Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Dit protocol zal u laten zien hoe microglia vlek, uitvoeren van kwantitatieve dichtheid en morfologie analyse, alsmede om macrofaag infiltratie in de hersenen te kwantificeren. Deze techniek stelt de onderzoeker in staat om veranderingen in microgliadistributie en morfologie op een kwantitatieve manier te meten en microglia te onderscheiden van het infiltreren van macrofagen Dit analyseprotocol kan eenvoudig worden toegepast op andere diermodellen om veranderingen in microgliadistributie en morfologie te meten waar anti-IBA1 en anti-TMEM119 antilichamen beschikbaar zijn. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de celtellingen en sporen die blind zijn voor de experimentele aandoening uit te voeren en consistent te zijn in de manier waarop deze procedure wordt uitgevoerd.

Open om deze procedure te starten, open een beeldverwerkingsprogramma zoals Fiji of ImageJ dat de dichtstbijzijnde buurmanafstandplug-in heeft geïnstalleerd. Open de 20X-afbeelding als de schaal zich in de metagegevens van het bestand bevindt en niet automatisch is ingesteld vanaf de metagegevens. Selecteer op de menubalk Analyseren, Schaal instellen en voer de juiste gegevens in.

Als u de schaal handmatig wilt instellen op basis van een schaal die op de afbeelding is afgedrukt, selecteert u het gereedschap Rechte lijn. Plaats de cursor op de rand van de weegschaal en teken tijdens het indrukken van de Shift-toets een lijn die zo dicht mogelijk bij de schaal op de afbeelding komt. Selecteer Analyseren, Schaal instellen.

Er verschijnt een venster en plaatst de juiste bekende afstand en lengte-eenheid om de pixel per lengte-eenheid te bepalen en op OK te klikken. Selecteer vervolgens Afbeelding, Kleur, Samengesteld maken om een samengestelde afbeelding van alle kanalen te maken. Selecteer Analyseren op de menubalk, Stel Metingen in. Check Area, Centroid en Perimeter.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu Omleiden naar het bestand openen en klik op OK. Ga naar Afbeelding, Kleur, Kanaalgereedschap om het gereedschap Kanaal te openen. Gebruik het gereedschap Selectie uit de vrije hand om een ruwe omtrek rond het interessegebied te tekenen. Dubbelklik op het gereedschap Ovaal op de gereedschapsbalk om het gereedschap Selectiepenseel in te schakelen.

Controleer of het selectiepenseel selectiepenseel inschakelen is ingeschakeld en klik op OK. Met het selectiepenseel past u de omtrek aan het beste bij het interessegebied en drukt u vervolgens op T op het toetsenbord in dit gebied naar pijl Y-manager. Selecteer Analyseren, meten of drukken op de M-toets en het venster Resultaten wordt weergegeven. Kopieer en plak de resultaten in een gegevensblad en sla de informatie over het gebied op.

Nadat u het gebied van het interessegebied hebt gekopieerd, baseert u de informatie uit het venster Resultaten door erop te klikken en op de toets Backspace te drukken. Selecteer het venster ROI Manager, selecteer de ROI Trace en wijzig de naam die overeenkomt met de naam van de afbeelding door op Naam wijzigen te drukken. Klik op OK en klik met de rechtermuisknop op de nieuwe naam van de ROI Trace en sla op.

Dubbelklik op het gereedschap Penseel op de gereedschapsbalk. Selecteer de kleur zwart en de penseelgrootte van 10. Controleer of de optie Paint on overlay niet is ingeschakeld.

Plaats in het TMEM119-kanaal voorzichtig een zwarte stip op het midden van de soma voor elke TMEM119 positieve microglia. Plaats een witte stip in het midden van de cellen die niet positief zijn voor TMEM119. Herhaal dezelfde procedure voor alle cellen in het gebied van belang.

Selecteer vervolgens Afbeelding, Kleur, Gesplitst kanaal, er verschijnt een venster voor elk kanaal. Identificeer het kanaal met de dot-annotaties en sluit de andere twee vensters. Als u de nieuwe afbeelding van het gesplitste kanaal wilt omleiden, gaat u naar Analyseren, Metingen instellen.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu Omleiden naar de optie Kanaalafbeelding splitsen en klik op OK. Selecteer vervolgens Afbeelding, Tekst, acht-bits. Ga naar Afbeelding aanpassen en selecteer Drempelwaarde. Pas de schuifregelaars helemaal naar links in beide balken aan.

Hierdoor blijven alleen de zwarte stippen achter die nu wit verschijnen. Selecteer het interessegebied in het venster ROI Manager. Selecteer Analyseren in de menubalk analyseren, Deeltjes analyseren.

Voer in het tekstvak voor Grootte een tot en met 20 in. Het vak voor Pixel-eenheden moet niet worden aangevinkt terwijl het vakje voor weergaveresultaten, Samenvatten en Toevoegen aan beheer moet worden aangevinkt. Klik op OK om het overzichtsvenster weer te geven waarin het aantal punten wordt weergegeven.

Kopieer en plak deze informatie naar het gegevensblad. Selecteer vervolgens plug-ins NND om het NND-venster weer te geven. Elk getal vertegenwoordigt de afstand die elke microglia heeft tot de dichtstbijzijnde naburige microglia.

Kopieer en plak al deze gegevens naar het gegevensblad. Ga terug naar het venster Drempel en pas de bovenste schuifregelaar helemaal naar rechts aan, waardoor alle witte stippen zichtbaar blijven en nu wit worden weergegeven. Selecteer Analyseren, Deeltjes analyseren om het pop-upvenster Analyseren weer te geven.

