Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

De engraftment van tumoren op de kip chorioallantoïsche membraan, of CAM, kan worden gebruikt voor studies van tumorheiciteit, werkzaamheid van de behandeling of cellulaire crosstalk. Deze methode maakt kosteneffectieve snelle tumorgroei mogelijk in een immunotolerante in vivo setting. Met behulp van het CAM-model kunnen nieuwe therapeutische benaderingen snel worden getest met behulp van cellijnen of zelfs tumormonsters van patiënten.

De meest cruciale aspecten van dit protocol zijn het waarborgen van een goede CAM-vorming en het niet verstoren van de CAM of vasculatuur tijdens het openen van de eieren. Zet op ontwikkelingsdag zeven of acht, wanneer de CAM zich volledig heeft ontwikkeld, de eierdraaier uit en plaats ongeveer één tot drie eieren in het eierrek in de bioveiligheidskast. Met de lichten uitgeschakeld, plaats een ei candler tegen de eierschaal te identificeren en markeren van de locatie van de luchtcel van een ei, dan verplaatsen van het ei candler over de schelp om een groot bloedvat netwerk te vinden, het draaien van het ei als dat nodig is.

Een ideale vasculatuur zal vertakken in de buurt van het midden van het ei. Gebruik een marker om de vasculatuur te traceren die gebruikt moet worden voor implantatie. Gebruik na het weer inschakelen van het licht in de kap een draadloos draaigereedschap dat is uitgerust met een slijpsteen voor siliciumcarbide om een klein gaatje in de schaal direct boven het midden van de luchtcel te boren.

Wanneer het grootste deel van de schelp is verwijderd, maar met witte binnenmembraan intact, boor een ander klein gat waar de vasculaire venster zal worden geopend zoals net aangetoond. Wanneer het tweede gat klaar is, gebruik dan een 18-meter naald om het witte binnenste membraan voorzichtig door te prikken over de luchtcel en vasculatuur en zorg ervoor dat het witte binnenste membraan, maar niet de CAM, in het geheel van het geboorde gebied wordt verstoord. Met de kap weer uit, gebruik maken van het ei candler om te controleren of de luchtcel is overgebracht van het einde van het ei naar het gebied over de vasculatuur.

Plaats indien nodig vacuümbuis die in een pipetregelaar rond het gat over de oorspronkelijke luchtcel wordt geplaatst en breng voorzichtig zuigkracht aan in korte uitbarstingen om de luchtcel te verplaatsen. Markeer de omtrek van de nieuwe locatie van de luchtcel ongeveer 0,5 centimeter binnen de lucht CAM grens en bevestig een stuk verpakkingstape net groot genoeg om het gat over de nieuwe luchtcel te dekken. Na de voorbereiding van de andere twee eieren zoals net aangetoond, terug de eieren naar de broedmachine en open eventuele extra eieren voor het experiment in groepen van een tot drie, zoals aangetoond.

Wanneer alle eieren zijn geopend, breng een tot drie eieren met verplaatste luchtcellen naar het eierrek in een bioveiligheidskast en gebruik een draadloos draaigereedschap uitgerust met een cirkelvormig snijwiel om een kleine lijn over de luchtcelgrens volledig door de cel te snijden zonder de CAM of vasculatuur te verstoren. Met behulp van gebogen schaar, snijd rond de resterende luchtcel om een venster in de schaal te creëren en de levensvatbaarheid van het embryo te controleren. Levensvatbare embryo's tonen een uitgebreide vasculatuur, heldere albumine, embryobeweging en/of een zichtbare hartslag.

In niet-levensvatbare embryo's kan de CAM ondoorzichtig lijken met weinig of geen bloedvaten aanwezig en de embryo's kunnen klein of afwezig zijn zonder beweging of hartslag. Met behulp van Semkin tangen, trek kleine stukjes katoen uit een steriele katoenen bal en voorzichtig dep de CAM oppervlak van de levensvatbare embryo's om eventuele shell stof en puin te verwijderen, dan de shell opening te bedekken met een kwart stuk van zes bij zeven centimeter transparante film dressing zonder de CAM aan te raken en de eieren terug te keren naar de incubator met het geopende raam naar boven gericht. Gebruik een stuk eierrek, de rand van het ei rotator, of een ander geschikt item om alle eieren die blijven rollen prop.

