Name: In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer een in vivo-infectiemethode met Leishmania amazonensis om parasietvirulentie in muizen te evalueren. Dit protocol maakt gelijktijdige beoordeling van de ontstekingsreactie van de gastheer en parasietreplicatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen prof. dr. Niels Olsen Saraiva Câmara van het Animal Center van het Biomedical Sciences Institute van de Universiteit van São Paulo bedanken voor de steun en prof. dr. Silvia Reni Uliana voor het leveren van de glasweefselmolen. Dit werk werd ondersteund door Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' subsidie 2017/23933-3).

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn en gebruik van het Instituut voor Biowetenschappen van de Universiteit van São Paulo (CEUA 342/2019), en werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen en het beleid voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de staat São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) en de Braziliaanse regering (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle stappen beschreven in secties 1-5 moeten aseptisch worden uitgevoerd in laminaire stroomkasten. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gebruikt tijdens het hanteren van levende Leishmania parasieten.
1. In Vitro Differentiatie van L. amazonensis Promastigotes in Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38
OPMERKING: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasiet werd gebruikt in deze test. Afhankelijk van het onderzoeksdoel kan de infectieve parasietvorm worden verkregen door zuivering van de metacyclische vorm met behulp van een dichtheidsgradiënt, zoals eerder beschreven14, of door differentiatie van promastigoten in axenic amastigoten, volgens het volgende protocol.
<ol><li>Kweek La promastigoten in een 25 cm2 celkweekkolf met 10 mL medium voor promastigoten (pro-medium) (pH = 7.0).</li>
	<li>Incubeer 3 dagen bij 25 °C. OPMERKING: Gebruik promastigote culturen die werden doorgegeven in vitro minder dan 10x om het verlies van virulentie en aneuploïdie veranderingen van parasieten39,40,41,42,43,44.</li>
	<li>Pipette 5 mL logaritmische groeifase promastigote cultuur in een nieuwe 25 cm2 kolf.</li>
	<li>Voeg 5 mL medium toe voor axenic amastigoten (ama-medium) (pH = 5.2).</li>
	<li>Incubeer 34 °C gedurende 3-4 dagen.</li>
	<li>Splits de cultuur door te verdunnen met ama-medium bij een verhouding van 1:3 in een nieuwe kolf van 25 cm2.</li>
	<li>Incubeer 34 °C gedurende 3-5 dagen. OPMERKING: Broed de axenic amastigoten voor maximaal 5 dagen, omdat het het einde van de rijping37vertegenwoordigt.</li>
</ol>2. C57BL/6 Footpad Infectie met L. amazonensis
OPMERKING: Vrouwelijke C57BL/6 muizen (6-8 weken oud) werden verkregen en onderhouden in het Animal Center van het Biomedical Sciences Institute van de Universiteit van São Paulo. Dieren kregen voedsel en water ad libitum.
<ol><li>Tel de cultuur van axenic amastigoten door het overbrengen van een aliquot van de parasiet schorsing verdund in PBS naar een Neubauer kamer (dat wil zeggen, hemocytometer). Tel de niet-flagellated parasieten, die amastigotes vormen vertegenwoordigen. OPMERKING: Als alternatief kan Trypan blauw (1:1) worden gebruikt voor het tellen van het aantal levensvatbare amastigoten (d.w.z. die niet bevlekt met Trypan blauw).</li>
	<li>Verdun de axenic amastigoten in PBS volgens de gewenste entculumdosis en het aantal beoogde endoortingen (1 x 106 axenic amastigoten in 50 μL PBS wordt aanbevolen).</li>
	<li>Laad een tuberculinespuit met een 27 G naald met de voorbereide parasietsuspensie.</li>
	<li>Verdoven een C57BL / 6 muis met behulp van 3-5% isoflurane, zoals aanbevolen door Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Beoordeel de verdovingsdiepte door de reactie van de muis op een teensnuifje te testen.</li>
	<li>Inenting 50 μL van de gehomogeniseerde parasietsuspensie (1 x 106 axenic amastigoten of de gewenste inoculumdosis) in het subplantaire weefsel van het linker achtervoetpad, met behulp van de eerder geladen tuberculinespuit (stap 2.3).</li>
</ol>3. Muis voetpad Laesie Ontwikkeling
<ol><li>Meet de progressie van de laesie één keer per week door de dikte van de linker (geïnfecteerde) en de rechter (niet-geïnfecteerde) voetzolen te meten met behulp van een remklauw.</li>
	<li>Bereken het verschil van de dikte tussen de linker en rechter achtervoetkussens per week om laesieprogressie te evalueren.</li>
	<li>Plot de berekende verschillen op de Y-as en de tijd van infectie op de X-as en bereken de statistische significantie. OPMERKING: In overeenstemming met de aanbevelingen van de Comités voor dierenverzorging en gebruik moeten dieren worden geofferd voordat de besmette laesie wordt zweren, omdat huidzweren kunnen leiden tot secundaire infectie. Zoals blijkt uit aanvullende figuur 1, duurt het ongeveer 10 weken voordat de laesies tekenen van ulceratie vertonen met de parasietdosis (106 axenic amastigoten) en gastheerstam (C57BL/6) die in dit protocol worden gebruikt. De muizen moeten worden geofferd voor laesieextractie voordat de tekenen van ulceratie worden waargenomen.</li>
</ol>4. Muizen Voetpad Laesie extractie en parasiet beperken verdunning
<ol><li>Bereid een 96 putplaat (platte bodem) voor de beperkende verdunningstest46,47 door 180 μL pro-medium aan alle putten toe te voegen. OPMERKING: Gebruik vier plaatstroken (de helft van de plaat) voor elk dier, wat neerkomt op vierdubbele testen (d.w.z. dier 1 = rijstroken A-D; dier 2 = rijstroken E-H).</li>
	<li>Voeg 1 mL pro-medium toe in een glasweefselmolenbuis per laesie en weeg de buis. LET OP: De buis moet steriel worden gehouden, dus gebruik een steriel deksel en weeg de buis met het gesloten deksel, bij het wegen buiten de laminaire stroomkast.</li>
	<li>Offer het dier op in een CO 2-kamer, volgens de aanbevelingen van de Comités voor Dierenverzorging en Gebruik. Desinfecteer het dier door te spuiten met 70% ethanol.</li>
	<li>Accijns de voet van het dier op de hielen om het geïnfecteerde voetpad te extraheren en spray 70% ethanol op het voetpad voor desinfectie. Zorg voor de sterilisatie van scharen en tangen door ze gedrenkt te houden in 70% ethanol.</li>
	<li>Plaats het geïnfecteerde voetpad in een steriele petrischaal en ontleed met behulp van steriele tangen en een scalpel om alle zachte weefsels te verzamelen. Gooi de botten weg. OPMERKING: Uniformiteit in de dissectie stap wordt aanbevolen om bevooroordeeld weefsel herstel te voorkomen.</li>
	<li>Breng de verzamelde weefsels met pro-medium over op de buis van de glasweefselmolen en weeg de buis opnieuw om het laesiegewicht te bepalen. OPMERKING: Vermijd het plaatsen van de tangen en scalpel direct in het medium, als kleine volumes kunnen worden verwijderd, wat resulteert in een onderschat weefsel gewicht. Het gewicht van de laesie wordt berekend door het gewicht van de buis die pro-medium bevat met het verzamelde weefsel af te trekken van het gewicht van buis die alleen pro-medium bevat.</li>
	<li>Homogeniseren van het weefsel 10x met behulp van de molen voor volledige weefselverstoring.</li>
	<li>Laat het mengsel 10 min sediment en verzamel vervolgens 20 μL van het supernatant.</li>
	<li>Laad 20 μL van de supernatant in de1e kolom van de1e rijstrook van de 96 goedplaat bereid in stap 4.1. Herhaal dit voor de volgende drie rijstroken om quadruplicaten te hebben voor elk dier (d.w.z. voor dier 1 voeg 20 μL toe aan elke put en label A1, B1, C1 en D1).</li>
	<li>Homogeniseren elke put in de1e kolom 10x met behulp van een multichannel pipet. Breng vervolgens 20 μL van de verdunde monsters over van de1e kolom naar de2e kolom. OPMERKING: Het is belangrijk om elke put 10x van de ene kolom naar de volgende te homogeniseren.</li>
	<li>Herhaal stap 4.10 voor alle resterende kolommen tot de laatste kolom (12e)en gooi de laatste 20 μL verdund monster weg. OPMERKING: Verander de tips na elke verdunning om kruisbesmetting te voorkomen.</li>
	<li>Sluit de platen 7 dagen lang af met een folie en incubeer bij 25 °C in een vochtige kamer.</li>
</ol>5. Laesie Parasiet Load Bepaling
<ol><li>Analyseer de platen na 7 dagen incubatie met behulp van een omgekeerde microscoop om de laatste parasiet-bevattende goed voor elke rijstrook te bepalen. OPMERKING: Het is ook mogelijk om een indicatie te hebben van de groei van de parasieten, of celdichtheid, door visuele analyse van de kleurveranderingen en troebelheid van het medium.</li>
	<li>Bereken de belasting van het parasietweefsel voor elke rijstrook door de verdunningsfactor per laesiegewicht te delen. OPMERKING: In een specifieke rijstrook, als parasieten alleen aanwezig zijn in kolommen 1-5 (d.w.z. putten A1-A5 zijn positief voor de groei van parasieten), betekent dit dat kolom 5 slechts 1 parasiet bevatte, kolom 4 10 parasieten bevatte, enzovoort, in veelvouden van tien. Kolom 1 zou 104 parasieten bevatten, wat het aantal parasieten in de eerste 20 μL supernatant (het niet-verdunde monster in stap 4.7) vertegenwoordigt. Omdat deze 20 μL werd verdund met 180 μL pro-medium, bevatte de initiële buis 5 x 105 parasieten: (1 x 104) / (0,02 mL) = 5 x 105 parasieten/1 mL. Vervolgens kan de parasietbelasting in die laesie worden berekend door de initiële concentratie van de parasiet te delen door het laesiegewicht: (5 x 105) / laesiegewicht (zie stap 4.6).</li>
	<li>Plot het gemiddelde van het vierdubbele resultaat voor elk dier met een log Y-schaal.</li>
</ol>6. Statistische analyse
<ol><li>Vertegenwoordig de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie met ten minste vijf dieren per experimentele groep als repliceert.</li>
	<li>Voer statistische analyse uit met behulp van ongepaarde tweezijdige tests, waarbij een p-waarde < 0,05 als significant wordt gezien.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De in vivo infectietest beschreven in dit protocol stelt elke onderzoeker in staat om in vivo cutane leishmaniasis te evalueren, gezien de interactie tussen gastheer en parasiet in een systemisch scenario. Deze tests zijn gebruikt door vele groepen22,24,27,29,31,32,34,<sup class="...

