Name: Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Leer oenocytendissectie en lipidedruppelkleuring met BODIPY 493/503 in Drosophila-larven. Deze methode maakt visualisatie van lipideopslag mogelijk onder normale en stressomstandigheden voor metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 en 31601112), het 111-project (D18010), het lokale innovatieve en onderzoeksteams project van het Guangdong perl River talents Program (2017BT01S155), en de China postdoctoral Science Foundation (2018M640767).

1. het leggen van eieren
<ol><li>Bereid de standaard maïsmeel voedsel voor het leggen van eieren. Opmerking: Voor het recept en de kook procedure voor standaard maïsmeel voedsel hier gebruikt, zie de eerder gepubliceerde Details15.</li>
	<li>Bereid verse gist pasta door 6 mL gedestilleerd water toe te voegen aan 4 g actieve gedroogde gist in een 50 mL centrifugale buis. Gebruik een spatel om te mengen en maak een pasta.</li>
	<li>Maak eieren leggen flessen door het vullen van de maïsmeel voedsel in de flessen en verspreid ongeveer 1 g gist pasta op het oppervlak van de maïsmeel voedsel met een spatel.</li>
	<li>Plaats de vliegen van de gewenste genotypen in een Eier-legfles en plaats deze in een incubator met een constante temperatuur van 25 °c en een vochtigheidsgraad van 60%. Opmerking: Ideale kruisen meestal bestaan uit 150 Virgin vliegen en ten minste 75 mannetjes. Het houden van vliegen in het donker door het plaatsen van een lightproofin doos over de eieren-legflessen zal de reproductiesnelheid te verhogen.</li>
	<li>Voordat Egg Collection, laat vliegen eieren leggen voor 1 h te laten verwijderen van alle oude eieren die bewaard blijven in de vrouwelijke oviducts.</li>
	<li>Laat vliegen eieren leggen in een nieuwe Eier-legfles voor 1 uur en verwijder de volwassenen uit de fles. Opmerking: Bedien de Eier-legtijd om het ontwikkelings bereik te minimaliseren om larven binnen een nauwkeurig gecontroleerde ontwikkelingsfase te verkrijgen.</li>
	<li>Laat de eieren voor 84 h ontwikkelen tot de derde instar larven in de incubator bij 25 °C met een licht/donker cyclus van 12 uur/12 uur.</li>
</ol>2. starvatie behandeling voor de larven
Opmerking: Zoals hierboven vermeld, in de derde instar larven, er zijn weinig of geen detecteerbare lipide druppeltjes in de oenocyten onder normale voedingsomstandigheden, maar talrijke grote lipide druppeltjes kunnen worden geïnduceerd in de oenocyten onder stressomstandigheden, zoals honger. Om verder te controleren deze methode, is het noodzakelijk om deze larven voor te behandelen voor het opwekken van lipide druppel biogenese in oenocyten. Hier werd een honger tijd parcours van 12 uur, 24 uur en 36 h gekozen als het paradigma. In het bijzonder is een korte periode van verhongering (bijv. 3 uur) voldoende om detecteerbare lipidedrup pels in oenocyten te induceren. De duur van de hongersnood kan variëren afhankelijk van specifieke experimentele doelen en instellingen.
<ol><li>Maak kamers voor verhongering en controle behandelingen.<ol>
<li>Voor de verhongering: plaats een filtreerpapier van passende grootte in een Petri schaaltje van 6 cm en Pipetteer 1 mL PBS op het filtreerpapier.</li>
		<li>Voor de controle behandeling kamers: plaats 5 mL standaard maïsmeel voedsel in de Petri schaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een spatel om de toplaag van voedsel met larven die nog steeds in het voedsel worden begraven, zachtjes op te graven en over te brengen naar een Petri schaaltje gevuld met 5 mL PBS. Roer de larven in PBS zachtjes om voedselverontreiniging van de larven te verwijderen en maak het zo schoon mogelijk.</li>
	<li>Gebruik een klein penseel om 40 derde instar larven van dezelfde geschatte grootte te verzamelen. Sorteer ze willekeurig in een honger-of controlekamer, met elk 20 larven.</li>
	<li>Plaats de kamers in de incubator bij 25 °C met 60% vochtigheid en laat de ontwikkeling toe voor 12 uur, 24 uur en 36 h behandeling. Opmerking: Voeg voor de larven in de honger kamer 1 mL PBS elke 12 h toe om te voorkomen dat larven worden gedehydrateer.</li>
</ol>3. dissectie van Oenocyten
<ol><li>Gebruik een klein penseel om larven van de juiste leeftijd (12 uur, 24 uur of 36 h na de behandeling) te plukken en breng ze vervolgens over in een nieuwe Petri schaal gevuld met 5 mL ijskoude PBS om te wassen. Opmerking: Herhaal stap 2,2 bij het omgaan met larven in een controlekamer om voedselverontreiniging te verwijderen.</li>
	<li>Vul een dissectie plaat met ijskoude PBS en gebruik de tang om de larven voorzichtig over te brengen naar de dissectie plaat. Plaats de dissectie plaat onder een stereomicroscoop voor de volgende dissectie stap. Opmerking: De ijskoude temperatuur zal helpen langzame bewegingen van de larven en vergemakkelijken dissectie.</li>
	<li>Draai de larven ventrale zijde omhoog en de rugzijde naar beneden en houd voorzichtig vast met behulp van de Tang. Bevestig de larven aan de dissectie plaat door een dissectie PIN te plaatsen, hoewel de keelholte aan het voorste uiteinde en een andere speld door de spiracle aan het achterste uiteinde. Opmerking: De rugzijde wordt het meest gemakkelijk geïdentificeerd door de aanwezigheid van de rugschachten van de luchtpijp.</li>
