Microsatelliet DNA genotypering en flow Cytometrie ploidy analyses van Formalin-vaste paraffine-ingesloten Hydatidiforme molaire weefsels

Het belangrijkste voordeel van ons genotyperingprotocol is dat het besmetting met moeder-DNA minimaliseert, wat de belangrijkste uitdaging is bij het genotyperen van formeel vaste, paraffine-ingebedde molaire weefsels. Flow cytometrie is een snelle en goedkope methode die sterk vergemakkelijkt de diagnose van hydatidiform moedervlekken. Voor elke formaline-vaste paraffine-embedded, of FFPE, product van de conceptie, bereiden een vier-micron dikke hematoxylin en eosine vlek sectie zoals beschreven in deze video voor morfologische evaluatie door microscopie.

Plaats de FFPE blokken op ijs gedurende 15 minuten om de sectie te vergemakkelijken. Pas de microtome aan om secties te snijden die vier micron dik zijn voor microscopische morfologische evaluatie. Plaats het koude blok in het microtome en snijd een sectie van elk blok voor H & E kleuring.

Met behulp van tangen, breng elke sectie naar een 45 graden Celsius waterbad. Haal de sectie uit het waterbad met een positief geladen dia die eerder met het monsteridentificatienummer met een potlood was gelabeld. Plaats de dia's met de secties in een oven op 65 graden Celsius om de secties aan de glijbanen te kunnen houden.

Houd de glijbanen 25 minuten in de oven. Voer de H&E-kleuring uit door de dia's voor de juiste periode onder te dompelen in de juiste kleurpotten, zoals in het tekstprotocol is getabuleerd. Monteer de vier-micron secties voor morfologische analyse met montagemedium.

En dek af met glazen afdekbriefjes. Selecteer met behulp van de H&E-dia's en een lichtmicroscoop het FFPE-blok met de grootste hoeveelheid chorionic villi. En indien mogelijk, het blok dat chorionic villi gescheiden van en niet vermengd met moederweefsels heeft.

Pas de microtome aan om secties te snijden die 10 micron dik zijn voor DNA-extractie. Snijd 10 tot 30 secties, afhankelijk van de hoeveelheid chorionic villi in het blok. Na het oppakken van de secties met dia's als voorheen, plaats de dia's met de secties in een oven op 65 graden Celsius om de secties te houden aan de dia's.

Houd de glijbanen 20 minuten in de oven. Voer de H&E-kleuring uit door de dia's voor de juiste periode onder te dompelen in de juiste kleurpotten, zoals in het tekstprotocol is getabuleerd. Laat de glijbanen onder de rookkap voor een minimum van drie uur om voor de giftige xyleen geuren te verdrijven.

Met behulp van tangen, scheur een klein stukje papier uit een bevochtigde papier doekje. Onder een lichte stereomicroscoop, gebruik maken van de tangen en kleine stukjes water bevochtigde papieren doekjes af te schrapen alle ongewenste moederweefsels van H & E vlekken 10-micron dikke secties. De sleutel voor deze stap is geduld, vooral voor uitdagende blokken.

Het is ook belangrijk om iemand anders een kijkje te laten nemen om ervoor te zorgen dat er geen moederweefsels worden gemist. Nu, scheur een nieuw stuk papier uit de bevochtigde papieren doekjes en gebruik het om de chorionic villi te verzamelen. Doe de stukjes papierdoekjes met de bijgevoegde chorionic villi in een gelabelde buis van 1,5 ml.

Minimaliseer de hoeveelheid papierdoekjes die in deze stap worden gebruikt, omdat te veel de DNA-extractiekolom kan verstoppen en daardoor de uiteindelijke hoeveelheid verzameld DNA kan verminderen. Volg het DNA-extractieprotocol van een FFPE-kit om DNA-extractie uit te voeren. Met behulp van een labspectrometer laad je 1 microliter DNA en meet je absorptie op 216 nm voor kwantificering.

Laad 1 microliter DNA op een 2%agarose gel en voer gel elektroforese uit bij een spanning van 80 tot 100 volt voor kwalitatieve evaluatie. Kies op basis van de DNA-evaluatieresultaten het volume DNA dat moet worden gebruikt in de multiplex korte tandemrehalcster-versterking. Doel om minimaal 1000 nanogram DNA te gebruiken.

Ga naar PCR-versterking, capillaire elektroforese en gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het ideale FFPE-blok te kiezen, gebruikt u H&E-dia's op een lichtmicroscoop om een FFPE-blok te selecteren dat ongeveer 50 tot 70% van de weefsels heeft die bestaan uit chorionic villi. Voor blokken die niet de ideale hoeveelheid chorionic villi hebben, verrijken voor chorionic villi als de sectie wordt uitgevoerd.

