Name: Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer optocardiografie en elektrofysiologie toe te passen op geïsoleerde varkensharten met Langendorff-perfusie. Deze methode combineert optische mapping van transmembraanvoltage en intracellulair calcium voor cardiaal onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen Dr. Matthew Kay dankbaar voor nuttige experimentele begeleiding, en Manelle Ramadan en Muhaymin Chowdhury voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01HL139472 to NGP, R01 HL139712 to NI), Children's Research Institute, Children's National Heart Institute en Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel cardiovasculaire onderzoekmodellen variëren van cellulaire tot in vivo preparaten, er is een inherente trade-off tussen klinische relevantie en experimentele nut. Op dit spectrum blijft het geïsoleerde Langendorff-perfused hart een nuttig compromis voor het bestuderen van cardiale fysiologie48. Het hele hart model vertegenwoordigt een hoger niveau van functionele en structurele integratie dan single cell of weefsel monolayers, maar vermijdt ook de verstorende complexiteiten geassocieerd met in vivo modellen. Een groot voordeel bij twee optische mapping-experimenten is dat het epicardial-oppervlak van het geïsoleerde hart kan worden waargenomen, en fluorescentie beeldvorming van transmembraan potentiaal en calcium behandeling kan worden gebruikt om cardiale fysiologie te controleren34.
Knaagdier modellen worden meestal gebruikt voor geïsoleerde hart preparaten in tegenstelling tot grotere dieren, deels te wijten aan de bijbehorende kosten van het up-dimensioneren van alle elementen die betrokken zijn (bijv. oplossings volume, perfusiecircuit, hoeveelheid kleurstoffen en mechanische uncouplers) samen met grotere instabiliteit en neiging voor aritmiteit bij grotere dieren10,36,49. Een voordeel voor het gebruik van varken harten is dat ze sterk lijken op het menselijk hart in structuur, grootte en snelheid van contractie, dus nauwkeuriger modellering van hemodynamische parameters zoals coronaire bloedstroom en cardiale output. Evenzo hebben mensen en varkens vergelijkbare calcium behandeling, elektrocardiogram intervallen37, en actiepotentiaal morfologie met inbegrip van de onderliggende kanalen die het vertegenwoordigt12,50,51, 52. Dit protocol beschrijft in detail de stappen voor het maken van een reproduceerbaar groot diermodel om de myocardiale functie volledig te karakteriseren. Gelijktijdige beeldvorming van transmembraan spanning (RH237) en intracellulair calcium (Rhod2), gebruikt in combinatie met gevestigde elektrofysiologische protocollen, biedt de mogelijkheid om mechanismen te lokaliseren die verantwoordelijk zijn voor veranderde cardiale Functie. De beschreven methodologie kan worden gebruikt voor preklinisch veiligheidsonderzoek, toxicologische screening en het onderzoek naar genetische of andere ziektepathologieën. Bovendien kan de beschreven methodologie worden aangepast en aangepast voor gebruik met andere cardiale modellen (bijv. Canine, mens), afhankelijk van de specifieke onderzoeksinspanningen53,54,55.
Er zijn een paar kritische wijzigingen in gedachten te houden bij de overgang van een kleinere knaagdier model naar een groter varken model voor geïsoleerde, hele hart preparaten. Tijdens de voorbereiding en Setup, raden wij aan het toevoegen van albumine aan de perfusaat te handhaven oncotische druk en verminderen van oedeem (plus anti schuim, indien nodig)56,57,58,59. Bovendien, perfusaat bevattende albumine kan ook helpen bij metabole studies die ook vetzuur-suppletie vereisen aan de media60,61. In tegenstelling tot knaagdier harten, het grotere varken hart hoeft niet te worden ondergedompeld in warme media vanwege de kleinere oppervlakte-volume verhouding en het toegenomen volume van verwarmde media stroomt door de coronaire vaten die de temperatuur beter onderhoudt. Zoals eerder opgemerkt, plaatsten we temperatuurvoelers in de rechter ventrikel en op het epicardial-oppervlak