Name: Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een specifieke RT-PCR-methode voor detectie van HIV-1 antisense ASP RNA-transcripten bij patiënten met behulp van gebiotinyleerde primers en hoge RNA-denaturatietemperaturen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick en Matthieu Perreau om altijd beschikbaar te zijn om ons werk en alle mensen in het laboratorium voor AIDS-immunopathogenese te bespreken voor hun kostbare technische hulp. We willen ook John en Aaron Weddle van VSB Associated Inc. bedanken die hebben bijgedragen aan uitstekende kunstwerken. Tot slot, veel speciale dank aan alle patiënten, zonder wie dit werk niet mogelijk zou zijn geweest. Dit werk ontving geen specifieke subsidie van een financierings instantie.

Deze studie werd goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van het Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. infectie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) met HIV-1HXB2 stam
<ol><li>
Dag 1: PBMCs STIMULATIE
	<ol>
<li>Isoleer PBMCs van een gezonde donateurs Buffy vacht.</li>
		<li>Tellen en respenderen PBMCs in een concentratie van 1x106/ml in het complete Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine (R-10) bevat; met toevoeging van 50 U/ml Interleukine-2 (Il-2) en 3 μg/ml Phytohemagglutinine (PHA).</li>
		<li>Pipet op en neer en Splits de cellen in 2 6-well plates (3 mL celsuspensie/well).</li>
		<li>Incuberen gedurende 3 dagen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 3: PBMCs-infectie Opmerking: gebruik een van de twee platen zoals in stap 1.1.3 als negatieve controle (deze cellen niet infecteren). Let op: Voer de gehele procedure uit in een laboratorium voor bioveiligheid niveau III (P3).<ol>
<li>Pool PBMCs van de ene plaat in een 50 mL Falcon Tube en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en regeer de cellen in 2,2 mL R-10 bevattende 20 e/mL IL-2 en 2 μg/mL polybrene.</li>
		<li>Ontdooien injectieflacons met het HIV-1HXB2 virus en voeg 1,8 ml virale suspensie (0,376 ng/μL) toe aan de cellen.</li>
		<li>Inbroed de cellen voor 2 uur bij 37 °C, zachtjes zwenkende de buis elke 30 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g .</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en regeer de cellen op 1x106/ml in R-10 met Il-2 (50 U/ml).</li>
		<li>Breng de celsuspensie over naar een 24-put-plaat met een concentratie van 1 mL/goed en inbroed gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Oogst elke dag 1 goed en breng de cellen over naar 1,5 mL Tube (gelabeld met de dag van de infectie). Opmerking: Breng vóór het centrifugeren 150 μL celsuspensie over naar een Flowcytometrie buis voor PBMCs infectie kwaliteitscontrole (zie stap 1,3)</li>
		<li>Centrifugeer de buisjes op 400 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Vries de celpellets bij-80 °C tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PBMCs-infectie: kwaliteitscontrole
	<ol>
<li>Verzamel voor elke dag van besmetting 150 μL geïnfecteerde PBMCs en breng ze over in een Flowcytometrie buis.</li>
		<li>Voeg 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g .</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL PBS met 1 μL Aqua Live/Dead Dye (voorheen verdund 1:10 met PBS) toe.</li>
		<li>Incuberen bij 4 °C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Voeg 1 mL PBS toe, centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 250 μL fixatie/Permeabilization oplossing toe en incuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Voeg 1 mL 1x Perm/Wash buffer toe (10x stockoplossing met zowel FBS en saponine verdund 1:10) en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL PBS met HIV Gag p24 fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd antilichaam (verdund 1:10) toe.</li>
		<li>Inincuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Voeg 1 mL PBS toe, centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 150 μL x CellFIX toe (10x stockoplossing met 10% formaldehyde, 3,55% methanol, 0,93% natrium-natriumazide-verdund 1:10) en analyseer cellen door Flowcytometrie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. stimulatie van humane CD4 + T-cellen met anti-CD3/CD28-antilichamen
<ol><li>Isoleer CD4 + T-cellen van PBMCs van zowel HIV-1 geïnfecteerde patiënten als gezonde donoren.</li>
	<li>Bereid de humane anti-CD3/CD28 antilichaammix door het verdunen van anti-CD3 (1:100) en anti-CD28 (1:50) in PBS.</li>