	<li>Gebruik Vannas veer schaar om door de epidermis van de voorkant naar het achterste uiteinde te insnijden (longitudinaal).</li>
	<li>Verwijder het inwendige weefsel van de epidermis met behulp van een tang. Opmerking: Voorzichtigheid moet worden betracht bij het verwijderen van de tracheale takken om schade aan de oenocyten te voorkomen, die gelokaliseerd zijn in het inwendige oppervlak van de epidermis.</li>
	<li>Met pincet, haal de dissectie pinnen op en breng de epidermis over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL gevuld met PBS op ijs.</li>
	<li>Ga verder met het ontleden van andere larven volgens de hierboven beschreven procedure.</li>
</ol>4. lipide druppel kleuring
<ol><li>Incuberen de ontleed epidermis in de fixatie bufferfor 30 min bij kamertemperatuur (RT) op een rotator. Opmerking: De fixatie buffer bevat 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS.</li>
	<li>Verwijder de fixatie buffer, gevolgd door een snelle spoeling. Om een snelle spoeling uit te voeren, voeg 1 mL PBS op RT in de buis na het verwijderen van PFA, breng de weefsels zachtjes door en gooi de PBS weg. Let op: De fixatie buffer bevat PFA, dat schadelijk is voor de menselijke gezondheid. Het is belangrijk dat de fixatie buffer goed wordt weggegooid als gevaarlijk afval.</li>
	<li>Was de monsters 3x voor 5 min elk met PBS om alle mogelijke PFA-resten te wassen.</li>
	<li>Inbroed de epidermis met BODIPY 493/503 (1 μg/mL; Zie tabel van de materialen) gedurende 30 min bij RT op een rotator. Opmerking: Wikkel vanaf deze stap de microcentrifuge buis met een stukje aluminiumfolie om monsters te beschermen tegen licht en de mogelijke foto-bleaching te minimaliseren.</li>
	<li>Verwijder de BODIPY 493/503 kleuring oplossing en was de monsters 3x voor 10 min elk met PBS om rest kleurstoffen volledig te verwijderen.</li>
</ol>5. montage en beeldvorming
<ol><li>Plaats 6 μL afdekmedium op een schone Microscoop-dia. Opmerking: Afdekmedium wordt gebruikt voor langere detectie tijd op basis van de anti fade-eigenschappen.</li>
	<li>Gebruik de tang om één epidermis op te pikken en verwijder de resterende PBS voorzichtig met een doekje.</li>
	<li>Plaats de epidermis in het afdekmedium en pas de oriëntatie zodanig aan dat het inwendige oppervlak van de oenocyten zich op de bodem bevindt en het buitenoppervlak zich aan de bovenzijde bevindt.</li>
	<li>Plaats een dekslip voorzichtig op de epidermis. Opmerking: Verwijder eventueel extra afdekmedium dat lekt van onder de dekslip met een doekje. Om de beeldvorming te vergemakkelijken, duw de dekglaasje voorzichtig met de Tang naar beneden, zodat bij het observeren van de glijbaan door de Microscoop de oenocyte cluster gemakkelijk in één enkel vlak kan worden afgebeeld. Als alternatief is het praktisch haalbaar om de epidermis in twee semi-epidermis door de middelste lijn te snijden om het oprollen van de hele epidermis bij het monteren van de weefsels te voorkomen.</li>
	<li>Breng duidelijke nagellak aan rond de randen van de Afdeklijst om te verzegelen.</li>
	<li>Zet de dia's in een lichtvaste monster doos en laat de nagellak drogen op RT, wat 5-10 min kan duren.</li>
	<li>Ga verder met microscopische analyse. Maak afbeeldingen met een confocale Microscoop (vergroting van 63x met geoptimaliseerde GFP-of FITC-filterinstellingen, excitatie = 488 nm, emissie = 503 nm) om schone en gevoelige signalen met een geminimaliseerde achtergrond te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+research+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li>
<li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+and+Drosophila+models+to+investigate+the+mechanistic+links+between+diet%2C+obesity%2C+type+II+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).</li>
<li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).</li>
<li>Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+functions+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The development and functions of oenocytes.</a> Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+suppresses+age-dependent+ectopic+fat+accumulation+by+maintaining+the+proteostasis+of+PLIN2+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila.</a> Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+lipid+droplet+turnover+in+response+to+nutrient+deprivation+via+p62-mediated+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).</li>
<li>Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets%3A+from+archaea+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li>
<li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li>
<li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).</li>
<li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li>
<li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Onder de hierboven beschreven, zijn er een aantal kritische stappen in dit protocol, waarbij de ei-legtijd periode een van deze is. Als een lipide-mobiliserende weefsel, de oenocyte is zeer gevoelig voor voeding status6,8. Langdurige Eier-legtijd perioden kunnen resulteren in kraaide larven en verhoogde voedsel concurrentie, wat leidt tot onnauwkeurige resultaten. De 1 h-tijdperiode die in dit protocol wordt gebruikt, stelt de larven in staat om te ontwikkelen zo...

