Name: Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Ontdek een kosteneffectieve screeningsmethode voor remmers van membraangebonden pyrofosfatase uit Thermotoga maritima. Deze eenvoudige 96-well plaat aanpak met molybdeenblauwe reactie biedt stabiele kleurvorming voor biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de subsidies van de Jane en Aatos Erkko Foundation en de BBSRC (BB/M021610) aan Adrian Goldman, de Academie van Finland (nr. 308105) aan Keni Vidilaseris, (nr. 310297) aan Henri Xhaard, en (nr. 265481) aan Jari Yli-Kauhaluoma, en de studie fondsen van de Universiteit van Helsinki aan Gustav boije af Gennäs. De auteurs danken Bernadette Gehl voor haar technische hulp tijdens het project.

1. eiwit preparaat
Opmerking: de uitdrukking en zuivering van TmPPase is elders beschreven13.
<ol><li>Bereid 10 ml van de reactiverings Bufferoplossing met 20 mm 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (mes) pH 6,5, 3,5% (v/v) glycerol, 2 mm dithiotreïtol (DTT) en 0,05% dodecyl maltoside (DDM).</li>
	<li>Bereid 10 mL van het reactiemengsel met 200 mM tris-cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mm KCl en 67 mm NaCl. Opmerking: mg2 + is vereist om het pyrofosfaat te cheleren als het substraat van Mppase, K+ is nodig om de enzymactiviteit te verhogen, aangezien tmppase een kalium-afhankelijke mppase is en na+ nodig is voor de enzymactiviteit tijdens natriumiontranslocatie door tmppase.</li>
	<li>Bereid 30 mg/mL liposomen voor enzym reactivering.<ol>
<li>Voeg 10 mL 20 mM tris-HCl pH 8,0 toe met 1 mM DTT tot 0,3 g L-α-dunlaag van sojabonen tot 10 mL 20 mM tris-HCl pH 8,0 met 1 mM DTT.</li>
		<li>Zet het liposoom op ijs en sonificeren met 1 seconde puls interval gedurende 1 minuut, pauzeer gedurende 1 minuut en herhaal dit totdat de oplossing transparant geel wordt.</li>
		<li>Aliquot de liposomen, Vries in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C tot gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het enzym opnieuw activeren.<ol>
<li>Meng 40 μL van de liposomen oplossing met 22,5 μL van 20% DDM.</li>
		<li>Verwarm het mengsel gedurende 15 minuten bij 55 °C en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 36,5 μL van de reactiverings bufferoplossing toe, meng en voeg 1 μL geconcentreerd eiwit (13 mg/mL) toe om een totale concentratie van 0,13 mg/mL te maken. Opmerking: eiwitten worden gewoonlijk bevroren in 10 μL aliquots na zuivering en ontdooid op ijs voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neem 20 μL van het gereactiveerde enzym en voeg toe aan 1.480 μL van het reactiemengsel en meng vervolgens zachtjes. Opmerking: de toevoeging van het gereactiveerde enzym aan het reactiemengsel moet worden uitgevoerd vlak voordat het wordt gebruikt.</li>
</ol>2. samengestelde preparaat
<ol><li>Los de verbindingen in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) op om stamoplossingen van 25 − 100 mM te maken in 50 − 200 μL, op basis van de beschikbaarheid van de verbindingen. Opmerking: alle verbindingen die hier worden gebruikt (afbeelding 2A) zijn eerder gepubliceerd9. Als de samengestelde oplosbaarheid laag is, kan de voorraad concentratie dienovereenkomstig worden aangepast.</li>
	<li>Bereid drie verschillende concentraties van elke verbinding in water. NB: de uiteindelijke concentraties in het reactiemengsel zijn respectievelijk 1, 5 en 50 micromolar of 1,5 en 20 micromolaire voor oplosbare en slecht oplosbare verbindingen.<ol>
<li>Verdun de stamoplossing met water tot 1 mL in microbuisjes om 2 μM, 10 μM en 100 μM te geven voor oplosbare verbindingen, of als alternatief 2 μM, 10 μM en 40 μM voor slecht oplosbare verbindingen.</li>
		<li>Vortex de samengestelde oplossing onmiddellijk na verdunning van de stamoplossing voor een goede menging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer op samengestelde aggregatie met behulp van een nephelometer. Opmerking: dit werd bestudeerd als triplicaten in drie concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) en genormaliseerd naar de blanco in een 96 goed plaat.<ol>
<li>Verdeel 75 μL van het reactiemengsel in elke put met behulp van een multikanaalspipet.</li>