	<li>Mantel een 48-Wells plaat door toevoeging van 200 μL antilichaammix per putje aan een passend aantal putjes en inincuberen bij 37 °C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Aspireren de antilichaam oplossing en voeg 1 mL CD4 + T-cellen toe op 1x106/ml aan de anti-CD3/CD28-antilichaam-gecoate putjes. Opmerking: stimuleren van CD4 + T-cellen tot 5 dagen.</li>
</ol>3. omgekeerde transcriptie
Opmerking: om patiënt-specifieke primers te verkrijgen, werd proviral DNA geïsoleerd uit CD4 + T-cellen van elke patiënt versterkt met behulp van HIV-1HXB2 pan ASP-primers. Patiënt specifieke primers werden ontworpen met behulp van de proviral sequentie intern aan de pan ASP primers. Alle primers en sondes die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 2.
<ol><li>
Isoleren van totaal RNA uit cellen
	<ol>
<li>Kwantiseer RNA en Elimineer DNA-besmetting door monsters te behandelen met DNase.</li>
		<li>RT-reacties uitvoeren in een volume van 50 μL. Breng 0,1-1 μg totaal RNA over in een passend aantal putjes van een 96-well PCR-plaat. Bereid het RNA-mengsel door de volgende componenten aan het RNA toe te voegen: 5 μL biotinyleerd ASP reverse primer (20 μM) 2,5 μL deoxynucleotide-trifosfaten (Dntp's) (10 mM) 25 μL diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld gedistilleerd water (dH2O). Bereid de endogene RT-controles voor door 5 μL Nuclease vrij water toe te voegen in plaats van de biotinyleerd ASP reverse primer.</li>
		<li>Plaats de 96 goed PCR-plaat in een thermocycler en verwarm het RNA-mengsel tot 94 °C gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Onmiddellijk afkoelen van het RNA mengsel in ijskoud water voor ten minste 1 min.</li>
		<li>Bereid het reactiemengsel door de volgende componenten toe te voegen aan een tube van 1,5 mL (Bereken het totale aantal monsters plus 1): 10 μL 5x RT buffer 2,5 μL 0,1 M, 1,4-dithiothreitol (DTT) 2,5 μL RNase-uit (40 eenheden/μL) 2,5 μL RT-enzym (200 eenheden/μL)</li>
		<li>Breng 17,5 μL van dit mengsel over in elk van de RNA-bevattende putjes. Bereid de RT-minus Controls ter vervanging van reverse transcriptase met 2,5 μL Nuclease vrij water.</li>
		<li>Meng zachtjes en inincuberen de plaat bij 55 °C gedurende 60 minuten met behulp van een Thermocycler.</li>
		<li>Inactiveren van de reacties door verwarmen bij 70 °C gedurende 15 minuten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. affiniteits zuivering van ASP biotinyleerd cDNA
Opmerking: Reinig de RT-minus reacties niet.
<ol><li>Bereid 1 L 2x was-/bindings buffer met 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 2 M NaCl. Filter de oplossing.<ol>
<li>Bereid 50 mL 1x was-/bindings buffer voor met PCR-grade water.</li>
		<li>Gebruik voor elke reactie 10 μL streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen. Op basis van het aantal reacties, breng een geschikte hoeveelheid kralen over naar een tube van 1,5 mL.</li>
		<li>Was de parels door het toevoegen van een gelijk volume van 2x was/bindende buffer en Vortex voor 15 s.</li>
		<li>Plaats de buis in een magnetisch scheidings rek en incuberen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de supernatant zonder de kralen te storen en voeg hetzelfde volume wassen/binden 2x buffer als het aanvankelijke volume van kralen.</li>
		<li>Vortex voor 30 s en breng 10 μL van de kralen suspensie over naar een geschikt aantal 1,5 mL tubes.</li>
		<li>Plaats de buisjes in een magnetisch scheidings rek en inbroed gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL wassen/binden 2x buffer toe.</li>
		<li>Voeg 50 μL biotinyleerd cDNA toe aan de overeenkomstige buisjes met de parels.</li>
		<li>Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur die zachtjes draait.</li>
		<li>Scheid de parels van de supernatant door een magneet scheidings rek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Was de parels door toevoeging van 200 μL 1x was-/bindings buffer. Plaats de buisjes in een magneet scheidings rek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Herhaal dit twee keer.</li>
		<li>Rebreng de parels in 10 μL PCR-klasse water.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. standaard PCR-
NB: het doel van de standaard PCR is de volledige ORF van het ASP-gen te versterken. De versterkings producten worden vervolgens gekloond in pCR 2.1 plasmide om standaard curves te ontwikkelen voor ASP-RNA-kwantificering door real-time PCR (zie paragraaf real time PCR).