Lipiden zijn essentieel voor overleving van de cel. Naast hun traditionele rol als integrale componenten van cellulaire membraansystemen, lipiden spelen ook cruciale functies in de energietoevoer en signalering transductie gedurende de levenscycli van individuele dieren1. Dus, lipide metabolisme moet voldoen aan strenge voorschriften te handhaven van fysiologische hemostase in cellen. Het is bekend dat disregulatie van lipide metabolisme resulteert in verschillende ziekten, zoals diabetes en vette lever. Ondanks het grote belang van lipide metabolisme in diergezondheid, de mechanismen onderliggende lipide metabolisme verordening blijven grotendeels onbekend.
Drosophila wordt al jaren intensief gebruikt sinds professor Thomas H. Morgan begon ze te gebruiken in studies waarbij genetica en andere fundamentele biologische vragen2. In de laatste decennia heeft het opkomende bewijs aangetoond dat Drosophila een uitstekend modelorganisme is in de studie van veel lipide-metabolisme-geassocieerde ziekten, zoals obesitas1,3. Drosophila deelt in het bijzonder sterk gecondengeerde metabole genen met mensen en bezit vergelijkbare relevante weefsels/organen en celtypen voor lipide metabolisme.
Bijvoorbeeld, het vet lichaam van Drosophila, die verantwoordelijk is voor triglyceride opslag, functies analoog aan menselijke vetweefsel. Onlangs, een cluster van gespecialiseerde hepatocyte-achtige cellen (dat wil zeggen, oenocyten), die zijn gemeld dat een functioneel analoog aan de menselijke lever, is aangetoond dat ze betrokken zijn bij vetzuur en koolwaterstof metabolisme in fruitvliegen4,5. Net als bij zoogdieren reageert oenocytes op de honger door de vorming van lipide druppel in zowel larvale als volwassen Drosophilate activeren, resulterend in accumulatie van lipide druppel in oenocyten4,6,7,8. Anatomisch zijn oenocyten nauw verbonden met het basale inwendige oppervlak van de laterale epidermis in clusters van ongeveer zes cellen per buik hemisegment, waardoor het praktisch niet haalbaar is om oenocyte clusters uit de epidermis te isoleren. Zo moeten oenocyten tijdens het dissectie en de kleuring aan de epidermis worden bevestigd.
Lipiden worden opgeslagen in de vorm van lipide druppeltjes, die organellen met enkellaags membranen in cellen9. Lipide druppeltjes bestaan in bijna alle celtypen over verschillende soorten10. Lipide druppel dynamiek, met inbegrip van de grootte en het aantal, verandering in reactie op milieustressoren. Dit wordt beschouwd als een afspiegeling van metabole status in reactie op stress, zoals veroudering en honger van7,8. Daarom is het van groot belang om een haalbare en betrouwbaardere methode te ontwikkelen voor het kwalitatief bepalen van de lipide druppel dynamiek in oenocytes tijdens de ontwikkeling en onder stressvolle omstandigheden. In het bijzonder, in de derde instar larven, bevatten oenocyten weinig of geen detecteerbare lipidedrup pels onder gevoede condities, maar ze bevatten wel talrijke grote lipidedrup pels na voedings deprivatie4. Om de effectiviteit van deze methode te controleren, wordt voorgesteld om lipide druppel kleuring in de oenocyten onder uitgehongerd voorwaarden uit te voeren.
Op dit moment zijn er verschillende lipofiele kleurstoffen beschikbaar voor het verven van lipide druppeltjes, zoals de niet-fluorescerende kleurstoffen Sudan Black en Oil Red O en fluorescerende kleurstoffen Nile Red en BODIPY 493/50311. Soedan zwart en olie rood O worden vaak gebruikt voor weefsel cholesteryl esters en triacylglycerolen en kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door Lichtmicroscopie. Echter, relatief hoge achtergrondkleuring en relatief lage resolutie zijn twee beperkende factoren voor haar toepassingen in kwalitatieve analyse van de dynamiek van lipide druppel. Om de beperkingen van niet-fluorescerende kleurstoffen te overwinnen, worden Nile Red en BODIPY 493/503 gebruikt als ideale substituten voor lipide druppel kleuring. Er is gemeld dat Nijl rood kan ook detecteren sommige niet-veresterd cholesterol, die maakt bodipy 493/503 een specifiekere kleurstof voor cellulaire lipide druppeltjes, tot op zekere hoogte12,13,14.
Bovenal, om te voldoen aan een behoefte aan een snelle en gevoelige analyse van lipide druppeltjes in oenocyten, dit protocol presenteert een haalbare en zeer reproduceerbaar methode van fixatief gebaseerde lipide druppel-specifieke kleuring met behulp van BODIPY 493/503 als de vlek kleurstof. In dit rapport worden oenocyten ontleed, en BODIPY 493/503 wordt gebruikt voor lipide druppel kleuring in de oenocyten, waarbij lipide druppeltjes worden gedetecteerd door confocale microscopie. Het gemak en de betaalbaarheid van deze procedure maken het ideaal voor modificatie en verder gebruik in andere toepassingen, zoals flow cytometrie.

