Etikettering en beeldvorming van amyloïde plaques in hersenweefsel met behulp van de natuurlijke Polyphenol curcumine

Dit protocol is de meest efficiënte en kosteneffectieve methode voor het nauwkeurig labelen van bèta-amyloïde plaques, in vergelijking met amyloïde-specifieke antilichamen, die momenteel de gouden standaard zijn voor het labelen van deze plaques. Deze techniek kost minder tijd en is net zo effectief als een van de veelgebruikte amyloïde etiketteringsmethoden. Curcumine bindt sterk aan amyloïde plaques en kan worden gebruikt als een imaging sonde tijdens PET-scans van de hersenen en voor relatief niet-invasieve screenings met behulp van retinale scanning.

Curcumine bindt zich ook aan neurofibrillaire of tau kluwen bij de ziekte van Alzheimer, alfa synuclein bij de ziekte van Parkinson en gemuteerde ZvH eiwitten bij de ZvH. Het aantonen van de procedure met Panchanan Maiti zal Zackary Bowers, een afgestudeerde student, en Alexandra Plemmons, een onderzoeker van mijn lab. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pijnreflex in een verdoofde 12 maanden oude alzheimer model muis, plaats de muis in de supine positie op een operatie lade en maak een incisie in de buik en via het middenrif.

Steek een 21-meter perfusienaald in de incisie en maak een kleine incisie aan de rechter oorschelp om de perfusievloeistof uit het lichaam te laten weglopen. Gebruik een zwaartekracht gevoed perfusie systeem om ijskoude 0,1 molaire PBS vloeistof te laten stromen in de naald gedurende vijf tot zes minuten op een 20 tot 25 milliliter per minuut stroomsnelheid. Als de perfusie correct wordt uitgevoerd, wordt een duidelijke lever waargenomen.

Een goede dierlijke perfusie is essentieel omdat als het bloed niet volledig wordt verwijderd, curcumine kan binden aan de bloedvaten en resulteren in een groene fluorescerende achtergrond signaal. Wanneer alle PBS is geleverd, schakel de bufferklep op een ijskoude 4%paraformaldehyde oplossing gedurende acht tot 10 minuten voor het gebruik van schaar en tangen om de hersenen te bevrijden van de schedel. Gebruik vervolgens een spatel om de hersenen in een flacon van 4% paraformaldehyde ten minste 10 keer het weefsel volume voor vier graden Celsius opslag tot verwerking.

Om secties voor cryostat sectioning te verkrijgen, dompelt u de hersenen achtereenvolgens onder in gesorteerde sacharoseoplossingen bij vier graden Celsius gedurende 24 uur per concentratie voordat u een cryostat gebruikt bij negatieve 22 graden Celsius om 40 micrometersecties te verkrijgen, waarbij 10 tot 20 secties per put worden geplaatst in een zesputken met PBS aangevuld met 0,02%-azide zoals ze worden verkregen. Wanneer alle monsters zijn verworven, bewaar de secties op vier graden Celsius tot verdere verwerking. Om secties voor paraffinesectie te verkrijgen, dehydrateren post-vast geperfundeerd hersenweefsel met sequentiële alcoholoplossingen voor twee uur per concentratie, gevolgd door twee alcoholonderdompeling van een uur 100% en twee xylene-onderdompe onderdompeling van een uur bij kamertemperatuur.

Na de laatste xylene onderdompeling, penetreren het weefsel met een een tot een xyleen tot paraffine oplossing twee keer voor een uur per incubatie bij 56 graden Celsius in een glas conische glas bedekt met aluminiumfolie voor het onderdompelen van de weefsels in 56 graden Celsius paraffine voor vier tot zes uur. Gebruik aan het einde van de incubatie een roterende microtome bij kamertemperatuur om vijf micrometer dikke secties te verkrijgen die de secties in een 45 graden Celsius weefselwaterbad plaatsen terwijl ze worden verzameld. Voor curcumine etikettering van amyloïde beta plaques in cryostat weefsel secties, spoel de secties met PBS drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt alvorens de secties in 70% ethanol gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Terwijl de secties uitbroeden, los een millimolar van voorraad curcumine in methanol en verdun de oplossing tot een uiteindelijke werkconcentratie van 10 micromolar met 70%ethanol. Dompel aan het einde van de incubatie de secties in de werkende curcumineoplossing gedurende 10 minuten onder bij kamertemperatuur bij 50 rotaties per minuut. Gooi aan het einde van de kleuringsperiode de curcumineoplossing weg en was de secties met drie wasbeurten van twee minuten in 70% ethanol.

