Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Dus ons model maakt studie van de post-transcriptional modulatie van een specifieke transcriptie in alveolaire epitheliale cellen in de primaire cultuur en hun fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dus de voorbijgaande transfectie van primaire alveolaire epitheelcellen heeft een minimaal effect op de celfysiologie en metabolisme, wat een duidelijk voordeel vormt ten opzichte van klassieke protocollen met transcriptieremmers. Voor het genereren van een responsplasmid die een gen van belang uitdrukt, moeten de sequentie van het gen en de meervoudige kloonplaatsen van de inducible vector worden geanalyseerd om de herkenningssequenties in de meervoudige kloonplaatsen te identificeren die intern niet in het gen aanwezig zijn.

Met behulp van high fidelity taq polymerase en standaard overlap PCR technieken, flankeren het gen van belang met twee geselecteerde beperking enzym herkenning sites met behulp van designer primers. Een sequentie bij het coderen van de V5 epitoop van het gen van belang moet worden opgenomen om de expressie van het transfected gen te onderscheiden van endogene expressie. Mutanten kunnen worden gegenereerd door sequentiële verwijdering om de effecten van verschillende drie eerste onvertaalde gebieden op de stabiliteit van het mRNA van het gen te bestuderen met behulp van omgekeerde primers die een polyadenylation-site coderen die geleidelijk het drieste uiteinde van het onvertaalde gebied verwijdert.

Uiteindelijk kan de invoeging van het gen van belang worden bevestigd door beperkingsanalyse. De genoriëntatie en de afwezigheid van mutaties die mogelijk tijdens de RTPCR worden geïntroduceerd, kunnen worden bevestigd door sequencing. Voor de transfectie van primaire rattenlong type twee alveolaire epitheelcellen, zaad de cellen op een een keer 10 tot de zesde cellen per vierkante centimeter in 100 millimeter Petri gerechten in aanwezigheid van volledige minimale essentiële medium.

Cultuur voor 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide met vochtigheid. De volgende dag, voeg 500 microliter van volledig medium zonder antibioticum aan elke put van een nieuwe 12 put plaat en pre-warm de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg tijdens deze incubatie één microgram van de responsplasmik en één microgram regulerende vector toe aan één buis van 1,5 milliliter per put.

Was de epitheelcellen van de alveolaire met 10 milliliter per put van 37 graden Celsius PBS zonder calcium of magnesium en behandel de cellen met vijf milliliter per put van 37 graden Celsius 0,05%trypsine gedurende twee tot vier minuten in de celkweek incubator. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de trypsine met 10 milliliter per put van compleet medium zonder antibioticum en het verzamelen van de cellen in een nieuwe 50 milliliter buis. Was de schotel met vier milliliter vers medium om de resterende cellen te verzamelen en sediment de cellen door centrifugatie.

Resuspend de pellet in een milliliter PBS voor het tellen en centrifugeren van de cellen weer. Resuspend de pellet bij een dichtheid van vier keer 10 tot de zevende cellen per milliliter resuspensie buffer en voeg vier keer 10 aan de vijfde cellen aan elke buis van plasmid en vector met zachte menging. Plaats één buis in het elektroporatieapparaat en vul de buis met 3,5 milliliter elektrolytische buffer.

Druk de zuiger volledig onder om een vergulde elektrodepunt in een pipet te plaatsen en meng voorzichtig de buisinhoud. Voorzichtig aanzuigen van de cellen met een pipet en steek de pipet in de elektroporatie station totdat een klikkend geluid is gehoord. Selecteer het juiste elektroporatieprotocol voor epitheelcellen van alveolaire cellen en druk op Start op het touchscreen.

Onmiddellijk na de transfectie, verwijder de pipet en breng de cellen in een put van de voorverwarmde 12 put plaat. Wanneer alle cellen zijn geëlektrooeerd en verguld, plaats de plaat in de celcultuur incubator, ter vervanging van de supernatant in elke put met compleet medium met antibiotica na twee dagen. Het succes van de transfectie kan worden bevestigd door de expressie van EGFP zoals waargenomen door fluorescentiemicroscopie of stroomcytometrie met behulp van een controlevector.