van zowel de rechter-als de linkerventrikels, waarbij slechts lichte temperatuurschommelingen van 1 − 2 °C op alle drie de locaties in de studie werden waargenomen. Belangrijk is dat dergelijke snellere stroomsnelheden ook de kans op bellen en een potentiële embolie kunnen verhogen. Om dit probleem te omzeilen, raden wij het gebruik van een Bubble val met grote boring buizen die recht naar beneden naar de aorta canule. Evenzo vonden we het nuttigst om twee individuen te laten werken in tandem om de aorta te cannuleren op een groter (en zwaarder) hart; Eén persoon om de aorta open te houden met stevige hemostatica en een andere om de aorta aan de aan te beveiligen met behulp van navelstreng. In de beschreven methodologie, we vonden dat perfusie met cardioplegia en defibrillatie essentieel voor cardiale herstel waren, wat in strijd is met knaagdieren hart preparaten. In onze ervaring, slechts een paar uitgesneden harten hervat normale sinus-gedreven activiteit zonder cardioversion.
Om optische beeldvormende eindpunten te verbeteren, beperkte een hangende hart voorbereiding het effect van verblinding dat kan optreden met een ondergedompeld hart. Bovendien vermijdt het hangende hart ook een compressie of compromis van de coronaire vaten op het achterste deel van het hart dat kan optreden bij het horizontaal leggen van het hart voor verticale beeldvorming. We vonden ook dat het laden van fluorescerende kleurstoffen na de Bubble-val (dicht bij de aorta-canule) sterk verbeterde weefsel kleuring en optische signalen. Tot slot, voor het verbeteren van cardiale elektrofysiologie eindpunten, het gebruik van een grotere coaxiale stimulatie elektrode vergemakkelijkt succes atriale pacing. Hoewel we het gebruik van elektrocardiogrammen beschrijven om opname en verlies van opname voor verschillende EP-parameters te identificeren, kunnen intracardiale katheters of bipolaire opname elektroden ook worden gebruikt.
Onze studie was gericht op het ontwikkelen van een methodologie voor dubbele optische mapping en cardiale elektrofysiologische beoordeling in een geïsoleerd, intact varkens hart model. Vanwege gelijkenissen met het juveniele menselijk hart blijft het varkens hart een populair model voor studies gericht op pediatrische cardiologie of aangeboren hartafwijkingen. Belangrijk is dat de beschreven aanpak kan worden aangepast om te gebruiken met groter formaat volwassen harten en/of verschillende soorten van belang. Andere laboratoria kunnen namelijk vaststellen dat het gebruik van Canine of menselijk hart (donor of zieke) meer toepasbaar is voor hun specifieke onderzoek focus53,54,55. Een andere mogelijke beperking van deze studie is het gebruik van een mechanische ontkoppelaar om bewegings artefact tijdens beeldvorming te verminderen. Blebbistatin is de ontkoppelaar van de keuze geworden in cardiale beeldvormings toepassingen vanwege de minimale effecten op ECG-parameters, activering en refractaire perioden41,62,63. BDM is een goedkopere keuze, wat vooral belangrijk kan zijn in grote dierproeven die grotere volumes perfusaat en mechanische ontkoppelaar vereisen, maar het is bekend dat het een grotere invloed heeft op kalium-en calcium stromen die het actie potentieel kunnen veranderen morfologie64,65,66,67. Als BDM wordt gebruikt, houd er dan rekening mee dat apd verkorting de hart kwetsbaarheid voor Shock-geïnduceerde hartritme68verhoogt. Omgekeerd, de belangrijkste beperking voor het gebruik van blebbistatine is de lichtgevoeligheid en fototoxiciteit, hoewel alternatieve formuleringen die deze effecten hebben verminderd69,70,71. Ten slotte maakt de beschreven methodologie gebruik van een enkel camerasysteem voor dubbele optische mapping experimenten, maar het is belangrijk op te merken dat onderzoeken gericht op ventriculaire fibrillatie en/of het volgen van elektrische golven over het epicardial-oppervlak zou deze benadering moeten wijzigen om driedimensionale panoramische beeldvorming op te nemen, zoals beschreven door anderen15,19,72,73,74,75 .

