Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

Mitochondriale disfunctie ligt ten grondslag aan vele neurodegeneratieve ziekten. Ons protocol biedt een belangrijk hulpmiddel voor het onderzoeken van mitochondriale dynamiek in de axonen, het vergemakkelijken van de studie van neurologische ziekten waarbij axonale degeneratie. Door mitochondriale etikettering, live celbeeldvorming en geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie te combineren, kan ons protocol worden gebruikt om mitochondriale handel langs menselijke axonen te karakteriseren en hun morfologieën te analyseren.

Verminderde mitochondriale transport en morfologie kan worden waargenomen in stamcelculturen en diermodellen van neurodegeneratieve ziekten die potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van deze ziekten. Na dag vijfendertig van de cultuur, scheiden van de neurosferen onderscheiden van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in kleine clusters met 1 mg/ml celloslating oplossing gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie verzamelen van de cel clusters door centrifugatie en resuspend de pellet in een milliliter van NDM.

Plaat ongeveer vijf clusters van cellen in honderd microliters van medium per polyornithine en lactose dehydrogenase verheffen virus-vrije verminderde groeifactor kelder membraan matrix gecoate 35 millimeter glazen bodem schotels. Voeg vervolgens een milliliter NDM aangevuld met B27, cyclische adenosine monophosfosfaat, insuline-achtige groeifactor, menselijke hersenen afgeleide neurotrofe factor en glia cel-afgeleide neurotrofe factor aan elke cultuur. Om mitochondriën te visualiseren langs de axonen van voorhersenen neuronen eerst vlek de neuronen met 50 nanomolar rode fluorescerende kleurstof in NDM gedurende drie minuten op 37 graden Celsius, gevolgd door twee wasbeurten in warme NDM.

Plaats vervolgens de cultuur op het podium van een fluorescentiemicroscoop en selecteer de 40X-doelstelling. Onder het faseveld identificeren de axonen op basis van hun morfologische kenmerken. Om de richting van de mitochondriale beweging langs de axonen duidelijk te onderscheiden identificeren van de cellichamen van neuronen.

Na het onderscheiden van het cellichaam en axon pas de belichtingstijd en focus van de mitochondriën in de axonen aan en vang je het mitochondriaal transport elke vijf seconden gedurende in totaal vijf minuten vast. Om mitochondriaal transport in ImageJ te analyseren open Fiji en selecteer de Bio-Formats plugin. Gebruik de importeur van Bio-formaten om de time-lapse-afbeeldingen van de tiff-serie te importeren en standaard ImageJ en Open alle series te selecteren.

Controleer de gesplitste kanalen automatisch schalen en klik op OK en let op het framenummer en de grootte van de afbeeldingen in pixels. Na het aanpassen van de helderheid en het contrast voor alle 60 frames gebruik maken van de gesegmenteerde lijn om een lijn te trekken van de cel lichaam naar de terminal axon. Als u de Kymograph wilt genereren, selecteert u de meerdere Kymograph-plug-ins en selecteert u de lijnbreedte.

Om de afstand te meten, tijdswaarden en snelheid voor de bewegende mitochondriën open tl050607. txt in de macro's plugin. En trek een gesegmenteerde lijn over het spoor van mitochondriale beweging op de kymograaf van de superieur naar de inferieure regio.

Na het tekenen van de lijn open lees snelheden van tl in de macro's plugin om de gesegmenteerde snelheden die overeenkomen met de lijn te lezen. Open vervolgens de oorspronkelijke afbeelding en gebruik het lijngereedschap om een lijn langs de schaalbalk te tekenen. Selecteer analyseren om de lengte van de lijn te meten en zet de dx nu en de afstand eenheden van pixels naar micrometers.

Verander vervolgens de tijd van pixel naar seconden. Om de mitochondriale lengte en het gebied binnen axonen in ImageJ te analyseren installeer de straighten underscore dot JAR plugin en open de axon afbeelding van belang. Converteer de 32-bits afbeelding naar acht bits en gebruik het gesegmenteerde lijngereedschap om de axon te traceren.

Selecteer de JAR-plug-in Straighten en stel de breedte van de gloeidraadbrede lijn in op 50 pixels. Traceer de axon opnieuw om een rechtgetrokken axon te genereren en pas de afbeeldingsdrempel aan. Selecteer De ingestelde metingen perimeter fit ellips en vormbeschrijvingen analyseren om de meting in te stellen en de lijnfunctie te gebruiken om de schaalbalk in de oorspronkelijke afbeelding te meten zoals aangetoond.

Ga onder analyseren en schaal instellen de afstand in pixels bekende afstand en de lengte-eenheid om de schaal in te stellen. Selecteer vervolgens globaal om de schaalinstelling in te stellen op alle afbeeldingen. Selecteer ten slotte deeltjes analyseren en analyseren om het gebied te bepalen en selecteer weergaveresultaten om de resulterende meting te bekijken.

Na differentiatie in telencephalic glutamatergic neuronen kunnen de cellen door hun T-B-R één en bèta drie tubulinmarkeringsuitdrukking worden gekenmerkt. Vlekken met rode fluorescerende kleurstof en time-lapse imaging maakt evaluatie van het axonale transport van mitochondriën mogelijk. Een enkele mitochondrion kan statisch blijven of bewegen in een anterograde of retrograde richting binnen een axon.

De snelheid van de mitochondriale beweging langs de axon kan worden gekwantificeerd zoals geïllustreerd. Bijvoorbeeld met behulp van commercieel beschikbare analyse software het percentage motile mitochondriën is aanzienlijk verminderd in S-P-G-3-A neuronen in vergelijking met wilde type neuronen. Voor het analyseren van de mitochondriale gebied lengte en aspect ratio axonen kunnen rechtgetrokken in de beeldanalyse software en geselecteerd door het aanpassen van de drempel.

De mitochondriale gebied perimeter lengte breedte en aspect ratio kan dan worden verkregen uit de rechtgetrokken axon. Bijvoorbeeld zowel de mitochondriale lengte en de aspect ratio zijn aanzienlijk verminderd in S-P-G 15 neuron axonen in vergelijking met de controle wilde type axonen. Het is belangrijk om het medium en de microscoop incubator warm om de cellen voorzichtig te wassen en om de cellen te stabiliseren gedurende twintig minuten voor de beeldvorming.

Na live celbeeldvorming kunnen de culturen worden vastgesteld en onderworpen aan immunostaining om de expressie van andere proteïnen van belang te onderzoeken. Het is een uitdaging om mitochondriale dynamiek in levende menselijke zenuwen te onderzoeken. Deze techniek biedt het unieke hulpmiddel voor de studie van mitochondriale dynamiek en zenuwdegeneratie bij neurologische aandoeningen.