Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii

Het bestuderen van hoe microben de chemische samenstelling van de individuele bilayers reguleren, zal onze kennis van mechanismen van antibioticadoden, antimicrobiële resistentie en ziektepathogenese informeren. Deze techniek partities de celenvelop van gram-negatieve bacteriën in twee gedefinieerde breuken zonder gebruik van wasmiddel. Daarom kunnen de lipiden, eiwitten en suikers worden beoordeeld in een omgeving die semi-native is.

Sommige van de stappen zijn tijd afhankelijk en vereisen focus en coördinatie. Gebruik in eerste instantie een of twee monsters. Wanneer iemands comfortniveau toeneemt, kunnen er meer monsters worden toegevoegd.

Niet meer dan zes monsters mogen tegelijk worden behandeld. Dit is een meerdaagse procedure en visuele controlepunten zijn nuttig om de werkzaamheid en fout te beoordelen. Voorafgaand aan het uitvoeren van deze soms laatste stappen.

Streep de bacteriën uit bevroren glycerol voorraden op verse agar platen. Zodra kolonies ontwikkelen, bewaar de platen op vier graden Celsius. Gebruik een enkele kolonie om een vijf milliliter buis gevuld met bouillon media inenten en cultuur van de bacteriën zoals gewenst 's nachts.

Terug verdun de nachtelijke bacteriële cultuur in een liter van de gewenste bouillon media en de kolven uitbroeden. Wanneer de gewenste optische dichtheid is bereikt, verwijder de kolven uit de couveuse en leg ze op ijs. Meet de optische dichtheid van de cultuur op 600 nanometer en bereken het volume van de cultuur dat overeenkomt met tussen de zes en acht keer 10 tot de elfde bacteriële kolonie vormen eenheden.

Voeg dit volume van de cultuur aan een centrifuge buis en ervoor te zorgen dat de resterende culturen blijven op ijs totdat ze moeten worden gebruikt. Pellet de bacteriën door centrifugatie gedurende 10 minuten ina een vaste hoek, hoge snelheid centrifuge op 7, 000 tot 10,000 keer G en vier graden Celsius. Decanteer de supernatant voorzichtig en gooi het weg.

Resuspend elke cel pellet in 12,5 milliliter buffer A.Voeg een magnetische roerstaaf aan de cel suspensie. Voeg 180 microliter van 10 milligram per milliliter lysozyme toe aan elke celresuspensie. Na het verzamelen van de lysozyme EDTA behandelde bacteriën door centrifugatie, snel voeg de proteaseremmer, magnesiumchloride en nuclease aan de bacteriën en snel resuspend de cellen in buffer B.Roer gedurende twee minuten, het houden van de suspensaties op ijs.

Voeg vervolgens 12,5 milliliter 1,5 millimolar EDTA-oplossing toe aan elke resuspensie van de cel en blijf nog zeven minuten roeren op ijs. Decanteer de suspenen in 15 milliliter conische buizen. Centrifuge de schorsingen op 9,000 tot 11.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de supernatanten in een biohazard afvalcontainer en houd de pellets op ijs. Voeg 25 milliliter buffer B toe aan elke celpellet. Voeg vervolgens 55 microliter van één molair magnesiumchloride toe, één microliter rnase/dnase/nuclease reagens en één microliter proteaseremmercocktail.

Resuspend de pellets in het mengsel. Krachtig pipet en vortex totdat de oplossingen homogeen lijken. Bewaar de suspensies op ijs.

Giet het monster in de monstercilinder van de homogenisator en breng de cel op 20.000 PSI. Om aerosolisatie van ziekteverwekkers te voorkomen, moet u het onder druk gezete apparaat in buffer B conditioneren en de drukniveaus aanpassen voordat bacteriële suspensie wordt toegevoegd. Schakel de drukcel in en zinspeel 10 milliliter buffer B uit voorzorg.

Verzamel de cel lysate in 50 milliliter conische buizen op ijs, terwijl ook het houden van de monsters op ijs. Om volledige lysis te bereiken, herhaal dit proces drie tot vijf keer. Om het resterende, intacte celmateriaal te pelrifugeren, centrifugeren de gelyseerde bacteriële monsters op 6, 169 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Verdeel de supernatants die nu de gehomogeniseerde membranen bevatten, in polycarbonaatflessen voor ultracentrifugatie. Ultracentrifuge de cel lysates op 184, 500 keer G en vier graden Celsius gedurende ten minste een uur. Gooi de supernatanten weg en houd de membraankorrels op ijs.