Hart-en vaatziekten is een leidende oorzaak van ziekte en dood wereldwijd. Als zodanig is een primair onderzoek gericht op het optimaliseren van methodologieën die kunnen worden gebruikt om normale cardiale fysiologie en onderliggende mechanismen te bestuderen die kunnen bijdragen tot morbiditeit en sterfte bij de mens. Fundamenteel cardiovasculair onderzoek heeft zich traditioneel gebaseerd op kleine diermodellen, met inbegrip van knaagdieren en konijnen1,2,3, als gevolg van de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde soorten4,5, lagere kosten, kleinere experimentele voetafdruk en hogere doorvoer. Het gebruik van een Pig-model heeft echter het potentieel om meer klinisch relevante gegevens te verstrekken6. Inderdaad, eerdere studies hebben gedocumenteerde gelijkenissen in cardiale elektrofysiologie (EP) tussen mensen en varkens, met inbegrip van soortgelijke ionen stromen7, actie potentiële vorm8, en reacties op farmacologische testen9. Bovendien heeft het varkens hart contractiele en ontspannings kinetiek die meer vergelijkbaar zijn met die van de mens dan knaagdieren of konijnen10. In vergelijking met een Canine model, de varkens coronaire anatomie lijkt meer op een menselijk hart11,12 en is het model van de keuze voor studies gericht op hart ontwikkeling, pediatrische cardiologie en/of aangeboren hartdefecten 13. Hoewel er verschillen zijn tussen het varken en het menselijk hart8, maken deze gelijkenissen het varkens hart tot een waardevol model voor cardiovasculair onderzoek14.
Retrograde perfusie van het hart is uitgegroeid tot een standaardprotocol voor het bestuderen van cardiale Dynamics ex vivo15 sinds de eerste oprichting door Oskar Langendorff16. Daarom kan Langendorff-Perfusion worden gebruikt om een geïsoleerd, intact hart te ondersteunen bij afwezigheid van autonome invloeden. Dit model is een handig hulpmiddel voor het direct vergelijken van cardiale elektrofysiologie en contractiliteit tussen gezonde en niet-gezonde harten. Aangezien cardiale dynamiek zowel tijdelijk als ruimtelijk complex is, kan een lichte verandering in één regio het vermogen van het hele hart om te werken als een syncytium17drastisch beïnvloeden. Daarom is een hoge spatiotemporele beeldvorming van parameter gevoelige kleurstoffen een handig hulpmiddel voor het bewaken van de hartfunctie over het oppervlak van het hart18,19. Inderdaad, gelijktijdige dubbele beeldvorming van spanning en calcium-gevoelige fluorescentie sondes maakt het mogelijk voor de beoordeling van elektrische activiteit, behandeling van calcium en excitatie-contractie koppeling op het weefselniveau20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusie en/of optische mapping technieken zijn eerder gebruikt om de afname van de cardiale prestaties als gevolg van veroudering of genetische mutaties te documenteren, en om de veiligheid van farmacologische agentia of milieu blootstellingen te beoordelen29 ,30,31,32,33.
In de klinische setting wordt een invasieve cardiale elektrofysiologie-studie vaak gebruikt om hartritmestoornissen te onderzoeken, pathologieën te identificeren en mogelijke behandelingsopties te lokaliseren. Evenzo beschrijven we een EP-protocol dat kan worden gebruikt om de sinus knooppunt functie te beoordelen, Atrioventriculaire geleiding te meten en de refractoriteit van myocard weefsel te identificeren. De beschreven EP-studie kan worden uitgevoerd in combinatie met optische mapping, of optocardiografie34, om de cardiale fysiologie in geïsoleerde harten volledig te karakteriseren. In het beschreven protocol werd een hoge spatiotemporele resolutie fluorescentie Imaging uitgevoerd met een combinatie van voltage (RH237) en calcium (Rhod-2AM) kleurstoffen in een dubbele emissie-opstelling. Daarnaast werden cardiale elektrofysiologie parameters bewaakt onder zowel sinusritme als respons op geprogrammeerde elektrische stimulatie.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>Mechanical Uncoupler</td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>Mechanical Uncoupler</td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Analoge signaaalinterface</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam Y-30 Emulsie</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Aortacanule, 5/16&rdquo;</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>Bubble trap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>Camera, sCMOS</td><td>Andor Technology</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Coaxial stimulatie-elektrode (atria)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>Defibrillator</td><td>Zoll</td><td>M Series</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic spiegel</td><td>Chroma Technology</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>Differentiële versterker</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>Emissiefilter, calcium</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>Emissiefilter, spanning</td><td>Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>EP stimulator (Bloom)</td><td>Fisher Medical</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>Excitatiefilter</td><td>Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>Excitatieverlichting</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>Filtercartridge, polypropyleen</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>Filterbehuizing</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>Flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsspiraal</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Hemofilter</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatische forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>Beeldsplitser</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Grote buis met een diameter van 3/8&rdquo;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>Lens 50 mm, 0.95 f-stop</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Beelduitlijning</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Mucasol detergent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>Naaldelektroden 29 G, 2 mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td>MLA1204</td><td></td></tr><tr><td>Ruisonderdrukker</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Perfusiepomp</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>Druksensor</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>Stimulatie-elektrode (ventrikel)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch hechtdraad</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td>Transducer versterker</td><td>World Precision Instruments</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>Tubing flow console</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Navelband</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad/circulator</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische instrumenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasterschaar</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8448</td><td>Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm</td></tr><tr><td>Elektrocauter</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>Model: 200 Basic</td></tr><tr><td>Hemostaat</td><td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>St Vincent Tube Occluding Forceps</td></tr><tr><td>Hemostatische forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8960</td><td>Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm</td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8985</td><td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm</td></tr><tr><td>Mayo schaar</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>14.5 cm, Straight</td></tr><tr><td>Metzenbaum schaar</td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11.5 cm, Straight</td></tr><tr><td>Mosquito forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8980</td><td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm</td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8828</td><td>Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length</td></tr><tr><td>Pediatrische klem</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations</td></tr><tr><td>Rechtshoekige forceps</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle</td></tr><tr><td>Mes</td><td>Ted Pella</td><td>549-4</td><td>Meshandgreep No. 4, 13.7 cm roestvrij staal en 10 No. 22 lemmetjes</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8380</td><td>Operatieschaar, recht, stomp/stomp, 42 mm mes, 12 cm</td></tr><tr><td>Rechte gekartelde forceps</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>Dressing Forceps 15.5 cm</td></tr><tr><td>Doekklem</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>Backhaus

optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo langendorff-perfused hearts

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Kleine diermodellen worden meestal gebruikt in cardiovasculaire onderzoek als gevolg van de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde soorten en lagere kosten in vergelijking met grotere dieren. Toch zijn grotere zoogdieren beter geschikt voor translationele onderzoeksvragen met betrekking tot normale cardiale fysiologie, pathofysiologie en preklinisch onderzoek van therapeutische middelen. Om de technische barrières die gepaard gaan met het gebruik van een groter diermodel in het hart onderzoek te overwinnen, beschrijven we een benadering om fysiologische parameters te meten in een geïsoleerd, Langendorff-perfused Knorretje. Deze aanpak combineert twee krachtige experimentele instrumenten om de toestand van het hart te evalueren: elektrofysiologie (EP) studie en gelijktijdige optische mapping van transmembraan spanning en intracellulaire calcium met behulp van parameter gevoelige kleurstoffen (RH237, Rhod2-AM). De beschreven methodologieën zijn zeer geschikt voor translationele studies die het cardiale geleidingssysteem onderzoeken, veranderingen in de actiepotentiaal morfologie, behandeling van calcium, excitatie-contractie koppeling en de incidentie van cardiale plaatsvervankers of hartritmestoornissen.

Figuur 1a toont een diagram van het geïsoleerde hart perfusie systeem, dat het slangen circuit, de pomp, het filter, de oxygenator, de reservoirs en de verwarmingselementen omvat. Plaatsing van de ECG (lead II configuratie) en pacing elektroden wordt weergegeven in afbeelding 1B, en de Imaging Setup wordt afgebeeld in afbeelding 1c. De optische componenten en licht paden worden schematisch weergegeven in figuur 1d.
Experimentele studies werden uitgevoerd op intact, hele hart geïsoleerd van juveniele Yorkshire varkens (14 − 42 dagen, n = 18) die varieerden in grootte van 2,5 − 10,5 kg lichaamsgewicht en 18 − 137 g hart gewicht (Figuur 2a). Na het overdragen van het geïsoleerde hart naar een Langendorff-systeem (37 ° c) stabiliseerde de hartfrequentie tot 70 ± 4,5 BPM (gemiddelde ± SEM) binnen ~ 10 min van defibrillatie en bleef constant gedurende de duur van de studie (Figuur 2b). Een gemiddelde stroomsnelheid van 184 ± 17 mL/min (gemiddeld ± SEM) werd gemeten, wat vertraagde tot 70 ± 7,5 mL/min na perfusing met verwarmde media met een mechanische ontkoppelaar (figuur 2c).
Lood II-Ecg's werden gedurende de gehele duur van de studie geregistreerd tijdens het sinusritme (Figuur 3a) of als reactie op externe pacing (Figuur 3B-E) om elektrofysiologische parameters te kwantificeren. Voor de beoordeling van het EP werd Dynamic pacing (S1 − S1) toegepast op het rechter Atrium om de wbcl en SNRT te lokaliseren (hersteltijd na S1 − S1 begint, figuur 3c), waarbij wbcl werd aangeduid als de kortste PCL die Atrium naar ventriculaire geleiding initieerde. Een S1 − S2 pacing-protocol werd uitgevoerd met behulp van een bipolaire stimulus-elektrode op de linker ventrikel om de kortste koppelings interval die de ventriculaire depolarisatie initieerde te identificeren, waardoor VERP (figuur 3D). Als alternatief wordt een S1 − S2 Atrium pacing protocol toegepast op Pinpoint avnerp (S1 − S2), zoals weergegeven in figuur 3e. Representatieve voorbeelden van varkens hart elektrofysiologie parameters uitlijnen nauw met die eerder gepubliceerde37.
Er werden optische toewijzings experimenten uitgevoerd tijdens het sinusritme, spontane ventrikelfibrillatie (Figuur 4) of tijdens dynamische pacing (S1 − S1) van de linker VENTRIKEL (LV) om elektrische en calcium restitutie curven te genereren, afgebeeld in Figuur 5. Representatieve beelden van een Knorretje hart met kleurstof lading worden weergegeven in Figuur 4 met overeenkomstige optische actie potentialen (VM) en calcium (CA) transiënten verzameld uit twee gebieden van belang op het epicardial oppervlak (rechter ventrikel [RV] = blauw, LV = rood) . Onverwerkte signalen worden weergegeven tijdens sinusritme en tijdens ventrikelfibrillatie. Zoals eerder vermeld, werd Dynamic epicardial pacing (S1 − S1) ook gebruikt tijdens optische toewijzings experimenten om een klein verschil in de intrinsieke hartslag te normaliseren (Figuur 5A-E). RAW-signalen worden weergegeven (RV = blauw, LV = rood), die werden gebruikt om de actiepotentiaal af te beelden — calcium transiënte koppelings tijd (figuur 5c), activering en duurtijd (figuur 5d), elektrische en calcium restitutie (figuur 5e). Voor dikke myocardiale preparaten is ruimtelijke filtering met kernelgrootte ~ 3 mm x 3 mm geschikt voor epicardial-actiepotentiaal of calciumtransiënte analyse19,47. Dienovereenkomstig, hoge ruimtelijke resolutie beelden (in de beschreven Setup 1240 x 1024 totaal, of 620 x 512 per kanaal, 6,5 μm pixelgrootte) zijn vaak ruimtelijk binned tijdens of na de overname (figuur 5c). Beeldverwerking kan worden uitgevoerd om activerings-en repolarisatie kaarten te genereren met behulp van aangepaste algoritmen23,33,43,45 (afbeelding 3D), met de activeringstijd van elke pixel op het hart werd gedefinieerd als de maximale afgeleide van de actiepotentiaal of calcium voorbijgaande upstroke.