		<li>Voeg 75 μL van elke stof toe (voor de blanco, gebruik in plaats daarvan 75 μL water) en meng door pipetteren op en neer 5 ×.</li>
		<li>Meet elk goed op 300 V met behulp van een microplaat nephelometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. reagentia voor de bereiding van de assay
<ol><li>Bereid de arseniet-citraat oplossing.<ol>
<li>Weeg 5 g natrium arseniet en 5 g triatriumcitraat dihydraat af. VOORZICHTIG: natrium arseniet is giftig, dus gebruik de juiste beschermende uitrusting en handvat met speciale zorg. Behandel als voorzorgsmaatregel niet voordat alle noodzakelijke veiligheidsmaatregelen zijn gelezen en begrepen. Behandel alleen in een rook afzuigkap om stof/dampen van de stof of de oplossing (en) niet te inhaleren. Bij inademing, naar de frisse lucht gaan en medische hulp inroepen. Draag een geschikte chemische veiligheidsbril, beschermende handschoenen en kleding om inslikken en ogen/huidcontact te voorkomen. Bij inslikken onmiddellijk een Antigifcentrum of een arts raadplegen. Als het op de huid of in het oog (s), wassen met veel water en het verkrijgen van medische hulp.</li>
		<li>Los in 100 mL water.</li>
		<li>Voeg 5 mL ijsazijn, meng, en voeg water toe aan 250 mL.</li>
		<li>Bewaren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Opmerking: de oplossing is langer dan een jaar stabiel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oplossing A en oplossing B voorbereiden.<ol>
<li>Voeg voor oplossing A 10 mL ijskoude 0,5 M HCl toe aan 0,3 g ascorbinezuur. Los het ascorbinezuur op door vortexing.</li>
		<li>Voeg voor oplossing B 1 mL ijskoud water toe aan 70 mg ammonium heptamolybdaat tetrahydraat en Vortex om op te lossen. Opmerking: Bewaar beide oplossingen op ijs tot het gebruik. Voor de consistentie van het testresultaat kunnen beide oplossingen maximaal één week op ijs worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de fosfaat (Pi) standaard met de concentratie van 0 μM, 62,5 μm, 250 μm en 500 μm voor kalibratie.<ol>
<li>Voeg 0 μL, 25 μL, 50 μL en 100 μL van 5 mM na2HPO4 dihydraat toe aan vier microbuisjes met 370 μl van het reactiemengsel.</li>
		<li>Top tot 1 mL met water.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. activiteitstest voor 1 96 well plate
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor de schematische workflow van de assay.
<ol><li>Voeg 1 ml oplossing B toe aan 10 ml oplossing A, Meng door grondig en bewaar de oplossing op ijs. Opmerking: deze oplossing moet transparant en geel zijn. Houd de oplossing A + B op ijs gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik. Echter, gebruik de oplossing binnen 3 h als het slecht zal gaan na lange termijn opslag.</li>
	<li>Voeg met een multikanaalspipet 40 μL van 0 μM, 62,5 μM, 250 μM en 500 μM Pi standaard toe aan de buis stroken in drievat. Opmerking: het reactiemengsel met geen PIk toegevoegd zal worden gebruikt als een blanco.</li>
	<li>Voeg met een meerkanaalspipet 25 μL samengestelde oplossing toe aan de buis stroken. Opmerking: elke verbinding heeft drie verschillende concentraties in drievat wat voldoende is voor de initiële schatting van de halve maximale remmende concentratie (IC50). Voor een nauwkeurigere IC50 bepaling kunnen acht verschillende samengestelde concentraties worden gebruikt. Voor het niet-geremde enzym wordt de samengestelde oplossing vervangen door gelijke hoeveelheid water. Als positieve controles werden 2,5 μM, 25 μM en 250 μM van imidodifosfaat (IDP) natriumzout gebruikt.</li>
	<li>Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 15 μL mPPase-oplossing mengsel toe aan de buisstrips (behalve aan de buizen die Pi -standaard bevatten).</li>
	<li>Sluit de buis stroken af met een zelfklevende afdichtings plaat. Snijd de afdichtings plaat om elke buis strook te scheiden.</li>
	<li>Pre-incuberen de monsters gedurende 5 min bij 71 °C. Plaats de monsters op het verwarmingsblok met een interval van 20 s tussen elke strook om het tijdverbruik tijdens de volgende stappen te minimaliseren.</li>