<table><tbody><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>6 cm Petri dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>150326</td><td>6 cm</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td>Voor vliegvoer</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bescherm monster tegen licht</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Lipid druppel kleuringsverf</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>Leica TSC SP5</td><td>Confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>Corn syrup</td><td></td><td></td><td>Voor vliegvoer</td></tr><tr><td>Cornmeal</td><td></td><td></td><td>Voor vliegvoer</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 &times; 20 mm, 0.13-0.17 dik</td></tr><tr><td>Dissectie pin</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie plaat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Diameter: 11 cm</td></tr><tr><td>Fixatie buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>#5</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>Voor vliegcultuur</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Microscoop glaasje</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Montage medium</td><td>VECTASHIELD Antifade Montage Medium</td><td>H-1000</td><td>Antifade montage medium</td></tr><tr><td>Nagellak</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>Dekglas verzegelen</td></tr><tr><td>Verfkwast</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Kylin-Bell Lab Instruments</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Smartdata Medical</td><td>SR81</td><td>Vannas veer schaar</td></tr><tr><td>Soja meel</td><td></td><td></td><td>Voor vliegvoer</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Standaard cornmeal voedsel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Volgens Bloomington standaard cornmeal voedsel recept</td></tr><tr><td>Stereo microscoop</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>Voor weefsel dissectie</td></tr><tr><td>Wispapier</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gist</td><td></td><td></td><td>Voor vliegvoer</td></tr><tr><td>yw</td><td>Gehouden als lab voorraad</td><td>N/A</td><td>Drosophila</td></tr></tbody></table>

