Name: Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer de Transwell co-cultuurmethode om paracrine signalering van tumorcellen te bestuderen en hun immunosuppressieve effecten op macrofagen te analyseren. Deze techniek maakt contactloze celinteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eric Ubil werd deels gefinancierd door de American Cancer Society postdoctorale Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Het werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01-CA205398) en een borstkanker Research Foundation Award (BCRF-18-041) aan HSE.

Alle procedures met betrekking tot de oogst en het gebruik van Murine peritoneale macrofagen werden uitgevoerd aan de Universiteit van North Carolina op Chapel Hill (UNC) en werden goedgekeurd door het UNC-Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC).
1. macrofaag cultuur
Opmerking: deze procedure kan primaire peritoneale macrofagen gebruiken (in detail hieronder beschreven), macrofagen uit het beenmerg of macrofaag cellijnen zoals J774 (ATCC) of RAW264 (ATCC).
<ol><li>Oogst peritoneale macrofagen zoals eerder beschreven16,17 en plaat rechtstreeks in de bovenste kamer (s) van een 0,4 μm polyester membraan invoegen co-cultuur 6 goed plaat (Figuur 1a). Opmerking: de geschatte opbrengst van macrofagen van elke isolatie is 1 x 106 cellen totaal, dus het gemiddelde aantal cellen per put is ~ 1.5 – 1.6 x 105 cellen in een 6 goed plaat.</li>
	<li>Cultuur de geoogste macrofagen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12, 10% foetaal runderserum (FBS), 1x penicillaire/streptomycine, 20 ng/mL macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2. Opmerking: de bovenste kamer bevat 1 ml kweekmedium terwijl de onderste kamer gevuld is met 1,5 ml. Het medium moet aan elke kamer worden toegevoegd.</li>
</ol>2. cocultuur van tumorcellen met macrofagen
<ol><li>Voorafgaand aan het gebruik, cultuur in de handel verkrijgbaar tumorcellen in hun respectieve medium na ATCC aanbevolen weefselcultuur methoden.</li>
	<li>Was aanhandig tumorcellen eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), Voeg 0,05% trypsine + ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe en incuberen bij 37 °C totdat de cellen worden losgekoppeld. Respendeer de cellen in FBS met medium, quantitaat het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer of celteller, en centrifugeer vervolgens 5 min bij 220 x g naar pellet.</li>
	<li>Tijdens het centrifugeren, aspireren het medium van de bovenste en onderste kamers van de macrophage-bevattende permeabele membraan steunplaten en vervangen door vers medium.<ol>
<li>Voor lagere kamers waar tumorcellen zullen worden verguld, vullen met 1 mL medium in plaats van 1,5 mL om voldoende volume voor toevoeging van de cel mogelijk te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirate medium uit gepileerde tumorcellen en respenderen cellen in DMEM/F12 met 10% FBS, 1x penicillaire/streptomycine, en 20 ng/ml M-CSF in een concentratie van 3 x 105 cellen/ml.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL van 3 x 105 cellen/ml tumorcellen toe aan de onderste kamer van de gewenste putjes (Figuur 1b). Opmerking: cellen kunnen onmiddellijk worden behandeld.</li>
</ol>3. behandeling van co-gekweekte cellen
<ol><li>Voor het opwekken van macrofaag pro-inflammatoire genexpressie, behandelen van afzonderlijk of co-gekweekte macrofagen door toevoeging van 100 ng/mL IFNγ en 50 ng/mL LPS.<ol>
<li>Variëren de duur van de behandelingstijden in de cultuur indien nodig. Macrofaag activering treedt op binnen 2 h en sommige tumor gemedieerde onderdrukking optreedt door 8 h. co-cultuur voor 24 h levert robuuste en consistente tumor-afgeleide onderdrukking. Opmerking: als alternatief kunnen macrofagen worden geïnduceerd om een Pro-wond helende fenotype aan te nemen door de toevoeging van factoren zoals interleukine-10 (IL10), en het effect van de tumor-uitgescheiden ligand beoordeeld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als een negatieve controle, cultuur macrofagen afzonderlijk en laat onbehandeld. Als een positieve controle, behandelen afzonderlijk gekweekte macrofagen met 100 ng/mL IFNγ en 50 ng/mL LPS.</li>
</ol>4. downstreamanalyse van co-gekweekte cellen
<ol><li>Na de gewenste incubatietijd is verstreken, Isoleer het cellysaat of het geconditioneerde kweekmedium naar wens, afhankelijk van de test behoeften.</li>
	<li>Om de cellysaat voor kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyse te isoleren, aspireren de media van beide kamers van de put en was één keer met 2 mL PBS. Breng RNA lysisbuffer aan op de bovenste kamer met de macrofagen. Schraag het membraan zachtjes om het cellysaat vrij te maken en breng het over naar een verzamelbuis voor verdere verwerking volgens het Protocol van de fabrikant van de RNA Isolation Kit.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De co-cultuur assay hier gepresenteerd is een modificatie van eerder vastgestelde assays die het mogelijk maakt voor de studie van tumor-uitgescheiden factoren op immuun celactivering. Terwijl cel-cel contact is bekend voor het induceren van veranderingen in de immuunactiviteit, het vermogen van tumor-uitgescheiden liganden te moduleren immuun activering is minder goed begrepen. We beschrijven een methode die, in tegenstelling tot directe co-cultuur, kan worden gebruikt om te ondervragen hoe tumor afkomstige afgescheiden...

