In vitro reconstitutie van ruimtelijke Celcontactpatronen met geïsoleerde Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen
26 november 2019
Weefsel complexiteiten van multicellulaire systemen Verwar de identificatie van causaal verband tussen extracellulaire cues en individuele cellulaire gedragingen. Hier presenteren we een methode om de directe link tussen contact afhankelijke signalen en delings assen te bestuderen met behulp van C. elegans embryo blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen.
Meercellige weefsels complex, dit protocol reconstrueert cellulair gedrag op een vereenvoudigde manier. Een ding is deze techniek om de directe relaties tussen cellulaire dirigent protonen en cellulaire respons te bestuderen. Dit protocol maakt gebruik van chemisch functionele polystyreen kralen om de cellulaire geleider protonen te reconstrueren.
De kralen kunnen worden gesneden met eventuele protonen van belang, om hun effecten op cellulaire respons te testen. We hebben deze methode gebruikt in C-Elegance op muisembryo's. Daarom kan dit protocol rechtop staan bij de studies van brede organismen.
Aangezien embryo's kwetsbaar zijn na een hoge volledige chlorietbehandeling, is een belangrijke praktijk vereist voordat men blastomere met succes kan isoleren. Visuele demonstratie zal een beter begrip geven van hoe men capillair moet behandelen tijdens blastomere-isolatiemethoden. Om te beginnen weegt u 10 milli gram carboxylaat gemodificeerd polystyreenkralen in een 1,5 milli-liter microcentrifugebuis.
Voeg een milli-liter MES buffer in de buis te wassen. Vortex de buis om de kralen te mengen. Draai de buis 60 seconden op 2000XG via bench-top centrifuge.
Dicard de supernatant door zorgvuldig pipetting uit de buffer. Was de kralen opnieuw met een milli-liter MES buffer. Voeg na de was een milli-liter MES-buffer met 10 milli gram EDAC in de buis toe om de oppervlaktecarboxylgroepen te activeren.
Vortex de buis om de kralen te mengen. Draai en broed de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Spin de kralen voor 60 seconden op 2000XG.
Gooi de supernatant door voorzichtig pippetting uit de buffer, en wassen met een milli-liter PBS. Vortex de buis om de kralen te mengen en herhaal de PBS wassen nog een keer. Bereid een milli-liter van een, 10, 100, en duizendvoudige verdunning serie van Rhodamine Red-X van de 0,65 milli-liter Rhodamine Red-X voorraad oplossing.
Pippette 20 micro-liter kralen in elke seriële verdunningsbuis. Draai en ontcubeer de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de kralen twee keer met een milli-liter PBS.
Voeg na het wassen een milli-liter PBS toe aan de buizen en bewaar ze maximaal zes weken op vier graden Celsius. Controleer de fluorescentie intensiteit van de kralen onder een microscoop gebruikt voor live beeldvorming. Houd elk uiteinde van een micro-capillaire op een capaciteit van 10 micro-liter met de rechterhand en linkerhand.
Trek de micro-capillaire naar beide uiteinden om spanning toe te passen en breng het midden van de haarvaten over een brander om twee handgetrokken haarvaten te maken. Trim onder de ontleedmicroscoop de uiteinden van de handgetrokken haarvaten met tangen. Maak de twee tip opening maten ongeveer twee keer, en een keer de korte toegangslengte van C-Elegance Embryo's voor de embryo transfer en eierschaal verwijdering respectievelijk.
Bevestig de getrokken capillaire in een mond-pippetting apparaat. Pippette 45 micro-liter ei-zouten oplossing op een put van een multi-welled glijbaan. Plaats vijf tot 10 volwassen C-Elegance op de put.
Om vroege C-Elegance Embryo's te verkrijgen snijd volwassenen in stukken door het plaatsen van twee naalden aan de rechterkant en links van het lichaam van C-Elegance, en glijden de naalden langs elkaar. Pippette 45 micro-liters hypochloriet oplossing op een put naast de put met ei-zout oplossing en pippette 45 micro-liters van Shelton's Growth Medium op de daaropvolgende drie putten. Breng een celstadium en vroege twee celstadium embryo's in de hypochloriet oplossing door de mond pippette met de grotere grootte opening en wacht 40 tot 55 seconden.
Was de embryo's door ze over te brengen naar de volgende drie putten met Shelton's Growth Medium. Met één tot twee seconden in elk van de eerste twee putten. Met behulp van de met de hand getekende capillaire met de kleinere opening zorgvuldig herhalen pippetting het embryo voor eierschaal verwijderen.
Daarna continu pippette met de handgetekende capillaire om de twee-cel stadium embryonale blastomeren te scheiden. Na het verwijderen van eierschaal, minimaliseer de kracht in pippetting de embryo's op en neer om barsten te voorkomen. Bereid een beeldkamer voor door een afdeklip op een coversliphouder te plaatsen en de randen van de coverslip vast te leggen om deze te stabaliseren.
Draai de coversliphouder om en teken een cirkel op de coverslip met een hydrofobe pen. Voeg Shelton's Growth Medium toe binnen de cirkel getekend door de hydrofobe marker en breng de geïsoleerde blastomere over naar de beeldkamer binnen de cirkel. Nu, doe een klein volume van de chemisch gefunctionaliseerde kralen op de coverslip met behulp van de hand getekende capillaire met de grotere opening.
Controleer de positie van de kralen door te blazen in de met de hand getekende capillaire totdat de kralen hechten aan de geïsoleerde blastomere. Monteer de coverslip om verdamping van medium te voorkomen en voer live beeldvorming uit met behulp van een omgekeerde microscoop. In deze studie, het fluorescerende signaal van de kraal behandeld met 0,005 micro-gram per milli-liter Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester voor de transgene stam uitdrukken GFP miosin-2 en M-cherihistone was te zwak.