Breng na de laatste wasbeurt de secties over op glasplaten met polylysine bekleed en zet een afdekbrief op elke glijbaan met een geschikt organisch montagemedium. Bekijk vervolgens de secties op een florescentiemicroscoop met behulp van een 10 of 20x doelstelling en de juiste excitatie- en emissiefilters. Voor histochemische etikettering van diepe geparaffeerde weefselsecties, dompel de vijf micrometer dikke secties in xyleen twee keer gedurende vijf minuten onder bij kamertemperatuur per onderdompeling, gevolgd door rehydratie met een graad alcohol oplossing onderdompe onderdompeling.

Aan het einde van de incubatie, was de secties met gesorteerde alcohol oplossingen gedurende twee minuten per concentratie, gevolgd door clearing met twee vijf minuten xylene onderdompees. Na de tweede xyleen onderdompeling, monteer elke sectie op een microscoop schuif met een cover slip en een geschikte montage medium voor florescence microscopie imaging zoals aangetoond. Voor het etiketteren van cryostat sectiemonsters met anti-A-bètaantilichamen, was de monsters drie maal met verse PBS per wasbeurt in afzonderlijke putten van een 12 putplaat voordat u een niet-specifieke binding blokkeert met 10% normaal geitenserum in PBS en 0,5% triton x-100 gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Gooi aan het einde van de incubatie de blokkeringsoplossing weg en ontcubeer de monsters met een bèta-specifiek antilichaam 's nachts bij vier graden Celsius en 150 rotaties per minuut. De volgende ochtend, was de secties met drie 10 minuten wast in verse PBS per wasbeurt, gevolgd door incubatie met een passende secundaire antilichaam geconjugeerd met een rode fluorofophore gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie was je de secties drie keer met PBS, gevolgd door één wasbeurt met 70% alcohol.

Na de alcoholwassing, incubeer de secties met 10 micromolar curcumine gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie een minuut 70%alcohol wast. Na de laatste wasbeurt dehydrateren de secties met 90% en 100%alcohol gedurende één minuut per concentratie en maak de secties twee keer gedurende vijf minuten per onderdompeling met verse xyleen per incubatie. Dan monteren en beeld van de secties zoals aangetoond.

Voor intracellulaire amyloïde beta co-lokalisatie, vlek de secties met anti amyloïde beta antilichaam gevolgd door vlekken met curcumine bij kamertemperatuur en 50 rotaties per minuut beschermd tegen licht zoals aangetoond. Aan het einde van de incubatie, contrastain met een geschikte nucleaire kleurstof gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 50 rotaties per minuut beschermd tegen licht, gevolgd door drie wasbeurten in PBS. Dan monteren en beeld van de secties door fluorescentie microscopie zoals aangetoond.

Hoewel het verhogen van de incubatietijd met curcumine de fluorescentieintensiteit van de A-bètaplaten enigszins verhoogt, is het aantal waargenomen plaques niet significant verschillend tussen één en vijf minuten kleuringstijd. Curcumine kan worden gebruikt om vlekken Een beta plaques en cryosectioned, paraffine ingebed, en de menselijke ziekte van Alzheimer weefsel monsters. Etikettering met een bèta-specifiek antilichaam voor curcumine kleuring blijkt dat de curcumine is volledig co-gelokaliseerd met A beta op dezelfde plaques die het antilichaam binden.

Na vlekken met curcumine gelabeld Een beta oligomers, curcumine co-lokalisatie met de oligomers kan worden waargenomen in A beta plaques. Op dezelfde manier co-localiseert curcumine ook met het A-bètaspecifieke antilichaam in intracellulaire ruimten, wat bevestigt dat de vlek intracellulaire A-bèta kan labelen. Curcumine etikettering is ook prominenter dan conventionele amyloïde binding kleurstoffen.

Curcumine derivaten gevonden in tumeric extracten label Een bètaplaques relatief tot curcumine in de menselijke ziekte van Alzheimer hersenweefsel, ongeacht het type montage medium gebruikt. Bovendien worden curcumine immunofluorescentiesignalen en contrastainingintensiteit gehandhaafd, zelfs na het bevlekken met typische nucleaire vlekken en andere celmarkers. We hebben ontmoet dat constante secties dunner moeten zijn dan 40 micron.

Deze trainingsprocedure moet onder 30 minuten worden gehouden en de optimale curcumineconcentratie is één tot twee micromolar. Dubbele nivellering vertraagde biomarkers kunnen worden uitgevoerd op hetzelfde weefsel en kan een grotere specificiteit van welke soorten hersencellen worden genivelleerd. Gezien het feit dat curcumine de belasting van amyloïde plaque kan verminderen, worden de precieze mechanismen van hoe dit proces plaatsvindt momenteel onderzocht op zowel cellulair als moleculair niveau.