Subcellulaire fractionering van primaire chronische lymfatische leukemie cellen om te controleren van nucleaire/cytoplasmatische eiwit handel

Het ontwikkelen van technieken om het transport van macromoleculen tussen de kern en het cytoplasma te onderzoeken, en het identificeren van verkeerde lokalisatie van tumoronderdrukkereiwitten is essentieel om een dieper begrip van CLL-pathogenese te krijgen en te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het genereren van nucleaire en cytoplasmische fracties uit primaire CLL-cellen. Deze breuken kunnen worden gebruikt in downstream experimenten met inbegrip van enzym activiteit testen, proteomische analyse, en westerse blotting.

Deze techniek zal ons begrip van hoe therapieën en micro-milieu signalen binnen tumoren veranderen de shuttling van eiwitten tussen de kern en cytoplasma in CLL cellen en mogelijk andere B-cel maligniteiten. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van eiwitten te bepalen en/of eiwitbewegingen aan te trekken, indien van toepassing. Voer een wasmiddelgradiënt uit op elke afzonderlijke cellijn die u van plan bent te gebruiken om de optimale generatie van sterk verrijkte kern- en cytoplasmische breuken te garanderen.

Naast Jodie Hay en Michael Moles, zal het aantonen van deze procedure Jennifer Cassels zijn, een technicus van mijn laboratorium. Verkrijg perifere bloedmonsters van eerder goedgekeurde chronische lymfatische leukemiepatiënten in EDTA-bloedafnamebuizen, vergezeld van het aantal witte cellen. Menselijke bloedmonsters moeten als gevaarlijk worden beschouwd omdat ze mogelijk door bloed overgedragen virussen bevatten.

Zorg ervoor dat deze monsters worden behandeld in een klasse twee bio-veiligheid kast en dat de gebruiker draagt een lab jas en handschoenen te allen tijde. Gooi met bloed verontreinigde materialen weg in ontsmettingsmiddelen. Als het aantal witte cellen gelijk is aan of groter is dan 40 miljoen cellen per milliliter, verdun het monster met een verhouding van 1 op 1 met RT CLL-wasbuffer.

Dan aliquot RT dichtheid gradiënt medium in een geschikt formaat conische centrifuge buis voor het monster. Leg het monster voorzichtig op het medium en centrifuge gedurende 30 minuten op 400 x g bij RT. Met behulp van een plastic Pasteur pipet, voorzichtig oogst de witte laag van mononucleaire cellen die verzameld op de interface van de dichtheid gradiënt medium in CLL wasbuffer. Breng deze geïsoleerde monolaag over in een verse conische centrifugebuis van 50 milliliter.

Om de cellen te wassen, voeg 40 milliliter CLL wasbuffer toe aan deze monolaag en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg, veeg de onderkant van de buis om de pellet opnieuw op te schorten en herhaal deze wasbeurt. Gooi de supernatant weg, veeg de onderkant van de buis opnieuw en hang de celpellet opnieuw op in een vast volume CLL-wasbuffer, afhankelijk van de grootte van de pellet.

Na het tellen van de cellen en na de stroom cytometrie om de celzuiverheid te controleren, plaats de cellen in weefselkweekplaten op de vereiste celdichtheid klaar voor stimulatie of medicamenteuze behandeling. Na stimulatie en/of medicamenteuze behandeling is de incubatie voltooid. Breng de cellen in individueel gelabelde 1,5-milliliter microfuge buizen en pellet door centrifugeren op 200 x g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.

Na het weggooien van de supernatant, opnieuw opschorten de cel pellet in een milliliter van ijskoude PBS met fosfatase remmers. Centrifuge op 200 x g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en houd deze hele cel extract pellets op ijs voor verdere voorbereidingen.

Om cytoplasmatische breuken voor te bereiden, voorzichtig opnieuw op te schorten de cel pellets in 50 microliters van 1x hypertonische buffer. Om de cellen te laten zwellen, broeden ze op ijs gedurende 15 minuten. Na het uitvoeren van een wasmiddelgradiënt om de optimale concentratie van wasmiddel te bepalen om te gebruiken voor een specifiek celtype, voeg 0,8 tot 2,5 microliter wasmiddel toe aan elk monster en vortex op de hoogste stand gedurende 10 seconden.

Om cellyse te verifiëren, observeer de cellen onder een fasecontrastmicroscoop voor en na toevoeging van wasmiddel. Alle cellen hebben een dichte, donkere kern omgeven door het cytoplasma dat verschijnt als een heldere halo. Eenmaal gelyseerd, centrifugeren de monsters op 14, 000 x g gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.

Breng de supernatant voorzichtig, zonder de pellet te storen, over te brengen in een voorgekoelde gelabelde microfugebuis en bewaar deze cytoplasmatische fractie op 80 graden Celsius tot verdere analyse. Zorg voor de volledige verwijdering van de cytoplasmische fractie om besmetting van de kernfractie te voorkomen. Voeg aan de resterende pellet, die de kernfractie bevat, 50 microliter van volledige lysisbuffer toe en hang opnieuw op door op en neer te pipetten.

Om eiwitten geassocieerd met het nucleaire membraan op te nemen, voeg 2,5 microliter wasmiddel, vortex op de hoogste instelling gedurende 10 seconden, en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Vortex op de hoogste stand gedurende 30 seconden en centrifuge. Breng de supernatant vervolgens over in een voorgekoelde gelabelde microfugebuis en bewaar deze kernfractie op 80 graden Celsius tot verdere analyse.