Leishmaniases zijn wereldwijd voorkomende parasitaire infectieziekten die belangrijke uitdagingen in ontwikkelingslanden vertegenwoordigen en worden door de Wereldgezondheidsorganisatie1,2erkend als een van de belangrijkste verwaarloosde tropische ziekten. De leishmaniasen worden gekenmerkt door cutane, slijmvlies, en / of viscerale manifestaties. Cutane leishmaniasis wordt meestal veroorzaakt door L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica en L. aethiopica3. Deze vorm van de ziekte is vaak zelfherstellend bij de mens als gevolg van de inductie van beschermende cellulaire immuunrespons. Echter, de cellulaire immuunrespons kan mislukken, en de ziekte kan vooruitgang boeken om te verspreiden cutane leishmaniasis4,5. Er is geen vaccin beschikbaar vanwege de diversiteit onder Leishmania soorten en gastheer genetische achtergronden6,7. Behandelingsopties zijn ook beperkt omdat de meeste momenteel beschikbare geneesmiddelen duur, giftig en/of langdurige behandeling vereisen8,9. Bovendien zijn er meldingen van resistentie tegen geneesmiddelen tegen de beschikbare behandelingen10,11.
De veroorzaker van leishmaniases is de protozoan parasiet Leishmania. De parasiet presenteert twee verschillende morfologische vormen in zijn levenscyclus: promastigoten, de flagellated vorm gevonden in zandvliegen; en amastigoten, de intracellulaire vorm gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheer macrofagen12,13. Amastigotes ' vermogen om binnen te vallen, overleven, en repliceren, ondanks de verdediging mechanismen van de gewervelde gastheer macrofagen zijn onderworpen aan vele studies14,15,16,17. Bijgevolg hebben verschillende onderzoeksgroepen in vitro macrofaaginfectietests beschreven om de impact van specifieke omgevingsfactoren te evalueren, evenals parasiet- en gastheergenen op infectiviteit van parasieten. Deze test biedt verschillende voordelen, zoals het vermogen om studies aan te passen aan een hoog doorvoerformaat, een relatief kortere periode om resultaten te verkrijgen en een verminderd aantal geofferde proefdieren18. De bevindingen van in vitro tests zijn echter beperkt omdat ze niet altijd repliceren in vivo studies14,19,20,21. In vivo testen bieden een systemisch fysiologisch overzicht van de host-parasiet interactie, die niet volledig kan worden nagebootst door in vitro testen. Immunologische studies kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van immunohistochemische testen van verzamelde delen van het voetpadweefsel of zelfs van popliteale lymfeklieren voor analyse van de teruggewonnen immuuncellen22.
Dieren worden vaak gebruikt als model voor menselijke ziekten in biologisch en biomedisch onderzoek om de onderliggende fysiologische mechanismen van de ziekten beter te begrijpen23. In het geval van leishmaniasis beïnvloedt de route, de plaats of de dosis inenting de uitkomst van de ziekte24,25,26,27. Bovendien worden de gevoeligheid en de weerstand tegen de infectie bij mensen en muizen sterk gereguleerd door de genetische achtergronden van de gastheer en parasiet4,5,22,28,29,30,31. BALB/c muizen zijn zeer gevoelig voor L. amazoneensinfectie, die een snelle ziekteprogressie vertonen met de verspreiding van de parasieten naar de lymfeklieren, milt en lever32. Aangezien de ziekte kan vorderen tot cutane metastasen, kan de infectie fataal zijn. C57BL/6 muizen ontwikkelen daarentegen vaak chronische laesies met aanhoudende parasietbelastingen in L. amazonensis-infectie assays33. Daarbij, L. amazonensis infectie met deze bijzondere muissoort is beschouwd als een uitstekend model om chronische vormen van cutane leishmaniasis bij de mens te bestuderen, omdat het bootst de ziekte progressie beter dan de BALB / c muizen infectie model5,34.
Daarom stellen we voor dat de murine in vivo infectie een nuttige methode is voor Leishmania virulentie fysiologische studies die van toepassing zijn op de menselijke ziekte, waardoor een systemisch beeld van de interactie tussen gastheer en parasiet mogelijk is. Herbezoeken gevestigde assays22, presenteren we hier een gecompileerde stap-voor-stap protocol van de in vivo infectie van C57BL / 6 muizen met L. amazonensis die de parasiet differentiatie in axenic amastigotes, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling omvat. Dit protocol kan worden aangepast aan andere muizenstammen en Leishmania soorten die cutane leishmaniases veroorzaken. Tot slot, de hier gepresenteerde methode is cruciaal bij het identificeren van nieuweanti-Leishmania drug doelen en vaccins, evenals in fysiologische studies van de gastheer immuun en metabole reacties op Leishmania infectie.

