Evaluatie van cerebrale bloedstroom autoregulatie in de rat met behulp van laser doppler flowmetrie
19 januari 2020
Dit artikel demonstreert het gebruik van laser doppler flowmetrie om te evalueren van het vermogen van de cerebrale circulatie te autoreguleren de bloedtoevoer tijdens verlagingen van de arteriële bloeddruk.
Dit protocol is bij uitstek geschikt voor het evalueren van het vermogen van de cerebrale microcirculatie om zijn eigen bloedstroom te reguleren tijdens bloeddrukveranderingen onder normale en pathologische omstandigheden. LDF biedt een relatief niet-invasieve methode voor de continue monitoring van de cerebrale bloedstroom onder een verscheidenheid van voorwaarden die niet mogelijk is met andere methoden. Laser Doppler flowmetry kan worden gebruikt voor niet-invasieve bloedstroom evaluatie.
Bijvoorbeeld, om de effecten van een hoog zout dieet op verminderde bloedstroom regelgeving bij gezonde jonge vrouwen te beoordelen. LDF maakt het mogelijk de bloedstroom gemakkelijk te controleren in veel verschillende vasculaire bedden van mensen en dieren, en kan worden gebruikt in een breed scala van studies. Het aantonen van de procedure met Adrienne Allen zal Megan Stumpf, mijn onderzoek technoloog en lab manager.
Plaats de rat voor het begin van de procedure op een circulerende waterdeken die bij 37 graden Celsius wordt gehouden en bevestig een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij een verdoofde experimentele rat. Breng zalf aan op de ogen van de dieren en scheer de bovenkant van de schedel, ventrale nek gebied, en dijbeen driehoeken. Verwijder eventuele verliezen haar van de blootgestelde huid.
En desinfecteren de huid met alcohol. Verplaats de rat naar een verwarmingskussen met een circulerende warmwaterpomp. En gebruik medische tape om de rat tijdelijk in de supine positie te beveiligen.
Vul twee PE 50 canules met één eenheid per lL heparine in isotone natriumchlorideoplossing. En schuin het open uiteinde van de katheters met chirurgische schaar om het inbrengen in de slagaders te vergemakkelijken. Na het zorgvuldig scheiden van de dijbeenslagaders van het omringende weefsel onder een ontledenmicroscoop, ligate het distale uiteinde van het geïsoleerde femorale slagadersegment en plaatst u twee extra hechtingen rond het midden en proximale uiteinden van de slagader zonder de knopen aan te scherpen.
Steek een V-vormige draad uit een paperclip onder de slagader om het vat af te voegen totdat de canule is bevestigd. Gebruik dan vannas schaar om een kleine incisie in de dijbeenslagader in de buurt van de distale ligatie te maken. Steek het afgeschuinde uiteinde van de canule in de incisie en ga de canule in de dijbeenslagader.
Verwijder de paperclip. Draai de knoop in de middelste ligatuur over de canule om de canule op zijn plaats te krijgen. Laat de spanning los op de hefligbondture, draai vervolgens de proximale ligatuur aan en sluit de incisie.
Direct nadat de canules op hun plaats zijn, plaatst u het dier in een sternale positie. En zet het hoofd vast in een stereotaxic apparaat dat ervoor zorgt dat de katheters niet los komen. Maak een elliptische incisie in de huid die de schedel bedekt.
En gebruik een wattenstaafje om bindweefsel te verwijderen, zodat de schedel schoon en droog is. Plaats een klein, gerold langwerpig stuk tissuepapier rond de incisie op de hoofdhuid om bloedingen en onder de ontledenmicroscoop te stoppen, gebruik een voldoende grote boor met een 2,15mm boorbit om een 0,5 tot 1 cm bot in het pariëtale gebied over de linker- of rechter somatosensorische cortex te verdunnen, afhankelijk van de grootte van de rat. Dun het bot langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat het doordringen van de schedel.
Tijdens het uitvoeren van deze stap, zoute oplossing moet royaal worden toegepast om te voorkomen dat het gebied over verwarming. Wanneer het gebied een roze uiterlijk heeft en/of bloedvaten kunnen worden gevisualiseerd, bedek het uitgedunde bot met minerale olie. En gebruik een micromanipulator om de laser doppler sonde over de blootgestelde cerebrale microcirculatie te positioneren, zodat de punt van de sonde is gewoon het aanraken van de bovenkant van de pool van minerale olie.