	<li>Open de zelfklevende afdichting voor elke strook. Voeg 10 μL van 2 mM Natriumpyrofosfaat dibasisch toe met behulp van een multikanaalspipet en meng door pipetteren op en neer gedurende 5 ×. Sluit de buis strook opnieuw met dezelfde afdichting. Opmerking: deze stap kan in eerste instantie moeilijk te bereiken zijn in 20 s; echter, het zal gemakkelijker worden na sommige assays.</li>
	<li>Incuberen bij 71 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Plaats de monsters op het koelapparaat met een interval van 20 s tussen elke strook. Laat ze 10 min afkoelen, maar Centrifugeer elke strook kort na 5 min afkoeling, gietwater druppels onder de afdichtings plaat, zet het terug naar het koelapparaat en verwijder de afdichting. Opmerking: het koelapparaat kan eenvoudig worden gemaakt door het plaatsen van een 96 goed PCR-plaat op een polystyreen Petri schaal (maat 150 mm × 15 mm) gevuld met water en bevroren gedurende ten minste 1 uur. Het apparaat moet ongeveer 5 minuten vóór het begin van de test uit de vriezer worden gehaald. Haal het koelapparaat niet uit het midden voordat u het monster afkoelt, omdat het het reactiemengsel blokkeert en de kleurontwikkeling belemmert.</li>
	<li>Voeg na 10 min van de koeling 60 μL oplossing A + B toe, Meng door pipetteren op en neer gedurende 5 × en houd de buis stroken op het koelapparaat gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Voeg 90 μL van de arseniet citraat oplossing toe en houd gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur om een stabiele blauwe kleur te produceren. Let op: vanwege de toxiciteit moeten alle oplossingen die natrium arseniet bevatten, te allen tijde met extra verzorging worden behandeld. Zo moet de toevoeging van arseniet-citraatoplossing worden gedaan in een rook afzuigkap.</li>
	<li>Verdeel 180 μL van elk reactiemengsel in een heldere 96 goed polystyreen microplaat.</li>
	<li>Meet de extinctie van elke put bij 860 nm met behulp van een microplaat spectrofotometer.</li>
</ol>5. resultaat analyse
<ol><li>Gemiddelde van de triplicaten van elk monster en de Pi -normen. Vervolgens aftrekken met de blanco om het achtergrond signaal te elimineren.</li>
	<li>Maak een ijkcurve door het uitzetten van de extinctie (A860) waarden ten opzichte van de hoeveelheid Pi standaard (nmol) en voer een lineaire regressie uit om de trendlijn functie te verkrijgen met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>Bereken de fosfaat hoeveelheid (nmol) die vrijkomt uit de enzymatische reactie op basis van de bovenstaande lineaire regressie formule.</li>
	<li>Bereken de specifieke activiteit met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> waar NPi de hoeveelheid fosfaat is die vrijkomt uit de reactie (nmol), t is de reactietijd (min), en mTmPPase is de hoeveelheid zuivere tmppase die wordt gebruikt in de assay (mg).</li>
	<li>Bereken de procentuele activiteit voor elke concentratie van de remmer met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> waar saiis de specifieke activiteit van een monster met remmer en saun is de specifieke activiteit van de onbevangen monster.</li>
	<li>Bereken de logica50 (raming) en IC50 (raming) met een niet-lineaire regressie die past bij de 4-parameter dosis-responscurve met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> waar X is log van concentratie (μM), Y is activiteit (%), boven en onder zijn plateaus in dezelfde eenheid als Y (100% en 0%, respectievelijk), logica50 heeft dezelfde log eenheden als X, en Hill slope = helling factor of heuvel helling, die unitless is. Opmerking: de software (tabel met materialen) wordt gebruikt voor de montage. Gebruik de concentratie van 0,01 μM (in plaats van 0,00 μM) voor het monster zonder remmer, aangezien de logaritme van nul niet is gedefinieerd.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige screening van remmers voor membraan-gebonden pyrofosfatase van T. maritima in een 96 goed plaat formaat op basis van Vidilaseris et al.14. Dit protocol is goedkoop en gebaseerd op 12-fosforolybdisch zuur, dat wordt gevormd uit ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden en gereduceerd tot fosforolybdenum soorten met een duidelijke blauwe kleur12. Deze methode heeft de voorkeur boven andere proto...