Om de transcriptie van het gen van belang te remmen, 72 uur na de transfectie vervang de supernatant met een milliliter per goed van compleet medium aangevuld met een microgram per milliliter vers bereide adoxycycline. Om de halvetijd van het mRNA-halfleven van het belang gen te beoordelen, keert u de plaat terug naar de celkweek incubator van 15 minuten tot zes uur. Was een put met een milliliter ijskoude PBS voordat lysing de cellen met 500 microliters van lyse buffer van een commercieel verkrijgbaar fenol chloroform RNA extractie kit en zacht schudden op elk experimenteel tijdstip.

Isoleer vervolgens het RNA volgens kitinstructies en bepaal de RNA-opbrengst en -zuiverheid met spectrofotometrie op 230, 260 en 280 nanometer. Om de stabiliteit van het geïsoleerde RNA te bepalen, behandel u eerst één microgram van het totale RNA van elk monster met RNase-vrije DNase om eventuele plasmide DNA-sporen te verwijderen. Gebruik een commercieel verkrijgbaar cDNA synthese kit met een mix van oligo dT en willekeurige hexomer primers om de omgekeerde transcriptie-efficiëntie te verbeteren om het DNA uitgeput totaal RNA om te keren in cDNA volgens de instructies van de fabrikant.

Voeg 180 microliter moleculaire biologie kwaliteit water toe aan de 20 microliters van het reactiemengsel om de cDNA-reactie te verdunnen met een concentratie van vijf nanogram per microliter en verdun onmiddellijk de cDNA-mix met vers moleculair biologiewater om een 1,25 nanogram per microliterconcentratie te bereiken. Combineer vijf microliter van cyber groene kleurstof master mix met 0,1 microliter van moleculaire biologie grade water, 0,45 microliters van 7,5 micromolar forward primer, 0,45 microliter van 7,5 micromolar reverse primer, en vier microliter van 1,25 nanogram per microliter van cDNA om een totaal reactievolume van 10 microliter te verkrijgen. Plaats de monsters in een qPCR thermocycler en versterk het V5-taggen van belang en de tetrocycline transactivator voorschotampyl met behulp van de qPCR-omstandigheden zoals aangegeven en genereer een smeltcurve met hoge resolutie om de specifieke smelttemperaturen van de gewenste amplicons te beoordelen en om de afwezigheid van ruisamplylpieken te garanderen.

Deze pipet elektroporatie techniek vergemakkelijkt een 25 tot 30% transfectie efficiëntie tarief zoals waargenomen door de verhoudingen van EGFP cellen gedetecteerd door fluorescentie microscopie en flow cytometrie. De behandeling van alveolaire epitheelcellen met één microgram per milliliter doxycycline heeft op geen enkel moment tijdens de behandelingsperiode significante invloed op de expressie van endogene alfa ENaC mRNA. Met behulp van een transcriptie gecontroleerd plasmide expressiesysteem zoals aangetoond, V5 alpha ENaC signaal kan worden genormaliseerd volgens de tetracycline transactivator geavanceerde signaal om de efficiëntie van transfectie te bepalen met behulp van de dubbele delta kwantificering cyclus methode.

De halfwaardetijd van alfa ENaC mRNA is tot zeven keer korter in aanwezigheid van het tetracycline off systeem dan in aanwezigheid van actinomycine D, wat bevestigt dat actinomycine D leidt tot een artefactuele alpha ENaC mRNA stabilisatie. Verder, cyclohexamide en tumor necrose factor alpha behandeling aanzienlijk verminderd de stabiliteit van het transcript, terwijl lipopolysaccharides niet. Belangrijke veranderingen in de modulatie van V5 alpha ENaC mRNA stabiliteit kunnen worden veroorzaakt, afhankelijk van de verwijderde en opgenomen regio's van de drie eerste onvertaalde regio.

Bovendien vermindert de overexpressie van specifieke RNA-bindende eiwitten de stabiliteit van 5-alfa ENaC mRNA in vergelijking met transfectie met een lege pcDNA drie plasmide. Deze tool zal nuttig zijn voor het opvragen van nieuwe inzichten in de post-transcriptie regulatie van belangrijke genen die betrokken zijn bij de functie van alveololaire epitheel en hun fysiologische of pathologische omstandigheden.