Recente studies hebben gericht op het vermogen van kankercellen om detectie door immuuncellen te voorkomen, lokale immuunactivering onderdrukken, of om een tolerogenic tumor-permissieve milieu te produceren in de tumor micro omgeving. Twee brede klassen van tumor en immuuncelinteracties zijn beschreven die deze effecten vergemakkelijken: contact-gemedieerde interacties of tumor-uitgescheiden liganden. Een van de meest goed bestudeerde en klinisch Tractable mechanismen van contact-gemedieerde immuun remming gebruikt door tumoren is de uitdrukking van PD-L1, die samenwerkt met PD-1 op T-cellen voor de remming van hun activering en functie1,2. Als reactie op interferon-gamma (IFNγ), dat wordt uitgedrukt door een aantal geactiveerde immuuncellen, kunnen tumorcellen de expressie van PD-L1 verhogen om de uitputting van PD-1 te induceren-uitdrukken van geactiveerde T-cellen, waardoor ze de tumorcellen effectief uitroeien3. Het gebruik van antilichamen om de interactie tussen PD-L1 en PD-1 te blokkeren wordt momenteel gebruikt voor de behandeling van meerdere soorten kanker bij mensen4. In het licht van dit klinisch succes en anderen, de identificatie en targeting van tumor-afgeleide immunosuppressieve mechanismen heeft steeds meer aandacht gekregen.
Naast onderdrukking van adaptieve immuniteit, tumoren zijn ook bekend om te scheiden van factoren die de pro-inflammatoire reacties van aangeboren immuuncellen onderdrukken. Tumor-afgeleide of tumor-geïnduceerde afscheidingen, met inbegrip van Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, en kolonie stimulerende factor (CSF-1), is aangetoond dat de remming van antitumorale reacties van Natural Killer (NK) cellen, Granulocyten, en dendritische cellen in de tumor micro omgeving5,6,7. Tumor cellen kunnen ook het afscheiden van factoren die de werving en differentiatie van myeloïde-afgeleide cellen in de tumor micro omgeving scheeftrekken ter bevordering van de onderdrukking van T-cel activering8,9.
Eén type aangeboren immuuncel die een diepgaand effect heeft op de progressie van de tumor is de macrofaag. Gedurende vele jaren is de aanwezigheid van tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) gebruikt als een negatieve prognose van patiënt overleving10. Het concept dat immunosuppressieve TAMs bevochtigen immuun cel-gemedieerde klaring van tumoren werd geïntroduceerd meer dan 40 jaar geleden11. Meer recentelijk, het is aangetoond dat de macrofaag pro-inflammatoire reactie kan worden gedowngereguleerd terwijl een Pro-tumor fenotype kan worden geïnduceerd in de tumor micro omgeving. Deze immunosuppressieve macrofagen kunnen bijdragen aan een tolerogene respons, het stimuleren van tumorprogressie en resistentie tegen chemo-en immunotherapie12. Gezien het feit dat macrofagen vaak een van de meest voorkomende leukocyten met de tumor, herstel van hun tumor-specifieke immuunactiviteit vertegenwoordigt een potentieel doelwit voor antikanker Therapeutics13.
Terwijl contact-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en macrofagen kunnen worden gemodelleerd via directe cocultuur, het gebruik van permeabele membraan ondersteunt kan verhelderen welke tumor-uitgescheiden factoren zijn immunomodulerende zonder de potentieel verstorende invloed van tumor-immune cel-celcontact. Met behulp van enigszins vergelijkbare methoden, anderen hebben aangetoond dat het potentieel van het identificeren van afgescheiden factoren in Microglia/neuronale interacties14 evenals tumorcellen met mesotheliale cellen15. We hebben ook met succes deze co-cultuurtechniek gebruikt om de rol van een tumor-uitgescheiden eiwit, Pros1, te karakteriseren als een suppressor van pro-inflammatoire genexpressie na de stimulatie van peritoneale macrofagen met LPS en interferon-gamma16. Hier beschrijven we een eenvoudige methodologie die kan worden gebruikt om te interromen hoe tumor-uitgescheiden factoren kunnen invloed hebben op macrofaag activering.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-synthesekit</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12-medium</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysacchariden van Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis IFN&gamma;</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX-kit</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-doorlaatbare steunen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Door tumor afgeleide paracrine-signalering is een over het hoofd gezien onderdeel van lokale immunosuppressie en kan leiden tot een permissieve omgeving voor aanhoudende kanker groei en metastase. Paracrine signalen kunnen cel-celcontact tussen verschillende celtypen, zoals PD-L1 uitgedrukt op het oppervlak van tumoren rechtstreeks interactie met PD-1 op het oppervlak van T-cellen, of de secretie van liganden door een tumor cel invloed op een immuuncel. Hier beschrijven we een co-cultuur methode voor het ondervragen van de effecten van tumor-uitgescheiden liganden op immune cel (macrophage) activering. Deze eenvoudige procedure maakt gebruik van commercieel verkrijgbare 0,4 μm polycarbonaat membraan permeabele ondersteunt en standaard weefselcultuur platen. In het beschreven proces worden macrofagen gekweekt in de bovenste kamer en tumorcellen in de onderste kamer. De aanwezigheid van de 0,4 μm-barrière zorgt voor de studie van intercellulaire signalering zonder de verstorende variabele van fysiek contact, omdat de twee celtypen hetzelfde medium en de blootstelling aan paracrine liganden delen. Deze aanpak kan worden gecombineerd met anderen, zoals genetische veranderingen van het macrofaag (bijvoorbeeld isolatie van genetische knock-out muizen) of tumor (bijv. CRISPR-gemedieerde veranderingen) om de rol van specifieke afgescheiden factoren en receptoren te bestuderen. De aanpak leent zich ook voor standaard moleculaire biologische analyses zoals kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) of Western Blot-analyse, zonder dat stroom sortering nodig is om de twee celpopulaties te scheiden. Enzym-gebonden immunosorbent assays (elisa's) kan op dezelfde manier worden gebruikt voor het meten van uitgescheiden liganden om beter te begrijpen van de dynamische interactie van cel signalering in de context van het type meerdere cellen. De duur van de co-cultuur kan ook worden gevarieerd voor de studie van tijdelijk gereguleerde gebeurtenissen. Deze co-cultuur methode is een robuuste tool die de studie van tumor-uitgescheiden signalen in de immuuncontext vergemakkelijkt.