Voor hele cellysates, opnieuw opschorten de hele cel extract pellets in 100 microliter van volledige lysis buffer door pipetting op en neer. Om volledige cellyse te garanderen, voeg vijf microliter wasmiddel en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Vortex op de hoogste stand gedurende 30 seconden en dan centrifugeren op 14, 000 x g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.

Breng de supernatant in een voorgekoelde microfuge buis en bewaar dit hele cel lysaat op 80 graden Celsius tot verdere analyse. Om eiwithandel tussen nucleaire en cytoplasmische breuken te kwantificeren, kwantitatieve westerse vlekanalyse uit te voeren en de beelden te importeren. Als u de afbeelding wilt weergeven op het lint Afbeelding, klikt u op de knop Kiezen in de groep Weergave en klikt u op Chemi-kanaal.

Het dialoogvenster Weergave kiezen wordt geopend om indien nodig verdere aanpassingen in te schakelen. Implementeer extra verbeteringen met behulp van de verstelbare schuifregelaars op het tabblad van de afbeelding LUT, inclusief helderheid of contrast. Gebruik het tabblad Curven voor fijnere aanpassingen.

Klik voor gegevensanalyse eerst op het lint Analyse. Als u slechts één kanaal wilt analyseren, schakelt u de selectie uit voor de kanalen die niet worden geanalyseerd door op de miniatuur van Het kanaal Niet weergeven van een kanaal te klikken, zodat alleen het gewenste kanaal wordt weergegeven. Als u de signaalintensiteit wilt kwantificeren, klikt u op Rechthoek toevoegen om rechthoeken aan de afbeelding toe te voegen.

Klik in het midden van een functie, zoals een eiwitband, om er een rechthoek omheen te plaatsen. Nadat u de gewenste vormen hebt toegevoegd, klikt u op Selecteren om de cursor terug te sturen naar het selectiegereedschap. Als u achtergrondgeluid wilt aftrekken, klikt u op de eerste knop in de groep Achtergrond en selecteert u Median in het vervolgkeuzemenu.

Stel de randbreedte in op drie in het dialoogvenster Achtergrond en selecteer de segmenten die het beste de afbeeldingsachtergrond weergeven die moet worden gebruikt voor achtergrondberekening. Als u de gegevens wilt exporteren, klikt u op het tabblad Shapes boven de tabel. Voor densitometrie zijn waarden in de kolom Signaal vereist.

Signaal is de som van de pixelintensiteitswaarden of het totaal voor een vorm minus het product van de achtergrond in het gebied. Klik vervolgens op de knop Rapport en klik op Opslaan als of Start spreadsheet. Als u de genormaliseerde expressie van het eiwit van belang voor elk vlak of elke variabele in de opgeslagen spreadsheet wilt berekenen, deelt u het verkregen signaal voor het eiwit van belang door het signaal voor de bijbehorende eiwitbelastingscontroleband.

Als u de afbeelding wilt exporteren, klikt u op het tabblad Afbeeldingen boven de tabel en klikt u vervolgens op de afbeelding die moet worden geëxporteerd. Als u de afbeelding gebruikt voor een diapresentatie of andere digitale indelingen, klikt u op het softwarepictogram, houdt u de muisaanwijzer boven Exporteren, klikt u op Afbeelding voor digitale media en slaat u de afbeelding indien nodig op. Verrijking van CLL-cellen met een WCC groter dan 40 miljoen per milliliter met behulp van dichtheidcentrifugatie maakt een hoog celherstel mogelijk.

Analyse van het monster door stroomcytometrie na gating op FSC en SSC blijkt de zuiverheid van CLL cellen zijn meer dan 95%, zoals aangegeven door de dubbele oppervlakte expressie van CLL celmarkers, CD19 en CD5. Wanneer immunovlekken werden uitgevoerd op de resulterende fracties van de CLL-cellijn, Mac-1 en primaire CLL-cellen, gaf de fractionatie aan dat het optimale wasmiddelniveau voor Mac-1-cellen één tot 60 verdunning was, vergeleken met één tot 30 voor primaire CLL-cellen. Toen subcellulaire lokalisatie van FOXO1 in nucleaire en cytoplasmische breuken werd bepaald in Mac-1- en primaire CLL-cellen, werd het genereren van sterk verrijkte fracties aangetoond door de bijna exclusieve expressie van lamin in de nucleaire en bèta-Tubuline in de cytoplasmische fracties.

FOXO1-expressie werd verminderd in het cytoplasma na behandeling met AZD 8055, in vergelijking met NDC, vergezeld van een toename van de FOXO1-expressie in het nucleaire compartiment, wat eiwittranslocatie aantoont. Nadat individuele immunovlekken van vijf primaire CLL-monsters werden gekwantificeerd in subcellulaire fracties, bleek AZD 8055 de niveaus van FOXO1-expressie in het cytoplasma te verminderen en de expressie in de kern te verhogen. BCR cross-linking verhoogde cytoplasmatische FOXO1 expressie.

Vergeet niet om alle reagentia en monsters op ijs te houden om eiwitafbraak te voorkomen. De subcellulaire breuken gegenereerd in deze procedure kunnen ook worden gebruikt in enzym activiteit testen, zoals een FOXO activiteit test, die het mogelijk maakt parallellen worden getrokken tussen de cellulaire locatie van FOXO1 en de DNA-bindende activiteit. De ontwikkeling van deze techniek heeft ons in staat gesteld om de handel in specifieke eiwitten binnen CLL-cellen aan te pakken in reactie op selectieve remmers en ondersteunt onze parallelle immunofluorescentiestudies om een robuuste en kwantificeerbare dataset te genereren.