Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Dit protocol is een eenvoudige manier om de profielen van ubiquitine en ubiquitine-achtige post-translationele wijzigingen te genereren door het identificeren en semi-kwantificeren van specifieke geïdentificeerde eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van lentivirussen om stabiele cellijn van expressie binnen een week te creëren, en het gebruik van twee tags om specifiek eiwitten te zuiveren. In feite zijn dit soort post-translationele wijzigingen betrokken bij de meeste biologische functies, en veranderingen van dit mechanisme worden gevonden in de meeste ziekten.

Daarom kan het identificeren van deze veranderingen dienen als een prognostische en/of diagnose en natuurlijk als moleculaire doelen. Ubiquitine is een van de meest geconserveerde eiwitten in eukaryotische cellen en dit essentieel voor hun overleving. Daarom kan dit soort methode worden toegepast op elk eukaryotisch model, van zoogdieren tot gist.

Echter, ons lentivirale systeem is beperkt tot de studie van cellen. Aangezien de hele procedure vrij lang is met soms lange incubatietijd, is het mogelijk om het gedurende twee dagen te doen in plaats van één. Het eluaat van nikkel kralen kunnen worden ingevroren bij min 20 en voor het toevoegen van de vlag kralen.

Dit protocol bevat vele stappen waaronder sommige van cruciaal belang zijn om het uiteindelijke succes van de zuivering te garanderen, en dus de nauwkeurige vaststelling van het post-translationele wijzigingsprofiel. Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Mirna Swayden en Aurelie Dobric, twee promovendi van het lab. Om te beginnen, voeg 0,5 keer 10 toe aan de zesde van HEK 293T-cellen in een zes-put plaat met twee milliliters per put van DMEM met 10%FBS aan zaad, en uitbroeden bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 100% vochtigheid.

De volgende dag wordt 50 tot 70% samenvloeiing bereikt. Cotransfect de cellen met een mix van een microgram pCCL-6HF ubiquitine-achtig of pCCL-GFP, een microgram PBS VG en één microgram deltahelpervectoren met behulp van een transfectiereagens en protocol voor de productie van lentivirus. Na zes uur transfectie, verander het medium in een verse die overeenkomt met de media van cellen worden getransduceerd.

Zaad de cellen worden omgezet in een zes-put plaat met hun standaard cultuur media om 10 tot 20% samenvloeiing de dag erna te verkrijgen. 24 uur na transfectie, herstel het medium met lentivirale deeltjes en filter met 0,45 micronfilters. Vervang het medium van de cellen dat moet worden omgezet door het gefilterde medium dat lentivirussen bevat.

Incubeer de cellen met lentivirussen gedurende 24 tot 72 uur in een couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, en verander het medium vervolgens met verse, standaard. Controleer de GFP-expressie met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop om de efficiëntie van transductie te evalueren. Als er geen fluorescentie wordt gedetecteerd, wacht dan nog twee tot drie dagen.

Als de GFP-controle positief is met groene fluorescentie, groeien alle cellen totdat ze genoeg hebben om een expressiecontrole van 6-His-FLAG ubiquitine-achtige uit te voeren door immunofluorescentie, zoals hier getoond, en westerse vlek met behulp van anti-FLAG antilichaam. Na het kweken van de cellen in 15-centimeter schotels, was de cultuur gerechten ten minste een keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing bij kamertemperatuur. Om te beginnen cel lysis, voeg twee milliliter buffer een in elke 15-centimeter schotel op kamertemperatuur.

Gebruik een celschraper om alle lysates terug te krijgen in 50-milliliter conische centrifugebuizen. Sonicate de lystates drie keer gedurende 30 seconden, gescheiden door een pauze van een minuut. Centrifugeren de gesoniceerde lysates op 15.000 keer g gedurende 15 minuten.

Breng de supernatant naar een nieuwe buis door middel van een 40-micron cel zeef. Het is erg belangrijk om lysates te filteren na sonicatie en centrifugatie. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot copurificatie van veel niet-specifieke eiwitten, waardoor de achtergrond toeneemt en de grootte van het PTM-profiel sterk wordt verminderd.

Breng een gelijke hoeveelheid eiwit tussen 50 en 100 milligram over naar nieuwe Falcon buizen. Voeg nikkel ion NTA kralen in elke buis met de hoeveelheid van twee microliter kralen per een milligram eiwit. Plaats de buizen op een rotator om 2 1/2 uur bij kamertemperatuur bij 30 tpm te draaien.

Dan pellet de kralen op 500 keer g gedurende vijf minuten. Was de kralen met een milliliter buffer een, en breng de monsters naar een 1,5-milliliter microcentrifuge buis. Zet de buis op ijs.

Was twee maal met een milliliter ijskoude buffer twee met tien millimolar imidazool. Voeg aan elute-gebonden eiwitten 600 microliter buffer twee toe met 250 millimolar imidazool en draai twee uur lang bij vier graden Celsius. Na het pelleteren van de kralen door centrifugatie op 500 keer g gedurende een minuut, breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde 1,5-milliliter buis, en voeg 50 microliter van anti-FLAG M2 anti-geconjugatte kralen.

