS-run.

De belangrijkste stap is het labelen van de gedeïtiediseerde monster met aniline. Aangezien de aniline-oplossing scheidt, is het belangrijk om snel en effectief te werken, met behoud van goede veiligheidspraktijken. Deze methode helpt om cel-vrij metabolisme te karakteriseren met de kwantificering van 40 metabolieten.

Maar, extra verbindingen zijn in de cel-vrije mengsel, zoals aminozuren die kunnen worden gekwantificeerd. Dit zou helpen bij het verstrekken van een meer uitgebreide kijk op cel-vrije stofwisseling. Deze methode bleek dat cel-vrije systemen hebben complexe stofwisselingen, nog steeds actief die potentieel kunnen worden benut voor een betere energie-efficiëntie en koolstofopbrengst.

Het protocol is gebaseerd op het taggen van de verbindingen met aniline met het gebruik van EDC als katalysator. Beide reagentia zijn gevaarlijk en moeten met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt.