Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de betekenis van genexpressie dynamiek in celproliferatie en differentiatie, met name de dynamiek van Notch signalering moleculen in neurale stamcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel in vitro als in vivo genexpressie kunnen monitoren met een zeer hoge precisie door live beeldvorming. Het aantonen van de procedure zal Hiromi Shimojo zijn, de assistent-professor uit mijn laboratorium die deze nieuwe technologie ontwikkelde.

Voor Dll1 F luciferase verslaggever inleiding in NPC, bevestigen een gebrek aan reactie op pedaal reflex in een embryonale dag 12,5 tot 14,5 zwangere muis voor het maken van een twee-tot drie centimeter incisie door de buik, langs de middellijn. Plaats PBS-geweekt gaas rond de incisie, en gebruik ringvormige tangen om zorgvuldig te extraheren van de juiste baarmoeder hoorn. Gebruik na het tellen van de embryo's een micro capillair om één tot twee microliter gemengde Dll1 F luciferase reporter DNA te injecteren in de ventrikel van de telencephalon van elk embryo.

Een succesvolle injectie zal resulteren in de naleving van blauwe kleurstof over het oppervlak van de baarmoeder. Voor elektroporatie, nat de baarmoeder en de elektrode met PBS, en voorzichtig grijpen het hoofd van het eerste embryo. Stel de positief geladen elektrode aan de kant van het halfrond in waarin het DNA werd geïnjecteerd, en geef vijf 30-tot 50-volt, 50-milliseconde pulsen, met een pauze van één seconde tussen pulsen, waarbij wordt gecontroleerd of bellen worden gegenereerd uit de negatief geladen elektrode.

Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, breng de linker baarmoederhoorn terug naar de buik en gebruik een 17-millimeter naald om de incisie te sluiten met een 4-0 zijden hechting, waardoor warme PBS in de buikholte worden gelegd voordat de sluiting wordt voltooid. Voor het opzetten van een gescheiden NPC cultuur, ten eerste plaats de baarmoeder van een embryonale dag 12,5 tot 14,5 zwangere Dll1 ubiquiinated luciferase transgene muis in een 10-centimeter Petri schotel met 25 milliliter ijskoude PBS, en gebruik microschaar en fijne tangen om de embryo's te verwijderen uit de baarmoeder. Na het onthoofden van de embryo's, plaats de hoofden in een nieuwe 10-centimeter Petri schotel met ijskoude DMEM/F12, en verwijder de opperhuid en kraakbeen rond elke hersenen.

Breng de hersenen in een 35-millimeter schotel onder een ontledenmicroscoop met drie milliliter ijskoud N2B27 medium. Verwijder de rechter- en linkertelengte van diencephalon. Gebruik fijne tangen om de hersenvliezen die het oppervlak van telencephalon bedekken te verwijderen en om het dorsolaterale deel van de cortex uit de telencephalon te ontleden.

Wanneer alle neurale weefsels van belang zijn geïsoleerd, gebruik maken van een P1000 pipet om de monsters over te dragen in individuele 1,5-milliliter buizen, en gebruik een P200 pipet om een extra medium van elke buis aan te trekken. Voeg 100 microliters papaïneoplossing per cortexpaar toe en plaats de monsters gedurende 15 minuten op 24 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, voorzichtig pipette de monsters 10 keer met een nieuwe P1000 pipet, en breng de buizen terug naar 24 graden Celsius voor een extra 15 minuten.

Aan het einde van de incubatie, voorzichtig pipette de monsters weer voor het verzamelen van de verteerde weefsels door centrifugatie. Aspirate de supernatants, en voorzichtig resuspend elke pellet met een milliliter van DMEM/ F12 medium. Centrifuge de monsters nog drie keer zoals net aangetoond, voorzichtig resuspending elke pellet met een verse milliliter van medium na elke centrifugatie.

Na de laatste centrifugatie, resuspend de pellets in 500 microliters van N2B27 medium aangevuld met een-millimolar luciferine, en zaad een keer 10 tot de zes cellen van elk monster op individuele poly-L-lysine-gecoate glazen bodemschotels. Plaats vervolgens de platen in de celcultuur incubator voor een uur. Zodra de cellen hebben gehecht aan de schotel, voeg twee milliliter verse N2B27 medium plus een-millimolar luciferin aan elke plaat.