Om het effect van tumor-uitgescheiden liganden op macrofaag polarisatie te bepalen, werd de beschreven procedure gebruikt. Peritoneale macrofagen gekweekt in de afwezigheid van tumorcellen werden gebruikt als negatief (onbehandeld = uiterst links) en positief (IFNγ en LPS gestimuleerd = 2ND van links) controles (Figuur 2a). Als alternatief werden peritoneale macrofagen samen met B16F10 melanoom tumorcellen (ATCC) (Figuur 1a). Onmiddellijk na het bekle...

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Deze Transwell co-cultuur methode wordt gebruikt om paracrine signalering gebruikt door tumorcellen om de immuunrespons te onderdrukken bestuderen. Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe afgescheiden liganden te ontdekken, evenals de mechanistische onderbouwing van hun immuunonderdrukkende effecten. We hebben deze methode eerder gebruikt om te laten zien hoe tumor-gesecreteerde factoren macrofaag pro-inflammatoire gentranscriptie kunnen dempen.Wij geloven dat deze tool heeft brede implicaties in de studie van tumor-afgeleide immuun onderdrukking. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om paracrine signalering tussen tumorcellen en immuuncellen te bestuderen zonder de potentieel verwarrende variabele van cel-naar-cel contact. Dit platform is ook vatbaar voor een verscheidenheid aan moleculaire biologische technieken voor downstream analyse.Na het oogsten van buikvliesmacrofagen, plaat ze direct in de bovenste kamers van een 0,4 micrometer polyester membraan insert co-cultuur zes-put plaat. Vervolgens toegevoegd aangevuld DMEM aan de put zodanig dat de bovenste kamer bevat een milliliter en de onderste kamer bevat 1,5 milliliter. Incubeer gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Ten eerste, cultuur commercieel beschikbare tumorcellen in hun respectieve medium, volgens ATCC aanbevolen weefsel cultuur methoden. Was vervolgens de aanhangende tumorcellen eenmaal met PBS. Voeg 0,05% trypsine in EDTA toe en broed op 37 graden Celsius totdat de cellen loskomen.Stel vervolgens de cellen opnieuw op in media die FBS bevatten. Gebruik een hemocytometer of celteller om het totale aantal cellen te kwantificeren en centrifuge op 220 keer G gedurende vijf minuten te pelleteren. Tijdens centrifugatie, aspirate het medium uit de bovenste en onderste kamers van de macrofaag met permeabele membraan steunplaten en vervangen door vers medium.Voor de onderste kamers waar tumorcellen zullen worden verguld, vul met een milliliter medium in plaats van 1,5 milliliter om voldoende volume te verlaten voor celtoevoeg. Wanneer de centrifugatie is voltooid, het medium uit de pelleted tumorcellen aanzuigen en de cellen in de aangevulde DMEM opnieuw opschorten bij een concentratie van 300.000 cellen per milliliter. Voeg 0,5 milliliter van deze celsuspensie toe aan de onderste kamer van de gewenste putten.Om macrofaag pro-inflammatoire genexpressie te induceren, behandelt u afzonderlijk of co-gekweekte macrofagen door interferonmama toe te voegen bij een concentratie van 100 nanogram per milliliter en LPS bij een concentratie van 50 nanogram per milliliter. Varieer de duur van de behandeltijden in de cultuur als dat nodig is. Macrofaag activering vindt plaats binnen twee uur, en sommige tumor-gemedieerde onderdrukking optreedt door acht uur.Co-cultuur gedurende 24 uur