Om dit te doen, identificeren welke kant van de vers gesneden secties bevat meer chorionic villi volgens de bijbehorende H & E dia. Gebruik vervolgens een mes om de andere helft af te snijden die moet worden weggegooid om te verrijken voor chorionic villi. Om secties van het best mogelijke FFPE-blok uit te voeren, knipt u vier secties die 50 micron dik zijn met behulp van een microtome.

In het geval dat een ideaal FFPE-blok niet beschikbaar is, moet u de verhouding van chorionic villi tot moederweefsel toch behouden. Bijvoorbeeld, als slechts 30% van het blok bestaat uit chorionic villi, terwijl de rest moederweefsels heeft, verwijder dan ten minste de helft van de sectie die de moederweefsels bevat, en gebruik meer secties om te compenseren. Plaats de secties in gelabelde buizen van 15 mL.

Voor deparaffinisatie en rehydratie werkt u in een rookkap om elk reagens toe te voegen en wacht u de juiste periode zoals in het tekstprotocol is getabuleerd. Verwijder vervolgens het reagens door vacuümzuiging met een Pasteur pipet. Voeg vervolgens vier graden Celsius citraat oplossing aan de 15 mL buizen.

Na het plaatsen in een 80 graden Celsius waterbad voor twee uur, laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder de citraatoplossing door vacuümzuiging. Voeg zes milliliter 1x PBS, vortex, en wacht een tot twee minuten om de weefsels te vestigen op de bodem.

Indien nodig, centrifugeren de monsters op 1000 RPM gedurende 30 seconden. Verwijder de 1X PBS door vacuümzuiging. Voeg nu een mL van voorverwarmde pepsine oplossing en plaats in een 37 graden Celsius droog bad voor 30 minuten.

Vortex elke 10 minuten. Bereid de propidium jodide ribonuclease Een oplossing in de laatste 10 minuten van deze incubatie. Voeg nog eens zes mL van 1x PBS, vortex, en wacht een tot twee minuten om de weefsels te vestigen op de bodem.

Verwijder nogmaals de 1x PBS door vacuümzuiging. Voeg 550 microliters van de propidium jodide ribonuclease Een oplossing toe en plaats de monsters gedurende 30 minuten in een droog bad van 37 graden Celsius. Gebruik tangen om een stuk van 48 micron filtratiemessen van vijf cm bij vijf cm in het bovenste deel van polystyreen ronde bodembuizen te plaatsen voor gebruik met de stroomcytometer.

Filtreer de oplossing door de vloeistof door het gaas en in de buis te vloeien. De monsters zijn nu klaar om te worden uitgevoerd op de stroom cytometer. Houd ze verpakt in folie totdat ze klaar zijn om te worden uitgevoerd.

Ten slotte voert u stroomcytometrie en gegevensanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Microsatellite genotyping van een gedeeltelijke hydatidiform mole, samen met het DNA van de patiënt en haar partner, blijkt dat de moedervlek is triplid ontwrichtend. De eerste 1e marker toont twee pieken in het product van de conceptie.

De eerste piek komt van de moeder, omdat alleen de moeder een piek van deze omvang heeft. Volgens dezelfde redenering, de tweede piek is afkomstig van de vader, omdat hij deelt hetzelfde allel. Merk op hoe de tweede piek is een stuk hoger dan de eerste, wat aangeeft dat er waarschijnlijk twee doses van dezelfde vaderlijke allel in die piek.

Maternale besmetting is zeer minimaal in dit product van conceptie omdat het een zeer uiterst uiterst kleine piek bij de positie van het tweede moederallel toont. De tweede markering toont drie pieken in het product van de conceptie. Twee van deze pieken zijn afkomstig van de vader, en een van de moeder.

De derde en vierde markers zijn vergelijkbaar met de eerste marker, en tonen ook twee allelen afkomstig van de vader, en een van de moeder. Aangezien alle vier markers consequent drie allelen vertonen, twee afkomstig van de vader en een van de moeder, kan men concluderen dat dit product van de conceptie is triploid ontwrichtend en bevestigt de diagnose van gedeeltelijke mol. Voor de interpretatie van de genotyping resultaten, is het belangrijk om bewust te zijn van het niveau van verontreiniging op basis van de notities genomen tijdens de reinigingsstappen.

In sommige gevallen kunnen we naar aanleiding van deze twee methoden geen conclusie trekken. In dergelijke gevallen gebruiken we andere methoden zoals FISH, om de ware genotypen te ontdekken. Microsatelliet genotyping heeft gezorgd voor nauwkeurige molaire diagnose en de weg vrijgemaakt om de genotypen die worden geassocieerd met de verschillende kenmerken van hydatidiform mollen beter te begrijpen.