<ol><li>Voer standaard PCRs uit in een totaal volume van 50 μL. bereid een geschikt volume PCR Master mix voor (aantal samples plus 1). Voeg voor elk monster de volgende componenten toe aan een tube van 1,5 mL: 1 μL van 10 μM ASP-primers (vooruit en achteruit) 1 μL van 10 mM Dntp's Magnesium chloride (MgCl2) (concentratie is afhankelijk van de gebruikte primers) dH2O tot een eindvolume van 49 μL<ol>
<li>Meng goed, draai de inhoud snel af en breng de 49 μL/put van de PCR-Master mix over naar een 96-well PCR-plaat.</li>
		<li>Draai de buizen met de kralen die worden gebruikt voor ASP cDNA-affiniteits zuivering voor 15 sec. zorgvuldig om.</li>
		<li>Voeg 1 μL kralen toe aan de overeenkomstige putjes en voer de PCR uit met het volgende programma: 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 sec. en 68 °C voor 40 s, dan 68 °C gedurende 7 min.</li>
		<li>Scheid de PCR-producten op 1% agarose gel, snijd de banden en kloon de versterkte producten in pCR 2.1 plasmide.</li>
		<li>Volgorde en analyseer de sequenties van elke kloon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. real-time kwantitatieve PCR (qPCR)
Opmerking: ontwikkel patiënt-specifieke primers en probes met behulp van de aanpak beschreven in stap 3 "reverse transcriptie". Voor qPCR zijn ASP-plasmide verdunningen voor standaard curven. Plasmiden die patiëntspecifieke wisselplaten bevatten, worden ontwikkeld zoals vermeld in de notitie aan het begin van stap 5 "standaard PCR".
<ol><li>Bereid de standaard curve met 1:10 ASP plasmide seriële verdunningen vanaf 3 x 106 kopieën/μl tot 3 kopieën/μl.<ol>
<li>
Eerste ronde PCR (pre-amp). Voer reacties uit in een totaal volume van 25 μL. bereid een geschikt volume PCR Master mix voor (aantal samples plus 1). Voeg voor elk monster de volgende componenten toe aan een tube van 1,5 mL: 0,5 μL ASP-of env primer mix (eindconcentratie 0,2 μM per stuk) (vooruit en achteruit) 0,5 μL dNTPs mix (eindconcentratie 0,2 mM per stuk) MgCl2 (concentratie hangt af van de primer paren) dH2O tot een eindvolume van 24 μL</li>
		<li>Breng 24 μL PCR-Master mix over naar een geschikt aantal putjes van een 96-well PCR-plaat.</li>
		<li>Draai de buisjes met de parels voorzichtig om met de cDNA voor 15 sec.</li>
		<li>Voeg 1 μL kralen toe aan de bijbehorende putjes. Doe hetzelfde voor plasmide verdunningen.</li>
		<li>Voer de PCR uit met het volgende algoritme: denaturatie gedurende 2 min bij 95 °C; 30 s bij 95 °C, 30 s bij 55 °C, 40 s bij 68 °C gedurende 18 cycli; verlenging bij 68 °C gedurende 7 minuten.</li>
		<li>Verdun de eerste ronde PCRs-Reacties 1:5 met PCR-grade water.</li>
		<li>
Tweede ronde qPCR. Voer reacties uit in een totaal volume van 20 μL. bereid een geschikt volume PCR Master mix voor (aantal samples plus 1). Voeg voor elk monster de volgende componenten toe aan een tube van 1,5 mL: 1,8 μL 10 μM primers (vooruit en achteruit) 1 μL van 5 μM sonde 6,2 μL dH2O</li>
		<li>Breng 19 μL qPCR Master mix over in een passend aantal putjes van een 96-well qPCR-plaat en voeg 1 μL van de verdunde eerste ronde PCR-reacties toe aan de corresponderende putjes. Doe hetzelfde voor de plasmide verdunningen.</li>
		<li>Voer de qPCR uit met het volgende algoritme: denaturatie gedurende 10 min bij 95 °C; 15 s bij 95 °C, 1 minuut bij 60 °C voor 40 cycli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li>
<li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv%2B+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li>
<li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li>
<li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74(2011).</li>
<li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71(2007).</li>
<li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38(2012).</li>
<li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li>
<li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li>
<li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li>
<li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).</li>
<li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li>
<li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).</li>
<li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antisense+protein+%28ASP%29+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li>
<li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells%3A+improvement+by+tagged+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221(2009).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li>
<li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li>
<li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+%28HTLVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.

