Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Het gebruik van het protocol als biofysisch effect van verschillende optogenetische actuatoren op cardiomyocyteactiviteit kan worden getest om te helpen bij de ontwikkeling van optogenetische experimenten in hartweefsel en hele harten. Door de patchklemtechniek te combineren met sarcomere tracking en koolstofvezel ondersteunde krachtmetingen, kunnen we de effecten van GtACR1-fotoactiviteit op de elektra en mechanica van ventriculaire cardiomyocyten bestuderen. Optogenetische remming kan mogelijk worden gebruikt voor optische defibrillatie.

GtACR1 is een optogenetisch hulpmiddel dat het uitschakelen van hartactiviteit mogelijk maakt. Deze techniek is volledig toepasbaar op andere onderzoeksgebieden zoals gladde en eencellige spiercelstudies. Hoewel dit protocol niet kan worden gebruikt voor een hoge doorvoer screening, het biedt een middel voor de uitgebreide analyse van cardiomyocyte elektrische en mechanische functie.

Zoals het gezegde luidt, zegt een foto meer dan duizend woorden. Hoeveel meer informatie kunnen we in video overbrengen? Sommige van onze tools en technieken die betrokken zijn bij enkele myocyte stretching en in sonde voorbereiding zijn zeer ingewikkeld en het is veel gemakkelijker om ze over te brengen in een video in vergelijking met een beschrijving.

Nadat het bloed is gewassen uit de zoutoplossing geperfuseerd hart van een negen tot 10 weken oud Nieuw-Zeelands wit konijn, schakel het perfusate om naar een laag calcium, hoog kaliumoplossing en doorsneed het hart nog twee minuten nadat het hart stopt met kloppen. Doorsloop de enzymoplossing, begin met het opnieuw circuleren van de enzymoplossing terug in het reservoir na twee minuten spijsvertering, en verlaag de snelheid tot 16 milliliter per minuut na vijf minuten van de spijsvertering. Zodra het weefsel lijkt zacht na 40-50 minuten van de spijsvertering, snijd het hart van de canule en onmiddellijk plaats het hart in het blokkeren van oplossing.

Voeg blokkeren oplossing totdat het weefsel volledig bedekt is. Snijd de rechter ventrikel en septum af en scheid de linker hartkamer. Verwijder de papillaire spieren en gebruik fijne tangen en een pipet om het weefsel voorzichtig uit elkaar te trekken om de cellen door mechanische dissociatie vrij te laten.

Filtreer de celsuspensie door een gaas met een millimeter kwakij en sediment de cellen door centrifugatie. Dan resuspend de cardiomyocyte pellet in verse blokkeren oplossing. Voor een patch klem experiment, coat autoclaved coverslips in een petrischaaltje met 100 microgram per milliliter laminine vlak voor de celcultuur.

Voor koolstofvezel experiment, coat Petri gerechten met 0,12 gram per milliliter poly-HEMA in een 95-tot-vijf ethanol-to-water oplossing. Tien tot 15 minuten na het hersuspenten van de cardiomyocyten, verwijder de supernatant en resuspend de cellen in cultuurmedium. Na het tellen, zaad de cellen op een coverslip in een petrischaaltje op een doeldichtheid van 1,75 keer 10 tot de vier cellen per milliliter.

Broed de culturen drie tot vier uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Vervang aan het einde van de incubatie het medium uit de coverslipculturen door vers medium met adenovirus type vijf codering voor GtACR1-eGFP bij een veelheid van infectie van 75. Breng de culturen 48 uur terug naar de couveuse.

Voor het uitvoeren van een patch klem experiment, gebruik maken van een micropipette trekker te trekken 1,7 tot 2,5 megaohm patch pipetten uit soda kalk glas haarvaten en initialiseren van de data-acquisitie software. Plaats een coverslip met cellen in de meetkamer met externe oplossing en selecteer de cardiomyocyte op basis van de eGFP-fluorescentie. Vul vervolgens een patchpipet met interne oplossing en bevestig de pipet aan de pipethouder die de zilverchloride gecoate zilveropnamedraad in de interne oplossing plaatst.

Stel de membraantest in om 10 millivoltpulsen gedurende 15 milliseconden toe te passen met een basislijn van nul millivolt. Na het bereiken van de cel-aangesloten configuratie, overschakelen naar hele cel modus met een bedrijf potentieel van min 60 millivolts in de data-acquisitie software. Breng vervolgens voorzichtig negatieve druk uit om toegang te krijgen tot de hele celconfiguratie door het membraan te scheuren.

Een succesvolle breuk zal worden aangetoond door een onmiddellijke toename van de gemeten capaciteit. Neem fotoactivatieprotocollen op in de spanningsklemmodus bij min 74 millivolt met lichtpulsen van 300 milliseconden of actiemogelijkheden in de huidige klemmodus bij nul picoampere. Om de koolstofvezels te produceren, monteer je eerst de pipet op de pipethouders van de trekker.

Trek de glazen haarvaten in twee pipetten met een totale taps toelopende lengte van ongeveer 11 millimeter en een uiteindelijke binnendiameter van ongeveer 30 micrometer. Gebruik vervolgens een stereomicroscoop om een capillaire in de oriëntatiecirkel uit te lijnen en buig deze tot 45 graden door met een bender naar beneden te duwen op het puntje van de capillaire. Verwarm de gloeidraad totdat de capillaire de hoek van 45 graden behoudt, zelfs nadat de bender is verwijderd.

