Bepaling van immuuncelidentiteit en zuiverheid Met behulp van epigenetische kwantitatieve PCR

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het bepalen van de identiteit en zuiverheid van de immuuncel, en richt zich op beperking van stroomcytometrie, zoals grote steekproefvereiste, hoge gebruikersvariabiliteit en subjectieve gegevensanalyse. Deze test omvat een geautomatiseerde data-analyse sjabloon die het mogelijk maakt voor gebruikers om immuuncel identiteit en zuiverheid objectief te beoordelen. Dit, samen met de meerdere test controles biedt een kant-en-klare, gemakkelijk gestandaardiseerde methode voor de beoordeling van immuuncel identiteit en zuiverheid.

Het aantonen van deze techniek zal Jerry Guzman zijn, een wetenschapper in ons laboratorium. Na genomische DNA-isolatie van het hematopoietische celmonster van belang, gebruik je één microliter van het genomische DNA om de zuiverheid van het monster op een spectrofotometer te meten door de optische dichtheid op 260, 280 en 230 nanometer te verkrijgen. Vervolgens verdun 400 tot 1200 nanogram genomisch DNA-monster tot een uiteindelijk volume van 142 microliters met elutiebuffer uit een genomische DNA-isolatiekit.

Voeg 75 microliter van de calibrator toe aan 67 microliter elutiebuffer. En verdun 1200 nanogram van het referentiegenomic DNA tot een totaal volume van 142 microliters met elutiebuffer. Dan incubeer de buizen gedurende vijf minuten op 56 graden Celsius en 900 omwentelingen per minuut in een thermische mixer.

Voor bisulfite conversie, voeg 270 microliters van ammonium bisulfite en 90 microliter van THFA aan alle buizen. En draaikolk de buizen om een grondige mix te garanderen. Draai de monsters kort naar beneden om de vloeistof te verzamelen en plaats de buizen gedurende 45 minuten in de thermische mixer bij 80 graden Celsius en 900 omwentelingen per minuut.

Draai vervolgens de monsters kort weer naar beneden en laat ze drie tot vijf minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Voor DNA-zuivering na bisulfite conversie, vortex de DNA isolatie paramagnetische kralen voor 30 seconden. Voeg ethanol en isopropanol toe aan de wasbuffers volgens de volumes op de flessen.

Vortex weer totdat de kralen volledig opnieuw zijn opgetrokken en bij 870 microliters lysebindingsbuffer en 105 microliter van de DNA-bindende paramagnetische kralen aan elke buis. Vortex de buizen te mengen voordat kort spinnen van de monsters. Voeg 570 microliter van 2-propanol aan elke buis en meng door vortexing.

Broed de buizen zeven minuten lang op kamertemperatuur en 50 RPM per minuut voordat u de buizen kort weer spint en vijf minuten op een magnetisch rek plaatst. Aan het einde van de incubatie verwijder de supernate zonder de kralen te storen. Was het monster met buffer 1 en draaikolk de buizen.

Na een korte centrifugatie plaats de buizen terug in het rek gedurende drie minuten en verwijder de supernate zonder verstoring van de kralen. Was het monster twee maal met wasbuffer 2 en droog de buizen op 65 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens 60 microliters evolution buffer aan elke buis.

Na een incubatie van zeven minuten bij kamertemperatuur en 1400 rotaties per minuut, draai de buizen kort naar beneden en breng de buizen twee minuten terug naar de magneet. Aan het einde van de incubatieoverdracht zetten 55 microliters van de bisulfie DNA-bevattende DNA-bevattende DNA naar een nieuwe buis zonder de kralen te verstoren. Als u kwantitatieve PCR op de voorbeelden wilt uitvoeren, wijst u elke standaard de taakstandaard toe in de kwantitatieve PCR-software en geeft u de definitieve exemplaarnummers op basis van de tabel.

Bereid seriële verdunningen van standaard DNA en bereid een kwantitatieve PCR master mix cocktail voor het doelceltype. En een kwantitatieve PCR master mix cocktail voor GAPDH, volgens de tabel. Laad drie microliter van het sjabloon-DNA in de juiste putten van een 96 goed afgeronde bodemplaat, gevolgd door zeven microliters van master mix.

Wanneer alle putten zijn geladen verzegelen de plaat met kwantitatieve PCR-folie en kort draaien van de plaat voor het laden op de kwantitatieve PCR-instrument. Voer vervolgens de reactie uit zoals aangegeven in de tabel. Exporteer bij de oplevering de kwantitatieve PCR-gegevens als txt- of xlsx-bestand.

Na het zuiveren van de bisulfite omgezet DNA met paramagnetische beats zoals aangetoond, elute 25 microliters van het DNA. Breng de bisulfite omgezet DNA in een nieuwe buis en voeg twee microliters van het monster in individuele PCR strip buizen. Voeg twee microliter water toe aan een no template control tube en bereid de voorversterkermastermix voor alle monsters volgens de tabel voor.

Voeg 23 microliter van master mix aan elke buis en dop, vortex, en kort spin vaststelling van de buizen. Voer vervolgens het voorversterkerprotocol uit op een thermo cycler met behulp van een verwarmd deksel. Nadat de run is voltooid, kort spin de buizen en breng over naar microliters van de versterkte DNA naar nieuwe buizen.

Verdun vervolgens de monsters met 78 micro liter water tot een concentratie van één tot 40 en voer een kwantitatieve PCR van de monsters uit, zoals aangetoond. Hier worden representatieve gegevens weergegeven uit een CD8+T-celtest die is verkregen uit het analyseren van zowel perifeer bloed, mononucleaire cellen als T-cellen van drie verschillende donoren met behulp van zowel stroomcytometrie als methylatietesten. De trends tussen de twee methoden tussen alle donoren in beide celtypen waren vergelijkbaar.

Deze representatieve gegevens van de Treg-test tonen ook vergelijkbare resultaten tussen methoden. Echter, in alle gevallen, deze methylatie test leverde hogere waarden onder zowel gestimuleerd en niet-gestimuleerde voorwaarden. De gevoeligheid en specificiteit van elke test werd aangetoond door de grens van blanco, limiet van detectie en limiet van kwantificering waarden.

Omdat deze test een geautomatiseerde sjabloon voor gegevensanalyse biedt, verbetert het de objectieve analyse en verhoogt het de standaardisatiemogelijkheden. Dit is ideaal voor celtherapie productie waar gestandaardiseerde methoden zijn cruciaal voor het creëren van een consistente celtherapie product.