In dit rapport beschrijven we een streng-specifieke RT assay toegepast op de detectie van ASP-RNA in CD4 + T-cellen geïsoleerd van personen geïnfecteerd met HIV-1. Het optreden van niet-specifieke priming tijdens RT belemmert de detectie van RNA-transcripten met de juiste polariteit, wat leidt tot een verkeerde interpretatie van de resultaten. Eerdere groepen hebben verschillende strategieën ontwikkeld die gericht zijn op het voorkomen van primer-onafhankelijke cDNA-synthese tijdens de RT-reactie. Het taggen van de omgek...

Het antisense protein (ASP)-gen is een open Lees frame (ORF) dat zich bevindt op de negatieve streng van het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) envelop (env)-gen, dat de kruising gp120/gp411beslaat. In de afgelopen dertig jaar hebben verschillende rapporten aangetoond dat het HIV ASP-gen inderdaad is getranscribeerd en vertaald2,3,4,5,6,7,8,9. Hoewel ASP antisense transcripten volledig in vitrozijn gekarakteriseerd, was tot voor kort nog informatie over de werkelijke productie van ASP-RNA bij patiënten verdwenen.
De opeenvolging van ASP is omgekeerd en complementair aan env. Dit vormt een belangrijk obstakel wanneer u transcripten voor ASP probeert te detecteren. Standaard reverse transcriptie-polymerase chain reaction (RT-PCR) methoden gebruiken genspecifieke antisense primers om complementaire Dna's (Cdna's) van de juiste polariteit te synthetiseren. Deze aanpak staat echter niet toe om de oriëntatie (zin of antisense) van de initiële RNA-template te bepalen, aangezien RNA-haarspelden of lussen in beide richtingen kunnen worden priem bij afwezigheid van primers10, een fenomeen dat bekend staat als RT Self-priming. De meeste ASP-onderzoekers gaan het probleem van RT Self-priming aan met behulp van primers gelabeld met sequenties die niet gerelateerd zijn aan HIV-111,12. Deze strategie elimineert echter niet het optreden van het fenomeen en kan leiden tot een mogelijke overname van niet-specifieke Cdna's in de PCR11.
We hebben onlangs een nieuwe strand-specifieke RT-PCR-test ontwikkeld voor de studie van antisense RNA en we hebben het gebruikt voor ASP-RNA-detectie in een cohort van zes HIV-geïnfecteerde patiënten, zoals weergegeven in tabel 1. De hieronder beschreven procedure is eerder gepubliceerd door Antonio Mancarella et al.13. In ons protocol vermijden we de productie van niet-specifieke Cdna's door een dubbele aanpak. Ten eerste elimineren we RNA-secundaire structuren door denaturerende RNA op hoge temperatuur (94 ° c), en ten tweede, we reverse transcriberen ASP RNA met behulp van een biotinyleerd ASP-specifieke primer en affiniteit-zuiveren van de resulterende cDNA. Door deze aanpak kunnen we alleen onze doel-cDNA versterken, omdat andere niet-specifieke RT-producten worden verhinderd om te worden gegenereerd (denaturatie van hoge temperaturen van RNA) of geëlimineerd vóór PCR (affiniteits zuivering).

<table><tbody><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set (100 mM)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biowest</td><td>S1010-500</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>6604665</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-743</td><td></td></tr><tr><td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61764-1MG</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>L34967</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD28</td><td>Becton Dickinson</td><td>55725</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD3</td><td>Becton Dickinson</td><td>55329</td><td></td></tr><tr><td>Primers and Probes</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>K450001</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&micro;L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke rt-pcr