Ongeveer 25% van de totale cellulaire eiwitten zijn membraan eiwitten en ongeveer 60% van hen zijn drug targets1,2. Een van de potentiële drug targets3, membraangebonden pyrofosfatasen (mPPases), zijn dimere enzymen die proton en/of natrium ion over het membraanpompen door hydrolyse van pyrofosfaat in twee orthofosfaataten4. mPPases kan worden gevonden in verschillende organismen5 zoals bacteriën, Archaea, planten, en protist parasieten, met uitzondering van mensen en dieren4. Bij protist parasieten, bijvoorbeeld Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii en Trypanosoma brucei, zijn mppases essentieel voor de parasiet virulentie6 en Knockout van deze expressie in de parasieten leiden tot falen bij het handhaven van intracellulaire pH bij blootstelling aan de uitwendige basis pH7. Vanwege hun belang en gebrek aan homologe eiwitten die aanwezig zijn in gewervelde dieren, kunnen mPPases worden beschouwd als potentiële geneesmiddel doelen voor protistal ziekten3.
De in vitro screening van mPPase-remmers in dit werk is gebaseerd op een TmPPase-modelsysteem. TmPPase is een natrium-ion-pomp en kalium-ion-afhankelijke mPPase van T. maritima en heeft zijn optimale activiteit bij 71 °c8. Voordelen van dit enzym zijn bijvoorbeeld het gemak in de productie en zuivering, goede thermische stabiliteit en hoge specifieke activiteit. Tmppase vertoont zowel een hoge gelijkenis als de volledige instandhouding van de positie en de identiteit van alle katalytische residuen aan de protist mppases3,9 en aan de opgeloste structuur van Vigna radiata10 mppase. De beschikbare structuren van TmPPase in verschillende conformaties zijn ook nuttig voor structuur gebaseerde drug design experiment (als virtuele screening en de Novo ontwerp).
Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van TmPPase remmers in een 96 goed plaat formaat (Figuur 1). Het protocol is gebaseerd op de colorimetrische methode van de molybdeen-blauwe reactie, die voor het eerst werd ontwikkeld door Fiske en Subbarow11. Deze methode omvat de vorming van 12-fosforzuurzuur uit het ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden, die vervolgens wordt gereduceerd tot karakteristieke blauw kleurige fosforolybdenum soorten12.