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Figuur 1: experimentele opstelling. A) diagram van het geïsoleerde hart perfusie systeem; pijlen duiden de richting van de stroming aan. B) bij het plaatsen van de elektrode wordt een gecanuleerd hart weergegeven. RA = right atria, RV = rechter ventrikel, LV = linker ventrikel, ECG = lood II elektrocardiogram. C) het beeldvormings platform in de nabijheid van het hartweefsel. D) de emissie van elke aanvullende sonde (spanning, calcium) wordt gescheiden door een golflengte met behulp van een beeldsplitsings inrichting met geschikte emissie filters en dichroïde spiegel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figuur 2: hart gewicht, snelheid en debietmetingen. A) hart gewicht tot lichaamsgewicht verhouding voor elke biglaat gebruikt in het onderzoek (n = 18). (B) gemeten hartslag ~ 10 min na defibrillatie en opnieuw aan het einde van de studie (ongeveer 1 uur). C) coronaire stroom daalt neerslaand na perfusie met een mechanische ontkoppelaar (+ BDM) door een verminderde zuurstofbehoefte. Schaalbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figuur 3: representatieve voorbeelden van lood II-elektrocardiogram opnames verzameld tijdens sinusritme of als reactie op externe pacing. (A) normaal sinusritme. (B) voorbeeld van het gebruik van epicardial bij cyclus lengte van 400 MS (S1 − S1), dat werd gebruikt voor Imaging-experimenten. C) boven: atriale pacing om wbcl te identificeren; succesvolle inname wordt waargenomen bij S1 = 250 MS waarin atriale naar ventriculaire geleiding wordt waargenomen. Merk op dat atriale pacing kan worden gebruikt om SNRT (tijd tot sinusknoop ontlading te bepalen, na het beginnen met een externe pacing). Bodem: als de S1 cyclus lengte wordt verlaagd tot 205 MS, de geleiding naar de ventrikel mislukt. D) boven: Epicardial pacing (S1 − S2) om verp te identificeren; succesvolle opname wordt waargenomen bij S1 = 450 MS, S2 = 300 MS. onder: als de S2 cyclus lengte wordt verlaagd tot 250 MS, het ventriculaire weefsel niet vast te leggen. E) atriale pacing (S1 − S2) om AVNERP te identificeren. Boven: succesvolle opname wordt waargenomen bij S1 = 450 MS, S2 = 200 MS. onder: aangezien de S2-cyclus lengte wordt verlaagd tot 199 MS, mislukt de geleiding naar de ventrikel. Blauwe pijlen duiden op pacing spikes, rode pijlen duiden Capture (' C ') of no Capture (' NC ') aan. S1 − S1 = dynamisch pacing, S1 − S2 = extrastimulus pacing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figuur 4: optische gegevens tijdens sinusritme en ventrikelfibrillatie. Links: representatieve afbeeldingen van een met kleurstof beladen Pig-hart (VM = voltage, RH237; CA = calcium, Rhod2), anterieure weergave. Ruimtelijk gefilterde transmembraan spanning en intracellulaire calcium fluorescerende signalen van een varkens hart tijdens sinusritme (midden). Spanning en calcium signalen tijdens ventrikelfibrillatie (rechts). Signaal regio maten (15 x 15 pixels = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 kernel grootte) weergegeven als rode en blauwe vierkantjes. Eenheden = ΔF/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figuur 5: optische gegevens van Langendorff-perfused Pig Hearts. Onbewerkt, ruimtelijk gefilterd (A) transmembraan spanning en (B) intracellulaire calcium fluorescentie signalen van de rechter en linker ventrikels tijdens elektrische pacing op de Apex. Ongefilterde, ruimtelijk gemiddelde signalen verbeelden optische actie potentialen en calcium transiënten uit regio's van belang (signaal eenheden zijn ΔF/F). (C) een overlay van genormaliseerde transiënten illustreert actiepotentiaal-calcium voorbijgaande koppelings tijd (Low-Pass gefilterd op 75 Hz). D) het verwerken van signalen over het epicardial oppervlak om isochrale kaarten van temporele parameters te genereren, inclusief activeringstijd (tact) en 80% repolarisatie tijd. E) elektrische en calcium voorbijgaande restitutie curven gegenereerd op meerdere frequenties (links) met statistische analyse (rechts) ter illustratie van langere repolarisatie tijd bij langzamere pacing cyclus lengtes. Schaalbalken = gemiddelde ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Chemische</td>
			<td>Formule</td>
			<td>Molecuulgewicht</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumchloride</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58,44</td>
			<td>5,26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumgluconaat</td>
			<td>C6H11nao7
</td>
			<td>218,14</td>
			<td>5,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumacetaattrihydraat</td>
			<td>C2H3nao2• 3H2O</td>
			<td>136,08</td>
			<td>3,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaliumchloride</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74,55</td>
			<td>0,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride (watervrij)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95,21</td>
			<td>0,1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,4% natriumbicarbonaat</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84,01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannitol</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182,17</td>
			<td>16,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium sulfaat</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120,37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7,4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Osmolariteit (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: gemodificeerd del Nido cardioplegia recept.