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Bij retrovirussen is antisense transcriptie beschreven in zowel humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) als humaan T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). In HIV-1 bevindt het antisense Protein ASP-gen zich op de negatieve streng van env, in het Lees frame-2, dat de kruising gp120/gp41 beslaat. In de zin oriëntatie overlapt het 3 ' einde van het open Lees frame van ASP met gp120 hypervariable-regio's v4 en V5. De studie van ASP-RNA is gedwarslanteerd door een fenomeen dat bekend staat als RT-Self-priming, waarbij RNA-secundaire structuren de mogelijkheid hebben om RT bij afwezigheid van de specifieke primer te prime, waardoor niet-specifieke Cdna's worden gegenereerd. Het gecombineerde gebruik van hoge RNA-denaturatie met biotinyleerd reverse primers in de RT-reactie, samen met affiniteits zuivering van de cDNA op streptavidin gecoate magnetische kralen, heeft ons toegestaan om selectief te versterken ASP-RNA in CD4 + T cellen afgeleid van individuen geïnfecteerd met HIV-1. Onze methode is relatief voordelig, eenvoudig uit te voeren, zeer betrouwbaar en gemakkelijk reproduceerbaar. In dit opzicht vertegenwoordigt het een krachtig hulpmiddel voor de studie van antisense transcriptie, niet alleen in HIV-1, maar ook in andere biologische systemen.

Hoge temperatuur RNA denaturatie gekoppeld aan affiniteit zuivering van biotinyleerd cDNA voorkomt versterking van niet-specifieke ASP-producten tijdens PCR in PBMCs geïnfecteerd in vitro en in CD4 + T-cellen geïsoleerd van patiënten. RT zelfaanzuigend is aangetoond tijdens omgekeerde transcriptie van antisense RNAS10,14,15,16,17. Om dit fenomeen te v...

