Inheemse polyacrylamidegel elektroforese immunoblot analyse van endogene IRF5 Dimerization

Dit protocol maakt gebruik van een veelgebruikte techniek samen met reagentia en tools die commercieel kunnen worden verworven om endogene IRF5-activering tijdens de vroege gebeurtenissen van stimulatie te beoordelen. Het kan gemakkelijk worden toegepast voor indringende IRF5 biologie in andere cellulaire context. Hoewel native PAGE een veelgebruikte techniek is, kan het technisch uitdagend zijn om duidelijke, robuuste, interpreteerbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

Het gebruik van een commercieel draaiend buffer- en gelsysteem helpt de variabiliteit te minimaliseren. En aandacht besteden aan details is essentieel, en ervaring is de sleutel tot succes bij het verkrijgen van goede resultaten. Dit gewijzigde native PAGE-protocol omvat vele stappen met subtiele details die de sleutel tot succes zijn.

Visuele demonstratie kan deze details laten zien die gunstig zouden zijn voor onderzoekers. Houd CAL-1 celkweek in een T75-kolf op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, met volledig RPMI 1640-medium. Wanneer klaar om de cellen te stimuleren, breng ze naar een 50-milliliter conische buis en centrifugeren ze op 200 x g gedurende vijf minuten.

Verwijder de supernatant, en opnieuw op te schorten de pellet in medium om een homogene eencellige suspensie te verkrijgen. Reken dan op de cellen met een hemocytometer, en zaad ze op een dichtheid van 1.000,000 cellen per put in een zes-put plaat met vier milliliter voorverwarmd medium in elke put. Incubeer de cellen gedurende 20 tot 24 uur om de samenvloeiing te bereiken 90 tot 95%De volgende dag, stimuleren van de cellen door het toevoegen van vier microliters van een milligram per milliliter R848 per put, ervoor te zorgen dat een controle goed te verlaten met cellen en geen R848 behandeling.

Wieg de plaat voorzichtig van links naar rechts om de R848 gelijkmatig te verspreiden en vervolgens de cellen 2 tot 16 uur uit te broeden bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Breng na de incubatie de celsuspensies van de plaat over in 5 milliliter centrifugebuizen. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende vijf minuten, verwijder vervolgens de supernatant, en opnieuw opschorten de pellet in een milliliter pbs.

Breng de celsuspensie in een buis van 1,5 milliliter en draai deze 30 tot 60 seconden bij 4 graden Celsius naar beneden en verwijder het supernatant voorzichtig. Bereid de lysis buffer volgens het manuscript aanwijzingen, en houd het op ijs tot klaar voor gebruik. Schort de celpellet opnieuw op in 30-microliters van ijskoude lysebuffer en pipet op en neer om te mengen.

Dan incubeer de buis op ijs voor 15 tot 20 minuten. Verhelder het lysaat door te centrifugeren bij 12, 000 x g gedurende 15 tot 20 minuten bij 4 graden Celsius, en breng het supernatant over op een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter, zodat de extracten te allen tijde op ijs blijven. Meet vervolgens de eiwitconcentratie met Bradford Reagent.

Bereid de boven- en onderkamer elektroforesebuffers volgens de handschriftrichtingen en spoel een 3-12%native PAGE gel grondig met water, zonder de putten te vervormen Extra zorg moet worden genomen bij het hanteren van het natriumdeoxycholaat. Ppe voor bescherming, zoals lab jas, veiligheidsbril, en masker zijn nodig voor de behandeling van de chemische stof. Zet vervolgens de gel in de Mini Gel Tank, verwijder de kam, voeg de voorbereide elektroforese buffers aan de boven- en onderkamer toe en voer deze voor in een koude kamer van 4 graden Celsius of op ijs op 150 volt gedurende 30 minuten.

