Identificeren van remmers van de HBx-DDB1 interactie met behulp van een split Luciferase assay systeem

De HBX-DDB1-interactie is een cruciale stap voor het bevorderen van HPV-transcriptie van cccDNA, dus dit protocol kan een belangrijke troef worden om nieuwe therapeutische middelen voor HPV-functionele genezing te ontdekken. Onze procedure is eenvoudig en vereist slechts een korte tijd om te screenen. De interactie die ik meng kan in real-time worden gedetecteerd zonder dat er een cellyse nodig is.

Bovendien is de screening kwaliteit bevredigend met een hoge Z prime score. Remming van de HBX-DDB1-interactie leidt tot herstel van Smc5/6, wat resulteert in onderdrukking van HPV-transcriptie, eiwitexpressie en cccDNA-productie. Dit nieuwe mechanisme van antivirale werking kan de tekortkomingen van de huidige HPV-therapieën overwinnen.

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijke klasse van geneesmiddelen doelen. Het hier beschreven split-luciferase-gebaseerde zuur, dat zich richt op de interacties tussen virale en hasS-eiwitten, kan een nieuwe strategie bieden om behandelingen voor andere infectieziekten te ontwikkelen. Hoewel ons protocol eenvoudig en gemakkelijk te begrijpen is, kunnen sommige stappen moeilijk te reproduceren zijn zonder de visuele demonstratie.

Zo zal de visuele demonstratie een grote hulp zijn om ons protocol te begrijpen. Begin met het zaaien van vijf keer 10 tot de 5e HEK293T cellen in een 100 millimeter schotel met 10 milliliter DMEM, en uitbroeden ze 's nachts op 37 graden Celsius. Verdun de volgende dag elk van HBx-LgBit en SmBit-DDB1 een microgram en geeft DNA-plasmiden en DNA-condensatiebuffer af voor een totaal volume van 300 microliters.

Voeg 16 microliter versterker oplossing, en meng de buizen door vortexing voor een seconde. Incubeer het monster drie minuten op kamertemperatuur en voeg vervolgens 60 microliter transfectiereagens. Vortex de buis voor 10 seconden, en incubeer het monster voor nog eens acht minuten.

Ondertussen, aspirate het medium uit de schotel met de cellen en was ze met vijf milliliter PVS. Aspirate de PVS en voeg zeven milliliter DMEM. Voeg drie milliliter DMEM aan de buis met de transfectie complexen, pipet op en neer te mengen, en voeg het mengsel aan de cellen.

Dan, incubeer de cellen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide voor 10 uur. Na de incubatie, verwijder de gebruikte cultuurmedium, en was de cellen met vijf milliliter PVS. Verwijder de PVS op een milliliter van 0,25% trypsin EDTA, en broeden de cellen op 37 graden Celsius om ze los te maken.

Voeg vervolgens vier milliliter DMEM toe en verdeel het medium door het meerdere keren over het oppervlak van de cellaag te pipetten en breng de suspensie over naar een buis. Centrifugeer de cellen op 500 keer G gedurende vijf minuten, gooi dan de supernatant, en opnieuw opschorten van de cel pellet in een milliliter PVS. Herhaal de cetrifugatie en gooi de supernatant weg.

Dan, opnieuw opschorten de cel pellet met gebufferde cel cultuur medium aangevuld met 10%FBS tot een zaaien dichtheid van een miljoen cellen per milliliter. Pipette 50 microliters van de cel suspensie in elke put van een 96-put plaat, en de cellen terug te keren naar de 37-graden-celsius incubator voor 10 uur. Terwijl de cellen uitbroeden, verdun de screening verbindingen en oplosmiddel tot 13,5 X concentratie.

Voeg 12,5 microliter lichtgevende substraat toe aan elke put en broed de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur uit. Meet de uitgangslumnie met een luminometer en voeg onmiddellijk daarna vijf microliter van de verbindingen en gecontroleerde DMSO toe aan elke put. Meet de luminescentie om de 30 minuten gedurende twee uur en bereken vervolgens de remmende effecten van de verbindingen in vergelijking met de DMSO-behandeling.

De luminescentiesignalen van de basislijn werden gemeten en de signaal-achtergrondverhouding werd berekend om groter te zijn dan 80. De Z-priemgetal was groter dan 0,5, wat aangeeft dat dit testsysteem aanvaardbaar is voor screening met hoge doorvoer. Door de drempel te stellen op meer dan 40%-remming ten opzichte van de DMSO-only-controle, werd nitazoxanide geïdentificeerd als een kandidaat-medicijn.

We identificeerden eerder nitazoxanide als een remmer van de HBX-DDB1 interactie door een reactiviteits kleinschalige samengestelde bibliotheek met deze methode te screenen. Met behulp van nitazoxanide bevestigen we dat remming van de HBX-DDB1-interactie, die vermindering van virale transcriptie en de daaropvolgende virale productniveaus. Het optimale gedeelte van de gespleten luciferase dat tot een doeleiwit wordt gesmolten, moet vooraf worden bepaald.

In dit geval, HPX versmolten tot Large Bit op de C eindpunt van HPX en DDB1 gesmolten tot Small Bit aan het eindeinde eindeinde van DDB1 mits de beste resultaten.