Klik op OK om het venster Overzicht weer te geven dat het aantal punten geeft. Kopieer en plak deze informatie in het gegevensblad. Ga naar DE ROI Manager en selecteer alle punten.

Klik vervolgens met de rechtermuisknop en Sla op met de naam van de afbeelding. Hierdoor kunnen alle punten in een ZIP-bestand worden opgeslagen. Open eerst de 4DX-afbeeldingsbestanden.

Er verschijnt een pop-upvenster met de vraag of de afbeeldingen in een stapel moeten worden geopend. Klik op OK. Selecteer vervolgens Afbeelding, Stapels, ZProject om het venster Z-projectie te openen. Voeg alle segmenten van het eerste tot en met het laatste segment toe.

Controleer of de maximale intensiteit is geselecteerd onder Projectietype en klik op OK. Klik op het nieuwe venster dat het ZProject bevat. Selecteer Afbeelding, Kleuren, Gesplitste kanalen en voer de sporen uit op de afbeeldingen van het IBA1-kanaal. Selecteer Analyseren in de menubalk, Stel Metingen in.

Controleer het gebied, Centroid en Perimeter. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Omleiden het geopende bestand en klik op OK. Als u de schaal handmatig wilt instellen op basis van een schaal die op de afbeelding is afgedrukt, selecteert u het gereedschap Rechte lijn. Plaats de cursor op de rand van de weegschaal en teken tijdens het indrukken van de Shift-toets een lijn die zo dicht mogelijk bij de schaal op de afbeelding komt.

Selecteer Analyseren, Schaal instellen. Er verschijnt een raam. Voer de juiste bekende afstand en lengte-eenheid in om de eenheid Pixels per lengte te bepalen en klik op OK. Als u de somagrootte in het IBA1-kanaal wilt meten, tekent u een ruwe omtrek van de soma met het gereedschap Vrije handselectie.

Dubbelklik op het gereedschap Ovaal op de werkbalk om het gereedschap Selectiepenseel in te schakelen. Controleer of het selectiepenseel selectiepenseel inschakelen is ingeschakeld en klik op OK. Met het selectiepenseel past u het spoor zo goed mogelijk aan de soma. Inzoomen zorgt voor precisie tijdens deze stap.

Druk vervolgens op de T-toets om het soma-trace toe te voegen aan de ROI Manager. Selecteer Analyseren, meten of druk op de M-toets om de resultaten weer te geven. Kopieer en plak deze resultaten op een gegevensblad.

Ga naar het venster ROI Manager, selecteer het interessegebied en wijzig de naam die overeenkomt met de naam van de afbeelding door op Naam wijzigen te drukken. Klik met de rechtermuisknop op het omgedoopte interessegebied en klik op Opslaan. Zorg ervoor dat de naam aangeeft dat de tracering voor soma is en sla het bestand op.

Als u het arborisatiegebied in het IBA1-kanaal wilt meten, selecteert u eerst het gereedschap Veelhoekselectie. Klik op de microgliale proces extremiteit met het gereedschap om de veelhoekvorm te starten. Ga rond de microglia door te klikken op de uiteinden van elk proces extremiteit om een veelhoek die het beste vertegenwoordigt het gebied dat door de microgliale prieleïsten vertegenwoordigt vormen.

Wanneer de veelhoek is voltooid, klikt u op het beginpunt om deze te sluiten. Druk vervolgens op de T-toets om het spoor toe te voegen aan de ROI Manager. Selecteer Analyseren, meten of drukken op de M-toets om de gegevens toe te voegen aan het venster Resultaten.

Kopieer en plak deze gegevens op het gegevensblad. Als u de informatie over het arborisatiegebied wilt opslaan, gaat u naar het venster ROI Manager, selecteert u het interessegebied en wijzigt u de naam die overeenkomt met de naam van de afbeelding door op Naam wijzigen te drukken. Klik met de rechtermuisknop op het omgedoopte interessegebied en klik op Opslaan.

Zorg ervoor dat de naam aangeeft dat de tracering is voor het maken van het bestand en het bestand opslaat. Deze studie beschreef de stapsgewijze workflow voor de immunofluorescente co-kleuring van IBA1 en TMEM119 en voor de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie en van perifere myeloïde celinfiltratie in muishersenweefsel. Fluorescentie microscopie wordt gebruikt om beeld van de co-etikettering van microglia met behulp van IBA1 en TMEM119 in de coronale sectie van de dorsale hippocampus op 20X vergroting.

Een succesvolle kleuring onthult microgliale cellichamen en hun fijne processen. De kleuring maakt het mogelijk de microgliale dichtheid en distributie te bepalen en microgliaclusters te identificeren en macrofagen te infiltreren. Confocale microscopie wordt gebruikt om de stapsgewijze microgliale arborisatie traceringsprocedure bij 40X vergroting in beeld te brengen.

Deze representatieve resultaten tonen IBA1 positieve en TMEM119 positieve microglia evenals een voorbeeld van cel lichaam traceren. Het is belangrijk om consistent te zijn bij het tellen van cellen en om aandacht te besteden aan beide signalen van IBA1 en TMEM119. Deze techniek stelt de onderzoeker in staat om gebieden van de hersenen te identificeren die worden beïnvloed door een bepaalde stimulus die vervolgens dieper kan worden bestudeerd met complementaire technieken.