<table><tbody><tr><td>96-well plate</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>Een plaat met platte bodem voor beperkende verdunningstests</td></tr><tr><td>adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>caliper</td><td>Mitutoyo</td><td>700-118-20</td><td>Een schuifmaat om de dikte van de voetkussen te meten</td></tr><tr><td>cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Een celcultuurkolf van 25 cm2 om Leishmania parasieten te kweken</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Een apparaat gebruikt voor het scheiden van monsters op basis van dichtheid</td></tr><tr><td>CO2 incubator 34 &deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>Een incubator voor amastigotendifferentiatie</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Merck</td><td>K50237083820</td><td>Een ontsmettingsmiddel voor algemene items</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>glass tissue grinder tube</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431 E04</td><td>Een buis om besmet voetkussentissue te verzamelen en te verstoren</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Synth</td><td>G1008.01.AH</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Een software gebruikt om de gegevens uit te zetten en statistische significantie te berekenen</td></tr><tr><td>hemin</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>incubator 25 &deg;C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>Een incubator voor promastigotencultivatie</td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Een apparaat gebruikt voor visuele analyse van promastigoot en amastigoot culturen</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td></td><td></td><td>Een inhalatieanestheticum voor muizen (3-5%)</td></tr><tr><td>laminar flow cabinet</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>Een bioveiligheidskast gebruikt voor aseptische werkruimte</td></tr><tr><td>M199 celcultuur media</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>Een celcultuurmedium voor Leishmania-cultivatie</td></tr><tr><td>microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>Een microbuis gebruikt voor monsterverzameling, verwerking en opslag</td></tr><tr><td>multichanel pipette</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>Een multikanaals pipette gebruikt voor beperkende verdunningstest</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>HBG</td><td>2266</td><td>Een hemocytometer om de parasietensuspensie te tellen</td></tr><tr><td>optical microscope</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>Een optisch apparaat gebruikt om parasieten te tellen</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Bemis</td><td>349</td><td>Een flexibele en resistente kunststof om de plaat te verzegelen</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Een steriele schaal om het voetkussentissue te dissecteren</td></tr><tr><td>pipetman kit</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td>Een micropipetkit met vier pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td></tr><tr><td>scale</td><td>Quimis</td><td>BG2000</td><td>Een apparaat gebruikt om verzamelde voetkussenlaesies te wegen</td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>Een scalpel om voetkussentissue te snijden en te verzamelen</td></tr><tr><td>serological pipette 10 mL</td><td>Nest</td><td>327001</td><td>Een steriele pipette gebruikt voor het overbrengen van milliliter volumes</td></tr><tr><td>tips</td><td>Axygen</td><td></td><td>Een pipette tip gebruikt voor het overbrengen van microliter volumes</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Een kleurstof gebruikt om levensvatbare parasieten te tellen</td></tr><tr><td>trypticase peptone</td><td>Merck</td><td></td><td>Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media</td></tr><tr><td>tuberculin syringe</td><td>BD</td><td>305945</td><td>Een spuit met 27G naald om de parasietensuspensie te inoculeren</td></tr></tbody></table>