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Cardiovasculaire storing is de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd. Het geïsoleerde hartmodel dat we hier presenteren, kan dienen als een experimenteel venster in de menselijke hartdynamiek. Deze aanpak combineert een klassieke elektrofysiologiestudie met de gelijktijdige optische mapping van transmembranespanning en intercellulair calcium om de toestand van het hart te evalueren.Deze methodologie kan worden toegepast op ziektemodellering, farmacologie en toxicologiestudies. Bijvoorbeeld, een van onze gebieden van focus is het karakteriseren van de effecten van glas sizers op cardiale elektrofysiologie. Hoewel deze methodologie is meer technisch uitdagend dan een protocol dat gebruik maakt van een kleiner dier model, over het algemeen, het protocol is relatief eenvoudig zodra alle stukken op zijn plaats.Het is moeilijk om alle componenten van een beeldvormings- en perfusiesysteem per tekst te beschrijven, dus visuele demonstratie van dit proces zal helpen bij het reproduceren van een succesvolle voorbereiding. Na het isoleren van het hart met de opgaande aorta intact, duik het uitgedeelde orgaan in ijskoude cardioplegia en gebruik een paar hemostats om de muur van de aorta te grijpen. Schuif het vat op een geribbelde canule bevestigd aan buizen aangesloten op een liter ijskoude cardioplegia medium opgehangen ongeveer 95 centimeter boven het hart.Laat de vloeistof de aorta vullen totdat het vat overstroomt om te voorkomen dat er bellen in de vasculatuur terechtkomen en gebruik navelstrengtape om de aorta aan de canule te beveiligen. Bind de hemostats om het gewicht van het hart te dragen als het hangt aan de canule om het weefsel verder te beveiligen en laat het koude medium om het hart retrograde bij een constante druk van 70 millimeter kwik door de zwaartekracht. Breng het horen over naar het 37 graden Celsius Langendorff-systeem zonder lucht in de canule te introduceren.En laat de normale sinus ritme om de vasculatuur van de resterende bloed en cardioplegia spoelen. In het geval van schokkende hartritmestoornissen, plaats externe peddels aan de top en basis van het hart om het orgel te defibrilleren, het leveren van een enkele schok op vijf joules en het verhogen in vijf joule stappen tot 50 joules, cardioversie, of onshockable ritme wordt bereikt. Spoel vervolgens het hart door met ten minste één liter gemodificeerd Krebs-Henseleit medium zonder recirculatie om restbloed en cardioplegia te verwijderen.Wanneer het medium helder door het hart loopt, sluit u de circulerende lus om het perfusaat te recirculeren. Om een standaard lood tot ECG in de loop van de studie op te nemen, bevestigt u een 29-gauge naaldelektrode aan het ventriculaire epicardium in de buurt van de top en bevestigt u een andere elektrode in het rechteratrium. Sluit de positieve en negatieve ingangen van een differentiële bioamplifier aan de top en het rechteratrium, respectievelijk, en bevestig een bipolaire stimulus elektrode op het rechter atrium en een tweede bipolaire stimulus elektrode aan de laterale linker ventrikel voor pacing doeleinden.Tempo het hart met behulp van een elektrofysiologie stimulator, met de eerste stroom ingesteld op twee keer de diastolische drempel en een een milliseconde pulsbreedte. Om de pacing drempel te identificeren, pas een reeks van een tot twee milliamp stimulus impulsen met een one-milliseconde puls breedte op gedefinieerde pacing cyclus lengten om een consistente stimulus respons te garanderen. Voer extra stimulus pacing met behulp van een S1, S1 of S1, S2 pacing trein.Verlaag de S2-pacingcyclus stapsgewijs met 10 milliseconden totdat pacing niet wordt vastgelegd. Ga vervolgens naar de voorlaatste pacing-cycluslengte en verklein de cycluslengtes in intervallen van één milliseconde om de meest nauwkeurige pacingcycluslengte te bepalen voordat het verlies van de vangst. Om de ventriculaire effectieve vuurvaste periode vast te stellen, gebruik de stimuluselektrode op de laterale linkerventrikel om de kortste S1 te identificeren, S2-interval waarbij de S2 voortijdige beat ventriculaire depolarisatie initieert.Om de cycluslengte van Wenckebach te definiëren, gebruikt u de stimuluselektrode op het rechteratrium om het kortste S1-interval te vinden, het S1-interval waarbij een één-op-één atrioventriculaire geleiding zich voortplant via het normale geleidingstraject. Om de sinusknoophersteltijd te definiëren, gebruikt u de stimuluselektrode op het rechteratrium