levert robuuste en consistente tumor-afgeleide onderdrukking. Als een negatieve controle, cultuur macrofagen afzonderlijk en laat onbehandeld. Behandel als een positieve controle afzonderlijk gekweekte macrofagen met interferon gamma en LPS in dezelfde concentraties die voor de monsters worden gebruikt.Nadat de gewenste incubatietijd is verstreken, isoleer het cellysaat of conditiecultuurmedium naar wens, afhankelijk van de testbehoeften. Om het cellysaat te isoleren voor kwantitatieve polymerase kettingreactieanalyse, het medium uit beide kamers van de put aan tezuilen en eenmaal te wassen met twee milliliter PBS. Breng RNA lysis buffer aan op de bovenste kamer met de macrofagen.Schraap hierna voorzichtig het membraan om het cellysaat vrij te geven en breng het over naar een opvangbuis voor verdere verwerking volgens het protocol van de fabrikant van de RNA-isolatiekit. De hier beschreven co-cultuurmethode omvat de cultuur van macrofagen en tumorcellen zonder fysiek contact. Peritoneale macrofagen gekweekt in afwezigheid van tumorcellen worden gebruikt als negatieve en positieve controles.Peritoneale macrofagen co-gekweekt in aanwezigheid van B16F10 tumorcellen, maar zonder activerende stimuli niet verhogen expressie van pro-inflammatoire geassocieerde genen. Dit impliceert dat tumor-uitgescheiden liganden ofwel niet voldoende zijn om pro-inflammatoire genexpressie zelf te induceren, of als er immuunactivering door tumorafscheidingen is, paracrine liganden voldoende zijn om het tot zijn oorspronkelijke niveaus te onderdrukken. Deze co-cultuur methode illustreert dat wanneer macrofagen gepolariseerd door interferon gamma en LPS worden gekweekt in de aanwezigheid van tumorcellen, onderdrukking van ontsteking-geassocieerde genexpressie werd verminderd met maar liefst 60%Een vergelijkbaar niveau van macrofaag pro-inflammatoire genonderdrukking wordt waargenomen wanneer de murine macrofaag cel lijn J774 wordt vervangen door peritonealphages.Eerder werk heeft eiwit S geïdentificeerd als een tumor-uitgescheiden factor die macrofaagactivering kan remmen, dus het permeabele membraanondersteuning co-cultuurmodel wordt gebruikt in combinatie met een lysA om de concentratie van eiwit S in geconditioneerde media na 24 uur te testen. In geconditioneerde media van interferon gamma en LPS-behandelde B16F10 melanoomcellen, wordt eiwit S uitgedrukt in een concentratie van ongeveer 475 nanogram per milliliter. Peritoneale macrofagen behandeld in dezelfde omstandigheden uitgedrukt eiwit S op ongeveer 61 nanogram per milliliter.Interessant is dat toen co-gekweekt, de concentratie van eiwit S in de interferon gamma en de LPS-behandelde put was ongeveer 86 nanogram per milliliter. Dit suggereert dat ofwel macrofagen tumor-gedecretde eiwit S innemen of dat de hoeveelheid eiwit S afgescheiden door B16F10 cellen aanzienlijk is afgenomen wanneer in aanwezigheid van macrofagen. Deze resultaten benadrukken diepgaande veranderingen van macrofaagactivering en paracrinesignalering wanneer macrofagen worden co-gekweekt met tumorcellen.De Transwell co-cultuur methode kan een verscheidenheid aan vragen met betrekking tot paracrine signalering te beantwoorden. Westerse vlekanalyse kan worden uitgevoerd om te bepalen hoe tumor-gesecreteerde eiwitten verschillende signaleringstrajecten in macrofagen veranderen.