Voor de eerste sonde plaatsing, is het het beste om te beginnen met een signaal van ongeveer 150 eenheden om ervoor te zorgen dat de sonde is gepositioneerd over de micro-circulatie. Wanneer de laser doppler flowmetry sonde is op zijn plaats, laat het dier voor een 30 tot 45 minuten evenwichtsperiode alvorens 1,5 mL bloed uit de juiste femorale slagader canule over een periode van 30 seconden. Om het katheteroctrooi te behouden, bezielt u 100 eenheden per lL heparine in isotone zoutoplossing in de canule na elke bloedafname.
Laat de rat twee minuten herstellen en meet vervolgens LDF en bloeddruk om de 30 seconden gedurende twee minuten. Herhaal na de bloeddruk- en LDF-metingen om de twee minuten de onttrekking van het bloedvolume totdat het dier een gemiddelde arteriële druk van ongeveer 20mmHg bereikt. In deze representatieve experimenten, de gemiddelde laser cerebrale bloedstroom van 10 Sprague-Dawley ratten gevoed standaard laboratorium chow werd gehandhaafd binnen 20% van de pre-bloeding waarde na de eerste drie bloedvolume onttrekkingen, totdat de gemiddelde arteriële druk bereikte de ondergrens van de autoregulatie.
Latere bloedvolume onttrekkingen bij druk onder de ondergrens van de autoregulatie, veroorzaakte een geleidelijke vermindering van de laser cerebrale bloedstroom waaruit blijkt dat de cerebrale circulatie niet langer in staat was om een voldoende niveau van vasodilatatie te produceren om de cerebrale bloedstroom constant te handhaven bij de lagere profusie druk. Bij druk op of boven de ondergrens van de autoregulatie, was er geen significante correlatie tussen de laser cerebrale bloedstroom en de arteriële druk, wat aangeeft dat de laser cerebrale bloedstroom onafhankelijk was van de arteriële druk in het plateau bereik van de autoregulerende curve. Onder de ondergrens van de autoregulatie, de laser cerebrale bloedstroom arteriële druk relatie had een negatieve helling.
En de laser cerebrale bloedstroom was aanzienlijk gecorreleerd met de arteriële druk. De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om de schedel zeer zorgvuldig dun en om ervoor te zorgen dat de LDF sonde blijft stevig verankerd over hetzelfde gebied van weefsel. Deze procedure kan worden gebruikt om de reactiviteit van de microcirculatie van verschillende middelen na retrograde infusie via de halsslagader te testen, of om functionele hyperemie en neurovasculaire koppeling in de cerebrale circulatie te evalueren.
Deze techniek heeft het mogelijk gemaakt onderzoek te onderzoeken naar de effecten van verschillende geneesmiddelen en verdovingsmiddelen op de cerebrale circulatie en de veranderingen in cerebrale autoregulatie in ziektemodellen zoals hypertensie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert het gebruik van laser-Doppler flowmetrie (LDF) om het vermogen van de cerebrale microcirculatie om de bloedstroom te autoreguleren tijdens veranderingen in de arteriële bloeddruk te evalueren. LDF is een niet-invasieve methode die continue monitoring van de cerebrale bloedstroom onder verschillende condities mogelijk maakt.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Microcirculatie
- Regulatie van de bloedstroom
Achtergrond
- Laser Doppler flowmetrie biedt een niet-invasieve benadering om de cerebrale bloedstroom te beoordelen.
- Deze methode is geschikt voor het bestuderen van zowel normale als pathologische condities.
- LDF kan de bloedstroom in diverse vasculaire bedden bij mensen en dieren monitoren.
- Het is bijzonder nuttig voor het evalueren van de effecten van veranderingen in het dieet op de regulatie van de bloedstroom.
Doel van de studie
- Om de autoregulatiecapaciteit van de cerebrale circulatie te beoordelen.
- Om de regulatie van de bloedstroom tijdens veranderingen in de arteriële bloeddruk te evalueren.
- Om de toepassing van LDF in verschillende onderzoekcontexten te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Laser-Doppler-flowmetrie voor continue monitoring van de bloedstroom.
- Evaluatie van de bloedstroom onder variërende bloeddrukcondities.
- Toepassing van LDF in studies naar de effecten van dieet op de bloedstroom.
- Demonstratie van de procedure door getraind personeel.
Belangrijkste resultaten
- LDF monitort de cerebrale bloedstroom effectief in realtime.
- De methode is veelbelovend voor het beoordelen van de regulatie van de bloedstroom onder verschillende condities.
- Resultaten wijzen op het potentieel van LDF in zowel klinische als onderzoeksinstellingen.
- De demonstratie van de procedure vergroot het begrip van de toepassing ervan.