<table><tbody><tr><td>Adhesive sealing sheet</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium heptamolybdate tetrahydrate</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)</td><td>Nippon genetics</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl maltoside (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidodiphosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidyl choline from soybean lecithin</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent (Type 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 software</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 Heating block</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium meta-arsenite</td><td>Fisher Chemical</td><td>12897692</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Pi)</td><td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate dibasic</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

screening voor thermotoga maritima -membraan afhankelijke pyrofosfatase remmers

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Het membraan gebonden pyrofosfatasen (mPPases) zijn dimere enzymen die voorkomen bij bacteriën, Archaea, planten en protist parasieten. Deze eiwitten klieven pyrofosfaat in twee orthofosfaatmoleculen, die gepaard gaat met proton en/of natriumionen die over het membraanpompen. Omdat er geen homologe eiwitten voorkomen bij dieren en mensen, zijn mPPases goede kandidaten in het ontwerp van potentiële geneesmiddel doelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het scherm voor mPPase-remmers met behulp van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat systeem. We gebruiken mPPase van de thermofiele bacterie Thermo toga maritima (tmppase) als een model enzym. Dit protocol is eenvoudig en goedkoop en produceert een consistent en robuust resultaat. Het duurt slechts ongeveer een uur om het activity assay protocol te voltooien vanaf het begin van de assay tot de extinctie meting. Aangezien de blauwe kleur die in deze test wordt geproduceerd gedurende een lange periode stabiel is, kunnen de volgende test (s) onmiddellijk na de vorige batch worden uitgevoerd en kan de extinctie later voor alle batches tegelijk worden gemeten. Het nadeel van dit protocol is dat het handmatig wordt gedaan en dus kan worden vermoeiend en vereisen goede vaardigheden van pipetteren en tijd houden. Bovendien bevat de in deze bepaling gebruikte arseniet-citraatoplossing natrium arseniet, wat giftig is en met de nodige voorzorgsmaatregelen moet worden behandeld.

In dit protocol werden acht verbindingen (1 − 8) getest (Figuur 2a) samen met IDP, een gemeenschappelijke remmer van pyrofosfatasen, als een positieve controle. Elke verbinding werd getest in drie verschillende concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) in drievat. De workflow van de screening wordt afgebeeld in Figuur 1, beginnend bij monster-en reagens voorbereiding tot de extinctie meting bij 860 nm.
Aan het einde van dit protocol, na de ...

Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Ons protocol werkt als een hulpmiddel om verbindingen te vinden die de activiteit van membraangebonden pyrofosfatase remmen. En deze remmers kunnen worden gebruikt bij de behandeling van verschillende parasitaire ziekten. Dit protocol is goedkoop en eenvoudig produceren stabiele kleur voor een lange tijd zonder enige interferentie in de aanwezigheid van hoge fosfolipiden concentratie die nodig is voor enzym reactivering.Bereid 10 milliliter van de reactiveringsbufferoplossing, met 20 millimolar M-E-S bij PH 6,5, 3,5% volume glycerol, twee millimolar D-T-T en 0,05%D-D-M. Bereid 10 milliliter van de reactiemixer, met 200 millimolar tris hydrochloride bij PH acht. Acht millimolar magnesiumchloride, 333 millimolar kaliumchloride, en 67 millimolar natriumchloride.Voor te bereiden 30 milligram per milliliter liposomen voor enzym reactivering. Voeg eerst 10 milliliter van 20 millimolar tris hydrochloride toe bij PH acht, met één millimolar D-T-T tot 0,3 gram L alfasphatidylcholine van sojaboon. Zet het liposoom op ijs en soniceer met een seconde post-intervallen voor een minuut.Pauzeer een minuut en herhaal dit totdat de oplossing transparant geel wordt. Aliquot de liposomen in 100 microliters, bevriezen de vloeibare stikstof en op te slaan op negatieve 80 graden Celsius totdat gebruikt. Om het enzym opnieuw te activeren, ontdooit u de liposoomoplossing bij kamertemperatuur.Meng 40 microliter van de liposoomoplossing met 22,5 microliter van 20%D-D-M. Houd het mengsel op 55 graden Celsius gedurende 15 minuten. En laat het afkoelen tot kamertemperatuur.Voeg vervolgens 36,5 microliter van de reactiveringsbufferoplossing toe. Mix. En voeg een microliter geconcentreerd eiwit toe om een totale concentratie van 0,13 milligram per milliliter te maken. Breng vervolgens 20 microliter van het gereactiveerde enzym over naar 1480 microliter van het reactiemengsel.Meng voorzichtig en gebruik onmiddellijk. Los eerst de verbindingen op in D-M-S-O om voorraadoplossingen van 50 millimolar in 200 microliter te maken. Voor oplosbare verbindingen verdunnen de voorraad oplossing met water tot een milliliter in microbuizen, om twee, 10, en 100 micromolar te geven.Voor elke verdunning, vortex de samengestelde oplossing voor een goede mix. Controleer daarna op samengestelde divergentie en verdeel 75 microliters van het reactiemengsel in elke put in een 96-putplaat. Voeg 75 microliter van elke verbinding en water als controle in drievoud, en meng door pipetting op en neer vijf keer.Meet elke put op 300 volt met behulp van een microplate nephelometer. Ter voorbereiding van de arseniet citraat oplossing, gewicht vijf gram natrium arseniet en vijf gram trinatrium citraat dihydraat, los beide verbindingen in 100 milliliter water. Voeg vervolgens vijf milliliter glaciale azijnzuur toe.Meng, en voeg water toe aan 250 milliliter, op te slaan bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Bereid vervolgens oplossing A door 10 milliliter ijskoud 0,5 molar zoutzuur toe te voegen aan 0,3 gram ascorbinezuur Los het ascorbinezuur op door vortexen. Bereid oplossing B door het toevoegen van een milliliter ijskoud water tot 70 milligram ammonium tetrathiomolybdate tetrahydrat, en vortex op te lossen.Bewaar oplossing A en B op ijs. Voor te bereiden op de fosfaatnorm met een concentratie van nul, 62,5, 250 en 500 micromolar voor kalibratie. Voeg nul microliter, 12,5 microliter, 50 microliter en 100 microliter van 5 millimolar disodiumfosfaatdihydraat toe aan vier microbuizen die 370 microliter van het reactiemengsel bevatten.Vul tot een milliliter met water. Voeg nu een milliliter oplossing B toe aan 10 milliliter oplossing A, meng met de hand en bewaar de oplossing op ijs. Voeg met behulp van een multichannel pipet 40 microliter van nul, 62,5, 250 en 500 micromolarfosfaatstandaard toe aan de buisscripts in drievoud.Voeg vervolgens 25 microliter samengestelde oplossing en 15 microliter van M-P-P-A oplossing mengsel van elke buis. Behalve de buizen met fosfaatstandaard. Sluit de buisstrips af met een kleefafdichtingsplaat.Snijd de afdichtingsplaat om elke buisstrip te scheiden. Vervolgens, preculbaat van het monster gedurende vijf minuten op 71 graden Celsius. Plaats het monster op het verwarmingsblok met intervallen van 20 seconden tussen elke strook.Open voor elke strook de lijmafdichting. Voeg met behulp van een multichannel pipet 100 microliters van twee molaire natrium pyrofosfaat dibasic toe. En meng door op en neer te pipetten voor vijf keer.Sluit de buisstrip opnieuw af met dezelfde afdichting. Broeden weer op 71 graden Celsius gedurende vijf minuten. Plaats daarna de monsters op het koelapparaat met een interval van 20 seconden tussen elke strook.Laat ze vijf minuten afkoelen en vercentrifugeer elke strook kort om de waterdruppels onder de afdichtingsplaat te decanteren. Zet de strip terug naar het koelapparaat, verwijder de afdichting en laat ze nog vijf minuten afkoelen. Voeg vervolgens 60 microliters van oplossing A en B toe, meng door vijf keer op en neer te pipetten en houd de buisstrips nog 10 minuten op het koelapparaat.Voeg in een rookkap 90 microliter van de arsenietcitraatoplossing toe en houd minstens 30 minuten op kamertemperatuur. Om een stabiele blauwe kleur te produceren. Doe 180 microliter van elk reactiemengsel in een duidelijke 96-put polystyreen microplaat.Gebruik een microplate spectrofotometer om de absorptie van elke put op 860 nanometer te meten. In dit protocol werden acht verbindingen getest samen met I-D-P, een veel voorkomende remmer van pyrofosfatase als een positieve controle. Na de toevoeging van oplossing A en B, en arsenite citraat, een blauwe kleur in 30 minuten van incubatie bij kamertemperatuur.Alle drie de concentraties van niet-remmende verbindingen, weergegeven dezelfde blauwe kleurintensiteit. Evenals E-1 tot E-3 zonder remmer. Het perceel van enzymatische activiteit tegen de concentratie van elke geteste verbinding, toont aan dat de verbinding met remmingsactiviteit een niet-lineaire curve fitting vormde.De plot van I-D-P als een positieve controle, toont duidelijk een afname van de activiteit bij hogere concentraties. De remmingscurve voor verbindingen één, vijf, zes, zeven en acht. Toont half maximale remmende concentraties op respectievelijk 1,7 micromolar, 21,4 micromolar, 58,8 micromolar, 239,0 micromolar en meer dan 500 micromolar.Vergeet niet om voor te bereiden, de M-P-P-A oplossing. Net voor het begin van de test.