studying-effects-tumor-secreted-paracrine-ligands-on-macrophage

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates an assay to study mesenchymal stem cell (MSC) regulation of macrophage phagocytosis in a co-culture. Upon co-culturing MSC with macrophages, non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorophore are added to be phagocytosed by the macrophages. With the increase in phagocytosis, the fluorescence intensity rises, allowing the determination of MSC-mediated regulation of phagocytic activity.

An Assay to Study the Regulation of Macrophage Phagocytosis by Mesenchymal Stem Cells

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Paracrine en juxtacrine cellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Hier, wordt een proximale cultuur-methode gebruikt om te studeren paracrine signalering waar de gelokaliseerde concentraties van de secreted factoren terwijl het voorkomen van rechtstreekse cellulaire contacten worden onderhouden.

Een proximale cultuur methode om te studeren Paracrine signalen tussen cellen

Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.

Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen

Hier presenteren we een protocol om de interactie van primaire humane monocyt-afgeleide macrofagen met een tumorsferoïde in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix te onderzoeken, met de mogelijkheid om de impact van oplosbare en fysische eigenschappen van de micro-omgeving op celinvasie te vergelijken.

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

Gezien de beperkte xenotransplantaatmodellen die beschikbaar zijn om interacties tussen menselijke CART- en myeloïde cellen te bestuderen, hebben we in vitro en in vivo modellen opgesteld om de effecten van menselijke macrofagen op CART-cellen te begrijpen. Bevindingen kunnen mogelijk worden gegeneraliseerd om de rol van macrofagen in de micro-omgeving van de tumor te evalueren en macrofaaggerichte immunotherapieën te testen.

Onderzoek naar interacties tussen myeloïde cellen en CAR T-cellen in vitro en in vivo

Leer de Transwell co-cultuurmethode om paracrine signalering van tumorcellen te bestuderen en hun immunosuppressieve effecten op macrofagen te analyseren. Deze techniek maakt contactloze celinteracties mogelijk.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt (Video) | JoVE Journal

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Meer video's verkennen