Aan de andere kant was het fluorescerende signaal van de kralen behandeld met vijf microgram per milli-liter Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester te sterk. De concentratie Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester van 0,5 microgram per milliliter was optimaal voor deze specifieke transgene stam. Tijdens de live beeldvorming werd een vliegtuig geïdentificeerd waar twee centrosomes verticaal waren uitgelijnd.
Het vlak met een plus of min 90 graden hoek van dit vlak is spindel vlak. De hoek van de asoriëntatie ten opzichte van de contactinterface van de cel/kraal nadat cytokinese aantoont dat beide dochtercellen aan de kraal in een lijn zijn bevestigd die beide contactoriënteerte passeert, werd gebruikt als contactoriëntatie. Men moet leren hoe embryo's en eierschaal reageren op bepaalde externe krachten toegepast door de mond pippette.
Theoretisch kan elke cellulaire respons worden bestudeerd, bijvoorbeeld, sulfaat specificatie kan worden bestudeerd door het kweken van cellen en contact met lijmkralen over langere termijnen. Deze techniek is gebruikt om contactafhankelijke celdelingsoriëntatiemechanisme te begrijpen. PTF-filter werd gebruikt om inademing van dampen van hypochlorietoplossing via mondpispitette te voorkomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode om de directe link tussen contactafhankelijke signalen en cellulair gedrag te onderzoeken met behulp van C. elegans embryo blastomeren en zelfklevende polystyreen kralen. Het protocol vereenvoudigt de complexiteit van multicellulaire systemen om cellulaire reacties op extracellulaire signalen beter te begrijpen.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Multicellulaire weefsels vertonen complexe interacties.
- Het begrijpen van cellulaire reacties is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Contactafhankelijke signalen spelen een belangrijke rol in cellulair gedrag.
- Het reconstrueren van cellulair gedrag kan helpen bij het bestuderen van deze interacties.
Doel van de Studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het bestuderen van cellulaire reacties op extracellulaire signalen.
- Om polystyreen kralen te gebruiken voor het reconstrueren van cellulaire omgevingen.
- Om deze methode toe te passen op C. elegans embryo's voor bredere biologische inzichten.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van chemisch functionele polystyreen kralen.
- Reconstructie van cellulair gedrag op een vereenvoudigde manier.
- Toepassing van de methode op C. elegans embryo's.
- Testen van effecten van verschillende signalen op cellulaire reacties.
Belangrijkste Resultaten
- Demonstreren van een directe relatie tussen contact signalen en cellulair gedrag.
- Validatie van het gebruik van polystyreen kralen in het bestuderen van cellulaire reacties.
- Inzichten bieden die toepasbaar zijn op een reeks organismen.
- Een beter begrip van multicellulaire interacties faciliteren.
Conclusies
- De methode linkt effectief extracellulaire signalen aan cellulair gedrag.
- Polystyreen kralen zijn een veelzijdig hulpmiddel voor dergelijke studies.
- Deze aanpak kan onderzoek in ontwikkelings- en celbiologie verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct interrogation of contact-dependent signaling in a controlled in vitro system, reducing confounding variables from multicellular complexity. By isolating blastomeres and using adhesive beads to define precise spatial contact patterns, researchers can establish causal links between extracellular cues and cellular responses such as division orientation. This supports mechanistic de-risking in early target validation by clarifying how physical microenvironmental inputs regulate cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests hypotheses about how specific cell-contact geometries influence division axis orientation and downstream fate specification.
- Operational Value: Provides a reductionist platform to deconvolute contact-mediated signaling from soluble factor effects.
- Predictive Value: Enables quantitative correlation of contact pattern parameters with cellular phenotypic outputs for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible cell-bead interfaces for consistent phenotypic readouts across experimental replicates.
- Scalability: Supports preparation of bead libraries with graded ligand densities to probe dose-dependent contact responses.
- Workflow Integration: Outputs such as spindle orientation angles or division symmetry serve as quantifiable endpoints for automated image-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Findings on contact-dependent division orientation inform models of tissue patterning defects relevant to congenital disorders.
- Translational Continuity: Establishes a bridge from in vitro contact mechanism discovery to in vivo validation in developing embryos.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct contact modulation versus secondary signaling cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where understanding spatial regulation of cellular behavior informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how adhesive interface composition and geometry regulate mitotic spindle alignment.
- Screening: Enables assay standardization via fluorescently tagged beads and controlled contact geometry for reproducible phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative spatial readouts (e.g., division axis angle relative to contact plane) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links in vitro contact response data to in vivo spatial patterning outcomes in embryonic development.
- Enterprise Reuse: The bead functionalization and blastomere isolation workflow can be adapted to other model systems for cross-species target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in attributing cellular responses to specific spatial contact cues.
- Operational Value: Delivers a robust, reproducible system for generating defined cell-contact microenvironments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating targets within physiologically relevant spatial contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on evidence of contact-dependent mechanism validity.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical techniques for blastomere isolation and capillary handling.
- Access to fluorescence microscopy and microfluidic-compatible imaging chambers for live-cell analysis.
- Standardization of bead functionalization protocols (e.g., EDAC activation, Rhodamine labeling) across users and batches.
- Adaptation considerations for applying the method to non-nematode blastomeres or alternative adhesive substrates.
- Practical limitations include embryo fragility post-isolation and the need for optimization of bead concentration and ligand density per cell type.