Na het buigen van de capillaire, gebruik fijne tang uitgerust met zachte buizen om een koolstofvezel uit de buis te nemen en in de fijne punt van de capillaire te passen. Duw de vezel in de capillaire naar de bocht. Snijd de koolstofvezels, zodat ze project twee milliliter uit het puntje van de capillaire en gebruik cyanoacrylaat lijm om de vezels vast te stellen aan het voorste gedeelte van elke capillaire.

Om de vezels te kalibreren, bevestig een capillaire aan een houder gecontroleerd door een micromanipulator en een piëzo motor. Beweeg de capillaire naar de sensor en lijn deze uit ten opzichte van de sensor. Plaats de punt van de vezel in contact met de krachtsensor zonder enige kracht te produceren.

De totale beweging van de piëzomotor is 60 micrometer. Verplaats de piëzomotor in zes stappen van 10 micrometer naar de krachtsensor. De sensor heeft een gevoeligheid van 0,05 millinewton per volt en een krachtbereik van nul tot 0,5 millinewton.

Lees de gemeten spanning voor elke stap uit en verwijder de koolstofvezel uit de sensor. Om de kracht van het oplopen van cardiomyocyten vast te leggen, bedekt u het oppervlak van een coverglass met Poly-HEMA en plaatst u deze in de meetkamer. Vul de kamer met externe badoplossing.

Bevestig beide koolstofvezel geladen haarvaten aan het stadium micromanipulator en lijn ze onder een hoek, zodat de koolstofvezels zijn in de buurt horizontaal aan het oppervlak van de meetkamer. Om te controleren of de vezels correct zijn uitgelijnd, focus op het oppervlak van de meetkamer, lager de eerste vezel, en beweeg de vezel horizontaal. De punt van de vezel moet glijden op het oppervlak van de meetkamer.

Volg dezelfde procedure voor de tweede vezel. Met de lichten uit, voeg een paar druppels gekweekte cel suspensie aan de kamer en toe te passen korte groene licht pulsen om cellen die contract in reactie op het groene licht stimulatie te selecteren. Om de eerste vezel te bevestigen, comprimeer de cel voorzichtig door de vezel te verlagen en vervolgens de druk los te laten.

Bevestig de tweede vezel parallel aan de eerste aan het andere uiteinde van de cardiomyocyte om een maximum aantal sarcomeres tussen de twee vezels te hebben. Nadat beide vezels zijn bevestigd, til de vezels op zodat de cel niet meer in contact komt met het kameroppervlak. Breng de sarcomeres in beeld, stel het sarcomere lengte tracking venster tussen de vezels in en gebruik de randdetectiemodule om de vezelbuiging te volgen.

Stel de detectiegebieden in met de rode en groene vensters en definieer een drempelwaarde bij de eerste afgeleide van het spoor van de lichtintensiteit. Optisch tempo van de cel, terwijl het bijhouden van sarcomere lengte en vezel buigen. In dit geval, we tempo op 0,25 hertz.

Na het opnemen van ten minste 15 optisch opgewekte weeën, veld stimuleren van de cel elektrisch. Zoek de drempel voor het uitlokken van de weeën en breng 1,5 keer de drempelspanning voor elektrische pacing. Voor een remmingsprotocol, pas elektrische stimuli toe om samentrekkingen uit te lokken en stel de cel vervolgens bloot aan een aanhoudende lichtpuls bij verschillende lichtintensiteiten.

Nota ten minste 15 weeën na licht-geïnduceerde remming. GtACR1 komt tot uiting in gekweekte konijn cardiomyocyten. GtACR1 fotoactiviteit bij een lichtintensiteit van vier milliwatt per millimeter kwadraat gedurende 300 milliseconden resulteert in grote naar binnen gerichte stromen bij min 74 millivolt met een gemeten piekstroom van 245 picoampere.

In dit representatieve experiment werden actiemogelijkheden elektrisch geactiveerd met huidige injecties die 1,5 keer de drempelwaarde hebben of optisch met lichtpulsen van 10 milliseconden. Optisch tempo cardiomyocyten aangetoond een tragere actie potentieel begin. Elektrisch geactiveerde werking potentialen werden geremd onder aanhoudende licht.

Hogere stroominjecties en 1,5 keer de drempel tijdens de aanhoudende lichte toepassing ontlokken ook geen actiemogelijkheden. De cardiomyocyte genereerde een samentrekkingskracht van 232 micronewton per millimeter in het kwadraat op elektrische pacing en 261 micronewton per millimeter kwadraat na optische pacing. Langdurige groene lichtpulsen remden de samentrekkingen met de post-inhibitie reoccuring contracties genereren van een lagere contractiele kracht in overeenstemming met de diastolische calcium verlies van konijn cardiomyocyten.

We raden aan om de technieken te oefenen voordat u een experiment uitvoert, vooral omdat het positioneren van de microsonden in het donker een uitdaging kan zijn. is zeer belangrijk bij het analyseren van cardiomyocyte contractiliteit als het kan invloed hebben op de productie van kracht en ontspanning. Verschillende naladingen kunnen ook worden toegepast voor isotone en auxotonic contractie analyse.

Deze technieken maken karakterisering van de biofysische effecten van het activeren van nieuw ontwikkelde optogenetische actuatoren in cardiomyocyten mogelijk, wat cruciaal is voor het selecteren van het meest geschikte optogenetische gereedschap voor elk experiment. Houd er rekening mee dat adenovirustransductie en alle stappen na de transductie moeten worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau II-omstandigheden.