screening-for-thermotoga-maritima-membrane-bound-pyrophosphatase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een nieuwe methode gerichte evolutie eigen aan de thermostabiliteit van techniek is ontwikkeld en dus gevalideerd voor bacteriolytische enzymen. Na een ronde van willekeurige mutagenese, een geëvolueerd bacteriolytische enzym PlyC 29C3, weergegeven groter is dan tweemaal de restactiviteit in vergelijking met het wild-type eiwit na incubatie verhoogde temperatuur.

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Source: Vidilaseris, K., et al. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a colorimetric assay to screen inhibitors of bacterial membrane-bound pyrophosphatase (mPPase) by quantifying orthophosphate release. The method enables identification of compounds that inhibit mPPase from Thermotoga maritima, a potential antimicrobial drug target.

Screening Inhibitors of Bacterial Membrane-Bound Pyrophosphatase Using a Colorimetric Assay 

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

TLR-signalering speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele menselijke ontstekingsziekten, en het regelen van TLR-reacties door bioactieve nanopartikels wordt geacht in veel ontstekingsomstandigheden gunstig te zijn. THP-1-cel-gebaseerde reportercellen bieden een veelzijdig en robuust screeningsplatform voor het identificeren van nieuwe remmers van TLR-signalering.

Screening van bioactieve nanodeeltjes in phagocytische immuuncellen voor inhibitors van Toll-achtige Receptor Signalering

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

De mogelijkheid om doelbetrokkenheid door kandidaat-remmers in intacte cellen te beoordelen is cruciaal voor de ontdekking van geneesmiddelen. Dit protocol beschrijft een 384 goed formaat cellulaire thermische verschuiving test die betrouwbaar detecteert cellulaire doel betrokkenheid van remmers gericht op ofwel wild-type SHP2 of de oncogene varianten.

Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Ontdek een kosteneffectieve screeningsmethode voor remmers van membraangebonden pyrofosfatase uit Thermotoga maritima. Deze eenvoudige 96-well plaat aanpak met molybdeenblauwe reactie biedt stabiele kleurvorming voor biochemisch onderzoek.

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Meer video's verkennen