Met behulp van een glas, Dounce homogenisator, resuspend de membraan pellets in een milliliter van de lage dichtheid isopycnic sucrose gradiënt oplossing. Gebruik vervolgens een glas, Pasteur pipet om het monster homogenaat over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis en plaats de buis op ijs. Om het sacharoseverloop voor te bereiden, houdt u een polypropyleen of ultraheldere Open-Top-buis in een licht gekantelde positie.

Voeg langzaam twee milliliter van de hogere dichtheid sucrose oplossing. Voeg vervolgens vier milliliter van de lagere dichtheid sucrose oplossing. Voeg bij het voorbereiden van de dichtheidsgradiënt de sacharoseoplossing langzaam toe om te voorkomen dat de lagen worden gemengd.

De sacharoselagen moeten enigszins zichtbaar zijn en over het algemeen gedefinieerd lijken. Voeg vervolgens de totale membraanfractie toe die eerder opnieuw werd opgetrokken in één milliliter met een lage dichtheid, isopycnic sucrose-oplossing. Tot slot, vul de rest van de buis door het toevoegen van ongeveer zes milliliter van de lage dichtheid, isopycnic sucrose gradiënt oplossing.

Ultracentrifuge de monsters met behulp van een swingende emmer rotor op 288, 000 keer G en vier graden Celsius gedurende 16 tot 23 uur. Snijd het einde van een P1000 pipet tip ongeveer vijf milliliter van het punt. Nadat de centrifugatie is voltooid, gebruikt u de pipet om de bovenste, bruine laag uit de buis te verwijderen.

Breng deze laag, die de binnenste membraanfractie bevat, over naar een polycarbonaatfles voor ultracentrifugatie. Laat ongeveer twee milliliter van de sacharoseoplossing boven de interface tussen de 53%-sacharose en de 73%-sacharose om ervoor te zorgen dat de onderste, witte, buitenste membraanfractie de binnenste membraanfractie niet kruist. Opnieuw met behulp van een P1000 pipet tip met het einde verwijderd, verwijder de buitenste membraanlaag en breng het naar een polycarbonaat fles.

Vul de resterende leegte van polycarbonaatfles met geïsoleerde membraanopslagbuffer en meng door inversie of pippetting. Bewaar de monsters op ijs. Om de membranen te verzamelen, ultracentrifuge de polycarbonaat flessen op 184, 500 keer G en vier graden Celsius gedurende een uur.

Gooi ten slotte de supernatants weg en voeg 500 tot 1.000 microliter opslagbuffer toe. Resuspend de membranen door Dounce homogenisatie. Verzamel de monsters in twee milliliter microcentrifugebuizen.

Totale membraan pellets werden geschraapt, Dounce gehomogeniseerd en ultracentrifuged over sacharose dichtheid gradiënten om de binnenste en buitenste membranen te scheiden. Een sacharosedichtheidsgradiënt van 20%53%73% was voldoende voor het verdelen van sommige bacteriële stammen. Maar niet voor het verdelen van A.baumannii die met succes werd verdeeld met behulp van een 20%45%73%gradiënt.

Om de efficiëntie van de scheiding te beoordelen, werden membraanmonsters getest op NADH-dehydrogenase, een enzym in het bacteriële binnenmembraan. Een afname van de optische dichtheid op 340 nanometer duidde op de aanwezigheid van het enzym. Optische dichtheid werd gemeten voor 50 microgram monsters van binnen- en buitenmembraanfracties van het wilde type S.typhimurium, E.coli K12 DH5a en galE mutant S.typhimurium.

Een hogere concentratie van eiwitten werd toegevoegd bij het testen van de zuiverheid van A.baumannii membraanfracties omdat een eerste test met behulp van 50 microgram suggereerde dat de relatieve niveaus van NADH dehydrogenase lager waren voor A.baumannii dan voor de andere bacteriële stammen. Om kruisbesmetting van de binnenste membraanfracties met buitenste membraanfracties te beoordelen, werden LPS en LOS geëxtraheerd en gevisualiseerd. De extracten werden geladen op een polyacrylamide gel en gekleurd met Pro-Q Emerald 300.

Acinetobacter baumannii is een topprioriteit, multiresistente, menselijke ziekteverwekker. Dit protocol moet onderzoekers helpen bij het begrijpen van de rol van lipooligosaccharides, fosfolipiden en lipoproteïnen in de weerstands- en virulentiemechanismen van deze unieke en belangrijke ziekteverwekker. Deze methode is ideaal voor downstream analyse van fosfolipiden, glycolipoïden koolhydraten, eiwitten en kleine moleculen die meestal bestaan in de dubbele membranen van gram-negatieve bacteriën.