Conclusies
- Laser Doppler flowmetrie is een waardevol instrument voor het bestuderen van de cerebrale doorbloeding.
- De methode maakt een non-invasieve evaluatie van de autoregulatie van de bloedstroom mogelijk.
- Verdere studies kunnen de toepassing ervan in het neurowetenschappelijk onderzoek uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Laser Doppler flowmetrie (LDF) maakt niet-invasieve real-time monitoring van de autoregulatie van de cerebrale bloedstroom mogelijk, wat cruciale inzichten verschaft in de vasculaire reactiviteit onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen in de neurowetenschappen door hemodynamische responsen te kwantificeren op interventies die de bloeddrukregulatie beïnvloeden. De methode faciliteert mechanische risicoreductie van verbindingen die de cerebrale perfusie, endotheelfunctie of neurovasculaire koppeling in preklinische modellen beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen met betrekking tot de regulatie van de vasculaire tonus en de endotheelfunctie in de cerebrale microcirculatie.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk door de autoregulerende capaciteit te meten als fysiologische readout van pathway-modulatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren die autoregulerende mechanismen behouden of verstoren die gekoppeld zijn aan ischemisch of hypertensief risico.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op hemodynamische screening door baseline autoreguleringscurven vast te stellen in ziekterelevante modellen.
- Kwantitatieve output: Levert continue, relatieve metingen van de cerebrale bloedstroom, waardoor effecten van vasodilatatoire of vasoconstrictieve verbindingen kunnen worden gedetecteerd.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde protocollen voor schedelverdunning en sondeplaatsing ondersteunen de consistentie tussen laboratoria bij neurovasculaire screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert hemorragische shock en autoregulatoire uitval gerelateerd aan hypertensie, wat aansluit bij translationele biomarkerstudies naar beroerte en cognitieve achteruitgang.
- Preklinische continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door de corticale bloedstroom tijdens gegradeerde bloedingen te monitoren, wat klinische hypotensieve uitdagingen nabootst.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria door de ondergrenzen van autoregulatie te definiëren als veiligheidsdrempels voor verbindingen die de vasculaire tonus beïnvloeden.
Integratie van pipeline & workflow
LDF is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische veiligheidsbeoordeling, in het bijzonder voor CNS-actieve verbindingen met vasculaire risico's.
- Discovery Biology: Test mechanistische hypothesen over myogene, metabole of neurogene regulatie van de cerebrale bloedstroom met behulp van drukuitdagingsparadigma's.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie voor verbindingenbibliotheken mogelijk door reproduceerbare LDF-traceringen te leveren voor, tijdens en na een hemorragische insult.
- Analytics: Genereert kwantitatieve afhankelijke variabelen (relatieve cerebrale bloedstroomeenheden) gecorreleerd met onafhankelijke variabelen (gemiddelde arteriële druk) om autoregulatie-indexen te berekenen.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door het modelleren van autoregulatoir falen zoals waargenomen bij hypertensieve encefalopathie en hemorragische shock.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar neurovasculair platform dat aanpasbaar is aan diverse ziektestelsels, anesthetische condities en farmacologische interventies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in de cerebrale hemodynamiek door autoregulatoire reacties te isoleren van storende variabelen zoals anesthesie of temperatuur.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie via een closed-skull preparatie, waardoor chirurgische variabiliteit wordt geminimaliseerd en longitudinale monitoring mogelijk wordt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege vasculaire kwetsbaarheden te identificeren die klinisch falen in een laat stadium voorspellen bij hypertensieve of ischemische populaties.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van CNS-drugcandidates mogelijk op basis van behouden autoregulatie tijdens hypotensieve stress.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie bij knaagdieren, vasculaire canulatie en microscopisch botverdunnen om penetratie van de dura mater te voorkomen.
- Afhankelijk van laser-dopplerflowmetingsapparatuur, micromanipulatoren en fysiologische monitoringsystemen voor de controle van de arteriële druk en het bloedvolume.
- Maakt standaardisatie van de bloedingssnelheid, equilibratieperioden en spoelingen met geheparineerde zoutoplossing noodzakelijk om de vergelijkbaarheid van gegevens tussen studies te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van de diepte van het botverdunnen en de plaatsing van de probe, rekening houdend met variabiliteit in ratstammen en leeftijdgerelateerde vasculaire verschillen.
- Praktische beperkingen omvatten signaaldrift door verschuiving van de probe en het relatieve karakter van LDF-eenheden, waardoor interne controles nodig zijn voor een absolute flowkwantificering.