om een S1- S1-pacingtrein aan te brengen en de vertraging tussen de laatste impuls in de pacingtrein en het herstel van spontane sinoatrialknoopteactiviteit te meten. Gebruik de stimuluselektrode op het rechter atrium om de atrioventriculaire knooppunt effectieve vuurvaste periode vast te stellen.Zoek de kortste S1, S2 koppeling interval waarbij de voortijdige atrium stimulatie wordt gevolgd door een Hisbundle potentieel dat een QRS complex ontlokt, wat betekent ventriculaire depolarisatie. Voor optische mapping van de transmembrane spanning en intracellulaire calcium, eerst langzaam toe te voegen tot vijf milliliter vers bereide spanning kleurstof proximale aan de aorta cannula, gevolgd door de langzame toevoeging van vers bereide calcium kleurstof. Plaats vervolgens de beeld hardware om zich te concentreren op een geschikt gezichtsveld en sluit de camera aan op een werkstation.Verkrijg afbeeldingen met behulp van de geselecteerde software met een belichtingstijd van 5 tot twee milliseconden. En voer een beeld uitlijning met behulp van software die kan splitsen en overlay de gewenste regio's en tonen een grijswaarden aftrekken of pseudo-kleur toevoeging aan een markering verkeerde uitlijningen. Met de omgevingsverlichting geminimaliseerd, test de LED-verlichting om een uniforme en maximale epicardial verlichting te garanderen, zoals bepaald door de sensor goed diepte.Beeld vervolgens het myocardium tijdens het sinusritme, ventriculaire fibrillatie of dynamische pacing met behulp van de stimulatieelektrode die op de linkerventrikel is geplaatst, te beginnen met een pacingcycluslengte van 350 milliseconden en met 10 tot 50 milliseconden om restitutiecurven te genereren. Als u de verwerving van een optisch signaal van kwaliteit tijdens het experiment wilt bevestigen, opent u een videobestand, selecteert u een interessegebied en zet u de gemiddelde fluorescentie in de loop van de tijd in kaart. Verwijder aan het einde van het experiment het hart uit het systeem en laat het uitfusten leeglopen.Spoel vervolgens de systeembuizen en kamers met gezuiverd water. Voor routineonderhoud spoelt u het systeem periodiek af met een wasmiddeloplossing. In deze representatieve studies werd de procedure uitgevoerd op intacte modellen, zoals aangetoond, die varieerden in grootte van 2,5 tot 10,5 kilogram lichaamsgewicht en 18 tot 137 gram hartgewicht.Na het overbrengen van het geïsoleerde hart naar een Langendorff-systeem stabiliseert de hartslag tot ongeveer 70 slagen per minuut binnen ongeveer 10 minuten na defibrillatie en blijft constant gedurende de duur van de studie. Een gemiddelde debiet van ongeveer 184 milliliter per minuut wordt meestal gemeten. Het vertraagt tot 70 milliliter per minuut na het doordurmen met opgewarmd medium met een mechanische ontkoppelaar.Lood twee ECG's kunnen worden geregistreerd gedurende de duur van de studie tijdens sinusritme of in reactie op externe pacing om de elektrofysiologische parameters te kwantificeren. Optische mapping experimenten kunnen ook worden uitgevoerd tijdens het sinusritme en spontane ventriculaire fibrillatie. Representatieve beelden van een met kleurstof geladen hart kunnen worden verkregen met de bijbehorende optische werkingsmogelijkheden.En calciumtransiënten kunnen worden verzameld uit twee regio's van belang op het epicardiale oppervlak. Bovendien kan dynamische epicardial pacing worden gebruikt tijdens de optische mapping experimenten om eventuele kleine verschillen in de intrinsieke hartslag te normaliseren. De ruwe signalen kunnen worden gebruikt om de actie potentiële calcium voorbijgaande koppeling tijd, de activering en duur tijd, en de elektrische en calcium restitutie af te beelden.Het is belangrijk om te voorkomen dat bellen in de aorta komen, om de tijd van overdracht van het dier naar het systeem te minimaliseren en om het grotere hart te ondersteunen. Elektrofysiologie en optische signaalgegevens kunnen na de overname worden geanalyseerd. Bovendien kan het hart worden bewaard na de studie voor histologie, immunostaining, of genexpressie analyse.We gebruiken deze techniek om de jeugdige cardiale ontwikkeling te karakteriseren en om de impact van blootstelling aan het milieu op hartfysiologie te onderzoeken. De mechanische ontkoppelaars die worden gebruikt om beweging te minimaliseren en de anti-schuim chemicaliën die worden gebruikt om albumin schuimen adres zijn beide giftig, dus het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen is absoluut essentieel.