in vivo infectie met leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. zijn protozoan parasieten die leishmaniases veroorzaken, ziekten die een breed spectrum van klinische manifestaties van cutane tot viscerale laesies presenteren. Momenteel, 12 miljoen mensen worden geschat te zijn besmet met Leishmania wereldwijd en meer dan 1 miljard mensen leven op het risico van infectie. Leishmania amazonensis is endemisch in Midden- en Zuid-Amerika en leidt meestal tot de cutane vorm van de ziekte, die direct kan worden gevisualiseerd in een diermodel. Daarom zijn L. amazonensis stammen goede modellen voor cutane leishmaniasis studies omdat ze ook gemakkelijk worden gekweekt in vitro. C57BL/6 muizen bootsen de L. amazonensis-gedrevenziekteprogressie na die bij mensen wordt waargenomen en worden beschouwd als een van de beste muizenstammenmodel voor cutane leishmaniasis. In de gewervelde gastheer bewonen deze parasieten macrofagen ondanks de afweermechanismen van deze cellen. Verschillende studies gebruiken in vitro macrofaag infectie testen om de parasiet infectiviteit te evalueren onder verschillende omstandigheden. De in vitro benadering is echter beperkt tot een geïsoleerd celsysteem dat de reactie van het organisme negeert. Hier compileren we een in vivo murineinfectiemethode die een systemisch fysiologisch overzicht biedt van de interactie tussen gastheer en parasiet. Het gedetailleerde protocol voor de in vivo infectie van C57BL/6 muizen met L. amazonensis omvat parasietdifferentiatie in besmettelijke amastigoten, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling. Wij stellen deze gevestigde methode voor als de meest geschikte methode voor fysiologische studies van de gastheer immuun- en metabole reacties op cutane leishmaniasis.

Leishmania protozoan parasieten bestaan in twee ontwikkelingsvormen tijdens hun levenscyclus in ongewervelde en gewervelde gastheren: promastigoten, de proliferative vormen gevonden in het lumen van de vrouwelijke zandvlieg; en amastigoten, de proliferative vormen gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheercellen. Promastigoten hebben een langwerpig lichaam van ongeveer 1,5 μm breed en 20 μm lang, met een flagellum die meestal uit de voorste extremiteit tevoo...