Draai bij 30 rpm gedurende 2 1/2 uur bij vier graden Celsius. Was dan twee keer met 500 microliters van buffer twee, dan twee keer met 500 microliters van buffer drie. Voor de laatste elutie, voeg 100 microliter buffer drie met een VLAG peptide op 0,01 microgram per microliter, en draaien op vier graden Celsius gedurende 1 1/2 uur.

Na centrifugatie op 500 keer g gedurende een minuut, breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde buis. Neem 10 microliters om op SDS-PAGE te laden en voer een zilveren kleuring van de gel uit om de zuiveringskwaliteit te controleren. Als de zuivering ziet er goed uit, analyseren van de 90%links door LC-MS.

Als u normalisatie wilt uitvoeren, gebruikt u de formules om waarden tussen met geneesmiddelen behandelde cellen en onbehandelde cellen voor alomtegenwoordig en GFP te normaliseren. Om achtergrond te verwijderen, trek je waarden in het controlemonster GFP af van waarden in de ubiquitinemonsters, om specifieke waarden voor elk geïdentificeerd eiwit in beide omstandigheden te verkrijgen. Om de variatie van alomtegenwoordigheid te verkrijgen, verkrijg je een score tussen min 100 en plus 100 voor positieve en negatieve variaties van PTMs die door een medicijn worden veroorzaakt.

Het verschil tussen de specifieke waarden van behandelde en onbehandelde monsters wordt gedeeld door de som van alle waarden, inclusief die in de controle, en vermenigvuldigd met 100. Variaties onder min 50, die de repressie van PTM vertegenwoordigen, of hoger dan 50, die de inductie van PTM vertegenwoordigen, worden als significant beschouwd. Gebruik deze formule om een betrouwbaarheidswaarde te verkrijgen tussen nul en 100%Waarden boven de 50 worden meestal als zelfverzekerd beschouwd.

Om een mooiere verdeling van inductie- en repressiewaarden te verkrijgen en om zowel variatie- als vertrouwensparameters te overwegen, gebruikt u deze formule om de variantie- en betrouwbaarheidswaarden te vermenigvuldigen. In deze studie, transductie van de cultuur zoogdiercellen werd bereikt om GFP en 6-histidine FLAG ubiquitine uitdrukken cellen te creëren. De werkzaamheid van lentivirale transductie werd eerst gecontroleerd door te kijken naar de GFP-fluorescentie van GFP-transduceerde cellen.

De expressie van FLAG-ubiquitine werd gedaan door immunofluorescentie kleuring met behulp van een anti-FLAG antilichaam, dat het percentage van de getransduceerde cellen toont. Om het expressieniveau van exogene FLAG-ubiquitine te controleren, werden lysates uit getransduceerde cellen geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door western blot met anti-FLAG antilichaam. Na zuivering van de alomtegenwoordige eiwitten werd 10% van de uiteindelijke elutie gebruikt om de hoeveelheid en integriteit van gezuiverd materiaal door SDS-PAGE en zilveren kleuring van de gel te controleren.

Achtergrond GFP monster aftrekken geïdentificeerd 364 eiwitten aanzienlijk alomtegenwoordig met een score van meer dan 50%Een gen set verrijking analyse van deze alomtegenwoordige eiwitten werd uitgevoerd om de biologische processen waarin ze betrokken waren te markeren. Potentiële interactienetwerken gevormd door gemcitabine-geïnduceerde veranderingen van alomtegenwoordigheid. Dit leidde tot de identificatie van functionele interactienetwerken die sterk werden beïnvloed door verhoogde of verminderde alomtegenwoordigheid van de betrokken eiwitten.

Het werd ook bevestigd dat de alomtegenwoordigheid van PCNA steeg na gemcitabine behandeling. Het is erg belangrijk om de overdracht van sommige kralen te voorkomen na beide elutiestappen, omdat het kan resulteren in een aanzienlijke toename van de achtergrond. Deze procedure zal specifieke post translationele wijzigingen opleveren die, door verschillende voorwaarden te vergelijken, het mogelijk maken specifieke wijzigingen te identificeren.

De eerste volgende stap is het valideren van ten minste de veranderingen van de rente op basis van biochemische benaderingen. We ontwikkelden deze methode om ubiquitine-gebaseerde, post-translationele wijzigingen te onderzoeken om nieuwe manieren en mechanismen van alvleesklierkankercellen te identificeren. Sinds dit protocol en andere wereldwijd ontwikkeld zijn met succes gebruikt om verschillende biologische processen te ontcijferen.

De lentivirussen moeten ten minste in bl-2 laboratorium worden gebruikt. Guanidine is een sterk denatureringsmiddel en moet zorgvuldig worden gebruikt. De sonicator kan ook schadelijk zijn voor de oren en moeten worden gebruikt volgens aanbevelingen.