Om luciferase reporter expressie in NPC dissociatie culturen visualiseren, selecteer de olie onderdompeling doelstelling, en plaats het monster schotel op de microscoop stadium. Bekijk het veld handmatig om de beste positie voor het bekijken van de cellen te bepalen en focus op de cellen van belang. Klik op Live om de testafbeelding te verkrijgen en gebruik het multidimensionale acquisitieprogramma om de time-lapse-acquisitie uit te voeren door tweedimensionale luminescentie- en bright-field-acquisities gedurende 24 uur.

Voor de voorbereiding van de ontwikkeling van cortex slice culturen, een dag na reporter injectie, oogst de embryonale dag 13,5 tot 14,5 embryo hersenen zoals aangetoond, en plaats het gerecht met de hersenen op het stadium van een fluorescentie stereoscopische microscoop. Bevestig dat elke cortex de geïnjecteerde tl-reporter onder het juiste excitatielicht uitdrukt en breng de hersenen over naar een siliconen rubberen snijplank gevuld met 30 milliliter DMEM/F12-medium, boordebeld met 100% zuurstofgas. Gebruik een micro chirurgisch mes en fijne tangen om de grens tussen het mediale en laterale gedeelte van de rugstelengte te snijden, en scheid het weefsel in twee hemisferen.

Gebruik vervolgens het mes om de cortex als strepen te snijden om corticale plakjes te verkrijgen, waarbij de plakjes in medium van de snijplank worden overgebracht naar een nieuwe petrischaal van 35 millimeter terwijl ze worden verworven. Wanneer alle plakjes zijn verzameld, plaats het gesneden oppervlak van elk plakje op een kweekplaat in een glazen bodemschaal met verrijkt medium, waarbij de oriëntatie van elk segment zo nodig wordt aangepast met fijne tangen. Verwijder vervolgens een overtollig medium met een pipet en plaats de schotel in een multi-gas incubator ingesteld op 40% zuurstof, 5% kooldioxide, en 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Voeg aan het einde van de incubatie 300 microliter verrijkt medium toe, aangevuld met één millimolar luciferin aan het kweekgerecht. Om de luciferase reporter expressie in de slice culturen te visualiseren, selecteert u de 40x doelstelling, en plaats het monster schotel op de microscoop stadium. Verwerf een testbeeld van de fluorescentie en stel de positie en het focusvlak in op het gebied van belang onder de verlichting van het juiste excitatielicht.

Voer vervolgens de time-lapse-acquisitie uit door driedimensionale luminescentie-, fluorescentie- en bright-field-acquisities gedurende 24 uur. Om de promotoractiviteit van het oscillerende gen Dll1 te monitoren, kan alomtegenwoordige luciferase, een gedestabiliseerde luciferase-verslaggever met een halflevenstijd van ongeveer 10 minuten, worden gebruikt. Net als een fluorescerende verslaggever, kan de luciferase verslaggever worden gebruikt om de expressie dynamiek van een eiwit te controleren door te worden versmolten met de gen codering sequentie van belang.

Om de expressie van verslaggevers op eencellig niveau in weefselculturen te visualiseren, kan het reportergen via utero-elektroporatie, zoals aangetoond, transiëntly worden doorgetransfecteerd in NPC's. Bovendien, microscoop-gebaseerde beeldvorming maakt de verwerving van helder-veld, fluorescentie, en chemiluminescentie beelden. De verslaggever van Dll1 promotor activiteit vertoont een oscillerende uitdrukking in NPC's afgeleid van de telencephalon van Dll1 ubiquiinated F luciferase reporter muizen, met de gedestabiliseerde luciferase verslaggever die een scherpe op en neer regulering van de expressie van promotor activiteit.

In aangrenzende verbeterde groene fluorescerende eiwit-positieve cellen die Hes1 verslaggever en mCherry-positieve cellen uitdrukken Dll1 eiwit verslaggever die contact met elkaar gemaakt tijdens observatie, Hes1 verslaggever expressie lijkt te beginnen ongeveer 60 minuten na contact, wat suggereert dat de vertraging voor de overdracht van Notch signalering tussen de aangrenzende cellen is ongeveer een uur. Bovendien vertoont Dll1-eiwitexpressie tijdens signaaloverdracht een dynamische translocatie. Houd bij het verwerven van de bioluminescentiebeeldvorming de microscoopruimte volledig donker, omdat vreemd licht een optimale acquisitie kan voorkomen.

Recente ontwikkelingen in optogenetica stelt ons in staat om genexpressie te controleren met licht. Met deze techniek kunnen we tegelijkertijd verschillende patronen van genexpressie introduceren en de reacties van luciferase reporter monitoren.