Hier presenteren we een samengesteld protocol om de cutane infectie van muizen met Leishmania amazonensiste evalueren. Dit is een betrouwbare methode voor het bestuderen van parasietvirulentie, waardoor een systemische weergave van de gewervelde gastheer respons op de infectie.

In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van Leishmania virulentie, omdat het een systemisch beeld geeft van de gewervelde gastheer van de cutane infectie. Het belangrijkste voordeel van de vaststelling van dit protocol is dat het onderzoekers in staat stelt om de host ontstekingsreactie en parasiet replicatie gelijktijdig te evalueren. Deze methode kan worden gebruikt voor het karakteriseren van verschillende doelen en behandelingen met betrekking tot virulentie, die nieuwe inzichten in cutane leishmaniasis controle zou kunnen brengen.Het kan ook worden toegepast op andere muizen stammen en Leishmania soorten die cutane leishmaniasis veroorzaken. Deze test heeft een aantal kritieke stappen, zoals het vereisen van opgeleid personeel dat comfortabel werken met muizen en ervaring hebben in het uitvoeren van subplantar injecties om onbedoelde blootstelling aan besmettelijk materiaal te voorkomen. Het aantonen van de procedure zal Dr. Ricardo Zampieri zijn, een technicus van mijn laboratorium.Begin met het kweken van L.amazonensis promastigotes in een 25 centimeter kwadraat celkweekkolf, met 10 milliliter pro-medium, gedurende drie dagen bij 25 graden Celsius. Na de incubatie, pipe

in-vivo-infection-with-leishmania-amazonensis-to-evaluate-parasite

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt om kwantitatieve metingen te genereren van muisinfecties met de Trypanosomatide protozoa Leishmania. Dit is een niet-invasieve en niet-lethale methode voor het detecteren van parasieten die luciferase tot expressie brengen in diverse weefsels gedurende het verloop van een chronische Leishmania spp. infectie.

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Optimalisatie van de experimentele hamster model voor cutane leishmaniasis door intradermale injectie...

Cutane leishmaniasis in het dorsale huid van Hamsters: een bruikbaar model voor de screening van antileishmaniale Drugs

This video investigates Leishmania's virulence by treating macrophages with metacyclic promastigotes, resulting in the formation of intracellular amastigotes. The confirmation of Leishmania's virulence is achieved through nucleic acid fluorescent dye staining. This insight can contribute to the development of new therapies for leishmaniasis.

Assessment of Leishmania Virulence within Cultured Macrophages

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor de dynamische meting en kwantificering van bloedstroomsnelheid binnen individuele bloedvaten van de muizenlevervaten met behulp van intravitale microscopie-beeldvorming in combinatie met een specifieke methodologie voor beeldverwerving en analyse.

Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

Hier presenteren we een longitudinale evaluatie van goudhamsters die intraperitoneaal (IP) of via intragingivaal (IG) zijn geïnfecteerd met L. infantum-Luc door middel van bioluminescente beeldvorming en door PCR. Hamsters werden 1 dag na infectie (1 dpi), 1 week na infectie (8 dpi) en 3 weken na infectie (22 dpi) geëvalueerd en geëuthanaseerd op de 50edpi en 8 maanden na infectie.

In vivo Beeldvorming van met Leishmania infantum geïnfecteerde hamsters door gingiva-inoculatie van axenische amastigoten die luciferase tot expressie brengen

Strongyloides ratti is een parasitaire nematode die voorbijgaande infecties veroorzaakt bij laboratoriummuizen, die weefselmigrerende en darmlevensstadia vertonen. Hier presenteren we een protocol voor het in stand houden van de parasietcyclus bij ratten en experimentele infectie van muizen, inclusief kwantificering van parasieten in het hoofd, de longen en de darmen.

Experimentele infectie van muizen met de parasitaire nematode Strongyloides ratti

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen...

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leer een in vivo-infectiemethode met Leishmania amazonensis om parasietvirulentie in muizen te evalueren. Dit protocol maakt gelijktijdige beoordeling van de ontstekingsreactie van de gastheer en parasietreplicatie mogelijk.

In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

Meer video's verkennen