Bereid ondertussen de monsters voor het laden door het mengen van de cellulaire eiwitten op ijs met 4X Native Sample Buffer. Zodra de pre-run is voltooid, laad 10 tot 15 microgram eiwit op elke put, en voer de gel gedurende 30 minuten op 85 volt, gevolgd door twee uur op 150 volt. Geniet vervolgens 30 minuten van de gel in de SDS-hardloopbuffer bij kamertemperatuur.

Activeer het polyvinylideen difluoridemembraan door het ongeveer vijf minuten in methanol te weken. Maak een snede op een hoek van het membraan om de oriëntatie aan te geven en monteer de overdrachtssandwich volgens het protocol van de fabrikant. Plaats de transfercassette in de tank en breng op 20 volt gedurende een uur op ijs.

Verwijder vervolgens het membraan uit de cassette met plastic tangen en blokkeer het membraan bij het blokkeren van buffer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten op een schommelende shaker. Vervolgens, incubeer het membraan met de primaire antilichaam op 4 graden Celsius 's nachts of op kamertemperatuur gedurende twee uur en was het met 1XTBST wasbuffer gedurende drie minuten tijdens het schommelen. Vervolgens incubeer het membraan met het secundaire antilichaam opnieuw met behulp van de 1XTBST wasbuffer op kamertemperatuur gedurende 45 minuten, het herhalen van de wasbeurten.

Scan vervolgens de vlek met behulp van een geschikt geldocumentatiesysteem. Met behulp van dit protocol werden CAL-1 cellen geanalyseerd die werden gestimuleerd of niet geprikkeld met R848 met een immunoblot. In niet-geprikte CAL-1 cellen werd IRF5 gedetecteerd als een enkele band op de oorspronkelijke pagina die overeenkomt met zijn monomerische vorm.

Voor de gestimuleerde cellen daalde het niveau van IRF5 monomeer, terwijl het niveau van de dimer steeg. Een immunoblot met anti-IRF5 antilichaam werd uitgevoerd op IRF5 over-uitdrukken 293 T cellen getransfecteerd met verschillende constructies. Er werd geen IRF5 aangetroffen in de onverspoorde controle, waaruit de specificiteit van het anti-IRF5-antilichaam blijkt.

Een enkele band die overeenkomt met monomerische IRF5 werd alleen gedetecteerd in de 293 T-cellen die IRF5 overpretten. Wanneer constructen die IRF5-activerende eiwitten coderen, werden gecotransfecteerd, verscheen een langzaam migrerende band die overeenkomt met de dimerische vorm van IRF5. Echter, NMDA5, een gerelateerd eiwit aan RIG-I, niet induceren IRF5 dimerization.

Het gebruik van Bis-Tris gradiënt gels is cruciaal, waarschijnlijk als gevolg van de specifieke pH en chemische samenstelling van deze gel elektroforetische systemen die het mogelijk gemaakt scheiding van monomerische en dimeric vormen van IRF5. Ook lysing en behoud van cellysates in niet-denaturerende inheemse monsterbuffer behoudt inheemse eiwitstructuren. Hier gebruikten we een commercieel verkrijgbaar dat is afgestemd op native PAGE zuren.

Een extra methode die sterk complimenteert met dit is, is het gebruik van de ImageStream imaging flow cytometrie systeem om IRF5 nucleaire translocatie te beoordelen, dat is de stof die in IRF5 activering na dimerization. In combinatie met ons protocol dient het als een ander soort test om de stappen die betrokken zijn bij IRF5-activering te valideren. Als een belangrijke regulator van de ontstekingsreactie speelt IRF5 een belangrijke rol bij infectie en immuniteit, auto-immuunziekten, kanker en vele andere ziekten die belangrijk zijn voor de menselijke gezondheid.

Er zijn ook inspanningen in de ontwikkeling van therapeutica om IRF5 en aanverwante transcriptie factoren richten. Dit protocol zal onderzoekers op diverse gebieden in staat stellen om irf5-biologie te begrijpen en te onderzoeken.