Om de schorsing van de kankercel voor te bereiden op transplantatie, oogst de cellen uit de kankercelcultuur van belang en sediment de cellen door centrifugatie. Aspirate de supernatant en mechanisch resuspend de cellen in het resterende medium. Plaats de celsuspensie op ijs en gebruik een pipet om het volume van de cellen in medium te meten.

Vervolgens resuspend de cellen bij een concentratie van een tot twee miljoen cellen in 20 tot 100 microliter van medium aangevuld met 2,7 tot 4 milligram per milliliter extracellulaire matrix en eventuele groeifactoren of andere additieven van belang. Voor kankercel implantatie, met behulp van een anti-aanbakring, plaats maximaal zes eieren worden geïmplanteerd op het eierrek en rol de randen van de transparante film dressing naar het open raam om de film te verwijderen uit de schelpen. Controleer of de eieren levensvatbaar en gezond zijn.

Ideale eieren hebben een groot vat met kleinere vertakkingsvaten in het midden van het geopende gebied. Plaats met gebogen iriskrachten een steriele antiaanbakwand op de CAM over het vat, idealiter boven een takpunt. Gebruik een steriele glazen roerstaaf om de CAM voorzichtig te schuren en de kankercelsuspensie in het midden van de ring te schuren.

Wanneer alle cellen zijn geleverd, verzegel de opening met een stuk van zes bij zeven centimeter transparante filmdressing en label het ei met een geschikte implantaataanduiding. Plaats de eieren vervolgens stevig in de couveuse met de opening van de schelp rechtop. Om kankercellen te implanteren zonder het gebruik van een anti-aanbakring, de celsuspensie in een geschikte grootte pipetpunt aan te boren en het bovenste gedeelte van de tip voorzichtig uitwerpen van de pipetpunt en plaats de tip horizontaal in een steriele 10 centimeter weefsel kweekschotel.

Nadat de tips zijn geladen, plaats de schotel in een 37 graden Celsius incubator gedurende 15 tot 30 minuten, het controleren op polymerisatie na 15 minuten. Een kleine hoeveelheid vloeistof zal meestal lekken als elke tip wordt geplaatst in de schotel. Gebruik deze vloeistof om de omvang van de polymerisatie binnen de tip te schatten.

Wanneer de matrix klaar is, plaatst u een tip op een geschikte grootte pipet en druk de zuiger in om de gedeeltelijk gepolymeriseerde celsuspensie op de CAM te dwingen, idealiter over het vertakte punt van een groot goed ontwikkeld vat. Met behulp van deze methoden, zowel menselijke en murine eierstokkanker cellijnen en primaire tumor stukken resulteerde in de succesvolle engraftment van tumoren met morfologieën in overeenstemming met die waargenomen in andere in vivo modellen. Van de geteste tumortypes was de groei van eierstokkanker veel minder uitgesproken en meestal niet zichtbaar zonder de hulp van bioluminescentiebeeldvorming.

De effecten van het toevoegen van groeifactoren of hormonen op het moment van implantatie kan ook worden getest met behulp van deze methoden. Voor nierkanker, de implantatie van heldere cel niercelcarcinoom cellen uit gevestigde cellijnen of stukken van primaire menselijke niertumoren produceert snelle, robuuste tumorvorming. Verder, meerdere menselijke en murine prostaatkanker cellijnen en menselijke blaaskanker cellijnen en primaire tumor stukken waren gebruikt om tumoren met behulp van dit model vast te stellen.

Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat de CAM en de vasculatuur verstoren en ervoor zorgen dat de CAM zich niet aan de schaal houdt tijdens het openen van het raam. Na succesvolle engraftment kan het CAM-model worden gebruikt om de therapeutische werkzaamheid van behandelingen van belang of interacties tussen verschillende celtypen binnen een tumor te beoordelen.