optocardiography-electrophysiology-studies-ex-vivo-langendorff

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van de methodologie en de resultaten van gelijktijdige endocardiale en epicardiale optische in kaart brengen van de elektrische prikkeling in de intacte linker atrium van een Langendorff-doorbloed schapen hart tijdens stretch-geïnduceerde atriumfibrilleren.

High-Resolution endocardiale en epicardiale Optical Mapping in een Schaap Model van Stretch-Induced atriale fibrillatie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

In this video, we perform Langendorff retrograde perfusion of an isolated mouse heart. During the procedure, the cardiac activity of the heart is maintained by perfusing it retrogradely with a perfusion solution via the coronary arteries using a cannula inserted into the ascending aorta. The model is used to study the cardiac pathophysiology of the heart.

Langendorff Retrograde Heart Perfusion: An Ex Vivo Technique to Perfuse Isolated Mouse Heart

De meeste studies met het Langendorff-apparaat gebruiken kleine diermodellen vanwege de verhoogde complexiteit van systemen voor grotere zoogdieren. We beschrijven een Langendorff-systeem voor grote diermodellen dat gebruik mogelijk maakt voor een reeks soorten, inclusief mensen, en relatief eenvoudige gegevensverzameling.

Een GeÃ ¯ soleerde Werken Hart voor grote Animal Models

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en kamp dynamiek met behulp van een ex vivo Langendorff setup.

Impact van Intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en Arrhythmogenesis in een Ex Vivo Langendorff systeem

Het huidige protocol beschrijft aortacantnulatie en retrograde perfusie van het ex-vivo neonatale muizenhart.  Een tweepersoonsstrategie, met behulp van een ontleedmicroscoop en een stompe kleine naald, maakt betrouwbare cannulatie mogelijk. Kwantificering van longitudinale contractiele spanning wordt bereikt met behulp van een krachttransducer die is verbonden met de top van de linker ventrikel.

Aangepaste techniek voor het gebruik van neonatale muizenharten in het Langendorff-preparaat

Het huidige protocol beschrijft methoden voor transgene expressie in ratten- en muizenharten door directe intramyocardiale injectie van het virus onder echocardiografiebegeleiding. Methoden voor de beoordeling van de gevoeligheid van harten voor ventriculaire aritmieën door de geprogrammeerde elektrische stimulatie van geïsoleerde, langendorff-doordrenkte harten worden hier ook uitgelegd.

Virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de rechter- en linkerventrikelfunctie van donorharten na koude bewaring betrouwbaar te kwantificeren met behulp van een ex vivo perfusiesysteem.

Beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een Langendorff-model

Screening op coronaire hartziekte zou de verkrijging van donorharten kunnen verhogen met uitgebreide criteria. Een protocol voor het uitvoeren van reproduceerbare coronaire angiografie tijdens ex-situ hartperfusie wordt hierin beschreven in een varkensmodel.

Coronaire angiografie tijdens ex-situ hartperfusie in een varkensmodel

Leer optocardiografie en elektrofysiologie toe te passen op geïsoleerde varkensharten met Langendorff-perfusie. Deze methode combineert optische mapping van transmembraanvoltage en intracellulair calcium voor cardiaal onderzoek.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Meer video's verkennen