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Conventionele RT-PCR's staan geen discriminatie toe tussen de zins- en anti-sense sequenties wanneer ze worden gebruikt om RNAs te detecteren die gecodeerd zijn door overlappende genen. Dit protocol maakt het mogelijk om specifiek anti-sense RNAs te detecteren. Het gebruik van een biotynylated primers samen met hoge RNA denaturatie temperaturen zorgt voor versterking van anti-sense cDNAs, het voorkomen van de vorming van niet-specifieke RT producten.We hebben deze methode gebruikt om aan te tonen dat ASP ofwel als een RNA anti-sense of een eiwit voorloper, het is een nieuw HIV-antigeen, doet het potentieel een nieuwe HIV-doel voor therapie. Deze methode kan worden toegepast op elk systeem, waarin anti-sense RNAs van overlappende genen kunnen worden gedetecteerd. Begin met het ontwerpen van patiëntspecifieke primers met behulp van de pro-virale DNA-sequentie intern aan de PanASP primers.Kwantificeer vervolgens het RNA en elimineer DNA-besmetting door monsters met DNase te behandelen. Breng tussen 0,1 en een microgram van de totale RNA in de juiste putten op een 96 goed PCR plaat. Stel vervolgens de omgekeerde transcriptie, of RT reactie, volgens manuscript richtingen.Bereid de endogene RT-besturingselementen door het toevoegen van vijf microliters van nuclease vrij water in plaats van de ASP omgekeerde primer. Leg de plaat in de thermocycler en verwarm het RNA gedurende vijf minuten tot 94 graden Celsius. Dan onmiddellijk afkoelen in ijswater voor ten minste een minuut.Bereid het reactiemengsel voor in een buis van 1,5 milliliter zoals beschreven in het tekstmanuscript en breng vervolgens 17,5 microliter over naar elk van het RNA met putten. RNA-denaturatie moet worden uitgevoerd bij 94 graden Celsius. Zonder totale denaturatie kunnen syntheses van niet-specifieke producten van sense RNA optreden, wat leidt tot versterking van niet-specifieke cDNA's.Meng de inhoud van de putten voorzichtig en broed de plaat op 55 graden Celsius gedurende 60 minuten. Activeer vervolgens de reacties door de plaat gedurende 15 minuten te verwarmen tot 70 graden Celsius. Bereid een liter 2X was- en bindingsbuffer volgens de handschriftaanwijzing en filter de oplossing.Bereid vervolgens 50 milliliter 1X was- en bindingsbuffer voor met pcr-water. Breng het juiste aantal streptavidin-geconjugeerde magnetische kralen over naar een buis van 1,5 milliliter en was ze vervolgens door een gelijk volume van 2X was- en bindingsbuffer toe te voegen en de buis gedurende 15 seconden te laten vortexen. Plaats de buis in een magnetisch scheidingsrek en broed deze gedurende drie minuten op kamertemperatuur.Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant zonder de kralen te storen en voeg hetzelfde volume van de 2X was- en bindingsbuffer toe als het initiële volume van de kralen. Vortex de kralen voor 30 seconden en breng 10 microliter van de suspensie naar een passend aantal van 1,5 milliliter buizen. Plaats de buizen in het magnetische scheidingsrek en broed ze drie minuten lang op kamertemperatuur.Gooi vervolgens de supernatant weg en voeg 50 microliter 2x was- en bindingsbuffer toe. Voeg 50 microliter biotynylated cDNA toe aan de overeenkomstige buizen met de kralen en broed ze gedurende 30 minuten terwijl ze zachtjes draaien. Na de incubatie, plaats de buizen op de magnetische scheiding rek gedurende drie minuten dan was de kralen met 200 microliters van 1X wassen en binden buffer, gevolgd door een drie minuten incubatie op de scheiding rack.Gooi de supernatant weg en herhaal de was twee keer. Dan, resuspend de kralen in 10 microliters van PCR-kwaliteit water. Bereid een passend volume van PCR Master Mix volgens het manuscript richtingen.Meng het goed en snel draai het naar beneden, dan overdracht 49 microliters per put naar een 96 goed PCR plaat. Voorzichtig vortex de buizen met de gezuiverde cDNA voor 15 seconden en voeg een microliter van de suspensie aan de overeenkomstige putten. Voer de PCR uit en scheid de producten op een 1%agarose gel.Snijd de banden uit de gel en kloon de versterkte producten in een PCR 2.1 plasmide. Sequentiële de klonen en analyseer elke reeks. De eerste RT-reacties werden uitgevoerd met de reguliere niet-biotynylated anti-sense primer en resulteerden in een succesvolle versterking van ASP.Echter, een band van hetzelfde moleculaire gewicht en primer minus controles werd ook versterkt. Om dit probleem te omzeilen, werd de specifieke anti-sense primer gelabeld met biotyn en de resulterende anti-sense cDNA werd gezuiverd voorafgaand aan PCR. Dit maakte het mogelijk om de ASP-sequentie te versterken met sterk verminderde verontreiniging van de niet-specifieke cDNA in de primer minus-controles.Verdere optimalisatie van deze methode werd bereikt door volledige denaturatie van RNA bij 94 graden Celsius voorafgaand aan RT, gevolgd door onmiddellijke koeling op ijswater, wat resulteerde in effectieve versterking van de ASP-band en geen niet-specifieke producten. De kinetiek van ASP RNA werd gemeten en CD4 cellen geïsoleerd van drie HIV-positieve proefpersonen met detecteerbare viremia en een afwezigheid van therapie na stimulatie met anti-CD3/CD28. Kwantificering van ASP RNA was ook mogelijk bij patiënten die ART ondergingen, met niet-detecteerbare viremie.Bij twee op de drie patiënten werd ASP RNA bij lage niveaus op drie tot vijf dagen na stimulatie gedetecteerd. Twee patiënten werden geanalyseerd op ASP en env RNAs, een onbehandeld en een behandeld. Voor de onbehandelde patiënt kunnen beide RNA's worden gedetecteerd.Voor de behandelde patiënt waren ASP en env nauwelijks detecteerbaar na enkele dagen stimulatie. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat denaturatie RNA lineariseert, zodat secundaire structuren in staat om RT prime worden vernietigd. Terwijl het wassen van de kralen wegspoelt niet-biotynylated cDNAs.Na zuivering van de cDNAs met de juiste polariteit, qPCR kan worden uitgevoerd om genexpressie te analyseren. Bovendien kunnen cDNA's ook worden gekloond en gebruikt voor sequentieanalyse. Deze methode maakt het mogelijk om genen te bestuderen die elkaar overlappen in tegengestelde oriëntatie en kan nuttig zijn bij het ophelderen van regulatie en pathogenese van een bacterie en een virusgerelateerde ziekten, waaronder sommige vormen van kanker.

detection-human-immunodeficiency-virus-type-1-hiv-1-antisense-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek...

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

De aanwezigheid van hoog-risico HPV in het hoofd en de nek tumorweefsel wordt geassocieerd met gunstige resultaten. De recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie techniek genaamd RNAscope maakt een directe visualisatie van HPV E6/E7 mRNA in FFPE weefsel secties.

RNAscope voor<em&gt; In situ</em&gt; Detectie van transcriptionally Actief humaan papillomavirus in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Leer een specifieke RT-PCR-methode voor detectie van HIV-1 antisense ASP RNA-transcripten bij patiënten met behulp van gebiotinyleerde primers en hoge RNA-denaturatietemperaturen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR (Video) | JoVE Journal

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

Meer video's verkennen