dissectie en lipide druppel kleuring van oenocyten in drosophila larven

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipiden zijn essentieel voor de ontwikkeling van dieren en fysiologische homeostase. Disregulatie van lipide metabolisme resulteert in verschillende ontwikkelingsstoornissen en ziekten, zoals obesitas en vette lever. Meestal, lipiden worden opgeslagen in lipide druppeltjes, welke zijn de multifunctionele lipide opslag organellen in cellen. Lipide druppeltjes variëren in grootte en aantal in verschillende weefsels en onder verschillende omstandigheden. Er is gemeld dat lipide druppeltjes worden strak gecontroleerd door regulering van de biogenese en afbraak. In Drosophila melanogaster, de oenocyte is een belangrijk weefsel voor lipide metabolisme en is onlangs geïdentificeerd als een menselijke lever analoog met betrekking tot lipide mobilisatie in reactie op stress. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van lipide druppel metabolisme in oenocyten blijven ongrijpbaar. Om dit probleem op te lossen, is het van het grootste belang om een betrouwbare en gevoelige methode te ontwikkelen om de lipide druppel dynamische veranderingen in oenocyten tijdens de ontwikkeling en onder stressvolle omstandigheden direct te visualiseren. Gebruik te maken van de lipofiele BODIPY 493/503, een lipide druppel-specifieke fluorescerende kleurstof, hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor de dissectie en daaropvolgende lipide druppel kleuring in de oenocyten van Drosophila larven in reactie op de hongerdood. Dit zorgt voor kwalitatieve analyse van de lipide druppel dynamiek onder verschillende omstandigheden door confocale microscopie. Bovendien kan deze snelle en zeer reproduceerbare methode ook worden gebruikt in genetische schermen voor het indentificeren van nieuwe genetische factoren met betrekking tot het metabolisme van lipide druppel in oenocyten en andere weefsels.

Succesvolle uitvoering van deze procedure moet resulteren in heldere lipide druppeltjes kleuring die het aantal en de grootte van lipide druppeltjes in de oenocyten onthult. Figuur 1a, A ', a ' ' toont aan dat er weinig detecteerbare lipidedrup Pels (groene stippen) in de oenocyten van normale voedings larven zijn tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Figuur 1b, B ', b ' ' toont verhoogde li...

Gepresenteerd hier zijn gedetailleerde methoden voor de dissectie en lipide druppel kleuring van oenocyten in Drosophila larven met behulp van bodipy 493/503, een lipide druppel-specifieke fluorescerende kleurstof.

Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Deze methode van een oenocyte dissectie en lipide druppelkleuring kan worden gebruikt om het verschijnen van lipidedruppel in drosophila larven oenocyte te realiseren onder normale en gestreste omstandigheden. Deze methode biedt een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van lipidemetabolisme niet alleen bij insecten, maar ook bij zoogdieren met slechts een paar kleine wijzigingen. Om het leggen van eieren te induceren, plaatst u 150 maagdelijke vrouwelijke vliegen en 75 mannetjes van de gewenste genotypen in een eierlegfles en plaatst u de fles onder een lichtdichte doos in een couveuse van 25 graden Celsius met een luchtvochtigheid van 60%.Na een uur, breng de vliegen naar een nieuwe fles en laat de vliegen eieren leggen in de nieuwe fles voor een uur voor het verwijderen van de volwassenen. Laat de eieren zich vervolgens 84 uur ontwikkelen tot de derde instarlarven bij 25 graden Celcius met een 12-uurs licht-donkere cyclus. Voordat u de hongerbehandeling start, plaatst u een passend formaat van filterpapier in een petrischaal van zes centimeter en voegt u een milliliter PBS toe aan het papier om een verhongeringskamer te creëren.Om een controle behandeling kamer te maken, plaats vijf milliliter van Bloomington standaard maïsmeel voedsel in een zes centimeter petrischaal. Wanneer de kamers klaar zijn, gebruik dan een kleine verfborstel om instarlarven van dezelfde grootte van de eierlegfles te verzamelen. En 20 larven willekeurig in elke honger en de controlekamer.Plaats vervolgens de kamers in de couveuse voor 12, 24 of 36 uur ontwikkeling en/of honger. Gebruik aan het einde van de behandelingsperiode tangen om larven van elke kamer voorzichtig over te brengen naar een dissectieplaat met ijskoude PBS en leg de plaat onder een stereomicroscoop. Oriënteer de eerste larve ventrale kant omhoog en gebruik tangen om de larve voorzichtig op zijn plaats te houden.Plaats een pin door de keelholte en een andere pin door de spiracle om de larve vast te zetten op de plaat. Gebruik vannas veerschaar om een longitudinale incisie te maken via de opperhuid van het voorste naar het achterste uiteinde van het dier. Gebruik tangen om het interne weefsel van de opperhuid te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat schade aan de oenocyten op het interne oppervlak van de opperhuid wordt voorkomen.Gebruik vervolgens tangen om de dissectiepennen op te halen en de opperhuid over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis van PBS op ijs. Voor lipidedruppel kleuring, incubeer de ontleed opperhuid in fixatie buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotator, gevolgd door een snelle resuspension in een milliliter PBS. Was vervolgens de monsters met drie vijf minuten wasbeurten in een milliliter PBS per wasbeurt om eventuele resterende fixatief te verwijderen.Na de laatste wasbeurt, incubeer de epidermale monsters met een geschikte lipofiele sonde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotator. Wikkel tijdens de incubatie de monsterbuizen in folie om de weefsels tegen licht te beschermen en was de monsters drie keer in één milliliter PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Om de oenocyten in beeld te brengen, breng je elk opperhuidmonster over in zes microliter van het montagemedium op een schone microscoopdia, pas je de oriëntatie van het weefsel aan, zodat het interne oppervlak met de oenocyten de onderkant van de dia aanraakt.Plaats voorzichtig een coverlip op de opperhuid en sluit de randen af met heldere nagellak. Wanneer de polish is gedroogd, beeld de monsters op een confocale microscoop, zet een 63 X vergroting met de juiste opwinding en emissie golflengten. Er zijn een paar detecteerbare lipidedruppels in de oenocyten van normale voedende larven in verschillende ontwikkelingsstadia.Zoals waargenomen in deze representatieve beelden echter, de lipide druppels toenemen in aantal binnen de oenocyten in reactie op 12, 24, en 36-uur perioden van honger. Deze methode biedt en eenvoudig en een haalbaar protocol voor onderzoekers op relevante onderzoeksgebieden om te onderzoeken of genetische of milieumanipulaties lipidedruppelveranderingen in cellen veroorzaken.

dissection-lipid-droplet-staining-oenocytes-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bij insecten, het oenocytes produceren cuticulair koolwaterstofverbindingen. Deze verbindingen te beschermen tegen uitdroging en vergemakkelijken chemische communicatie. Hier laten we zien een dissectie techniek die gebruikt wordt om de oenocytes isoleren van...

Dissectie van Oenocytes tegen Adult Drosophila melanogaster</em

Hoe niches en stamcellen vorm tijdens de ontwikkeling is een belangrijke vraag met praktische implicaties. In...

Dissectie en kleuring van de Drosophila Larvale Eierstokken

De beperkende factor in het gebruik van de...

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netvliezen

This video demonstrates lipid droplet staining in Drosophila larval oenocytes - hepatocyte-like cells - using the lipophilic fluorescent BODIPY based dye. These cells act as a model for studying lipid metabolism during development and in response to environmental stress such as starvation.

Lipid Droplet Staining of Larval Drosophila Oenocytes: A Technique for Assessment of Lipid Droplet Accumulation Under Normal and Stressed Condition Using BODIPY-Based Dye

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

De Drosophila eierstok is een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel niche ontwikkeling. Hoewel de methoden voor het ontleden van larvale en volwassen eierstokken zijn gepubliceerd, vereisen pop eierstok dissecties verschillende technieken die niet zijn gepubliceerd in detail. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor ontleden, kleuring en montage van de pop eierstokken.

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Leer oenocytendissectie en lipidedruppelkleuring met BODIPY 493/503 in Drosophila-larven. Deze methode maakt visualisatie van lipideopslag mogelijk onder normale en stressomstandigheden voor metabool onderzoek.

Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven

Meer video's verkennen