Name: Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer een inducibleel expressiesysteem met pipet-electroporatie voor onderzoek naar mRNA-stabiliteit in primaire alveolaire epitheelcellen. Deze methode minimaliseert verstoring van de fysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Francis Migneault werd ondersteund door een beurs die werd verstrekt door het Quebec Respiratory Health Network en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) longtraining, een studentenschip van FRSQ en een studentenschip van de Faculté des Études Supérieures et Postdoctoraal, Université de Montréal. Dit werk werd ondersteund door de Gosselin-Lamarre Leerstoel klinisch onderzoek en de Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging van het Onderzoekscentrum van Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Ontwerp en generatie van de respons plasmid uitdrukken van het gen van belang (IGoI)
<ol><li>Gebruik een inducible tetracycline-off vector, zoals pTRE-Tight.</li>
	<li>Analyseer de volgorde van de GoI en de meervoudige kloonsite (MCS) van de vector om de beperkingssites in de MCS te identificeren die intern niet in de GoI aanwezig zijn.</li>
	<li>Isoleer primaire alveolar epitheelcellen uit mannelijke Sprague-Dawley rattenlongen zoals eerder beschreven19,20.</li>
	<li>Zuiver het totale RNA uit de alveolar epitheelcellen door RNA-extractie met behulp van een standaardmethode, zoals fenol/chloroformextractie of het gebruik van op silica gebaseerde RNA-spinkolommen.</li>
	<li>Reverse-transcriberen van de mRNA in complementaire DNA (cDNA) met behulp van oligo (dT) en high-fidelity reverse transcriptase.</li>
	<li>Gebruik high-fidelity Taq polymerase en standaard overlappende PCR-technieken om de GoI te flankeren met twee geselecteerde restrictieenzymherkenningssites met behulp van ontworpen primers.<ol>
<li>Laat de voorwaartse primer een Kozak consensus riosome binding site21 bevatten om expressieniveaus te verbeteren om eiwitexpressie parallel met mRNA-stabiliteit te bestuderen. Een sequentie die het V5-epitoop stroomopwaarts van de Ing codeert, moet worden opgenomen om de expressie van de transfected Ing i.g. te onderscheiden van endogene expressie(tabel 1).</li>
		<li>Laat de omgekeerde primer een polyadenylation signaal bevatten na de stop codon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mutanten kunnen worden gegenereerd door sequentiële verwijdering om de effecten van verschillende 3' UTR-regio's op de stabiliteit van het mRNA van de Ini te bestuderen met behulp van omgekeerde primers die een polyadenylationsite coderen die geleidelijk het einde van de 3' 3' UTR(figuur 6)verwijdert. Als alternatief kan pcr-gerichte mutagenese worden gebruikt om zich te richten op een specifieke interesseregio in de 3' UTR22.</li>
	<li>Verwerk de induceerbare vector en de wisselplaat met de eerder gekozen beperkingsenzymen bij de juiste incubatietemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door behandeling met fosphatase tijdens de vectorreactie gedurende 30 min om zelfligatie te voorkomen.</li>
	<li>Scheid de verteerde vector en voeg segmenten door elektroforese in een 1-1,5% agarosegel (concentratie afhankelijk van de grootte van de wisselplaat).</li>
	<li>Verzamel met behulp van een mes en een UV-licht de DNA-fragmenten met de gewenste wisselplaat en vector die moeten worden vastgestomeerd. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	<li>Zuiver de verzamelde segmenten van de agarosegel met behulp van een op silica gebaseerde PCR-zuiveringskit en meet de concentratie door spectrofotometrie op 260 nm.</li>
	<li>Ligate de Ini en de onducible vector met T4 DNA ligase met behulp van een vector: voeg molaire verhouding van 1:3 om de kans op ligatie te verhogen. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 uur.</li>
	<li>Zet de ligatiereactie om in competente E. coli (DH5α).<ol>
<li>Voeg 1-10 ng vector en gen toe aan een buis met 100 μL competente cellen. Incubeer de cellen 30 min op ijs en verwarm vervolgens de cellen bij 42 °C voor 45 s. Plaats de buis gedurende 2 min op ijs en voeg 900 μL RT LB-medium toe. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C met schudden bij 225 tpm.</li>
		<li>Verspreid 100 μL van de reactie op een LB agar plaat met een geschikt antibioticum (bijvoorbeeld 100 μg/mL ampicillin voor de pTRE-Tight vector) om de getransformeerde bacteriën te selecteren. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.</li>
		<li>Selecteer individuele kolonies met behulp van een inentingslus of een 20 μL-tip en incubeer 's nachts in 5 mL LB-medium met het geschikte antibioticum bij 37 °C met schudden. De getransformeerde bacteriën kunnen worden opgeslagen in glycerolvoorraden bij -80 °C bij een verhouding van 400:600 LB-medium tot glycerol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haal het plasmide-DNA eruit met behulp van plasmakolommen op basis van silica en meet de concentratie per spectrofotometrie op 260 nm. Bevestig de invoeging van de Ingoi door beperkingsanalyse en de oriëntatie ervan en de afwezigheid van mutaties die mogelijk tijdens RT-PCR worden geïntroduceerd door sequencing.</li>
</ol>2. Transfection van de respons plasmid die het gen van belang (Initi) uitdrukt in primaire alveolar epitheelcellen
<ol><li>Isoleer type II alveolar epitheelcellen van rattenlongen.</li>
	<li>Zaai de cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen/cm2 in 100 mm petrischaaltjes met een volledig minimaal essentieel medium (volledige MEM). Complete MEM is MEM aangevuld met 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycine, Septra (3 μg/mL trimethoprim en 17 μg/mL sulfamethoxazool), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7.3) en 2 mM L-glutamine. Kweek de cellen 24 uur bij 37 °C in 5% CO2 in een bevochtigde couveuse.</li>
	<li>Plaats de volgende dag 500 μL volledige MEM zonder antibioticum in elke put van een nieuwe 12-putplaat en verwarm de plaat 30 minuten lang bij 37 °C. Tijdens deze stap is het belangrijk om foetale runderserum te gebruiken dat vrij is van contaminatie tetracyclines of met een te laag niveau om de inducibiliteit te verstoren.</li>
	<li>Bereid 1,5 mL buizen met de plasmid met de inducible GoI (Goi plasmid) en de regelgevende vector (bijvoorbeeld pTet-Off) door toevoeging van 1 μg Ini plasmid en 1 μg van regelgevende vector per goed bij RT. Voor coexpressieexperimenten met RNA-bindende eiwitten (RBP) wordt 1 μg van een constitutieve vector (bijvoorbeeld pcDNA3) die de RPB van belang uitdrukt, toegevoegd aan de DNA-mix (figuur 7).</li>
	<li>Aanzuigen van het medium en voorzichtig spoelen de cellen met PBS (zonder calcium en magnesium) voorverwarmd op 37 °C.</li>
	<li>Voeg 5 mL van 0,05% trypsine voorverwarmd bij 37 °C en uitbroed de cellen tot de cellen zijn losgemaakt (2-4 min). Neutraliseer de trypsine door 10 mL volledig MEM toe te voegen zonder antibioticum.</li>
	<li>Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 mL, was de petrischaal met 4 mL medium om zoveel mogelijk resterende cellen te verzamelen en centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Trek de supernatant voorzichtig aan en gooi de pellet opnieuw op in 1 mL PBS. Tel en bereken het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant voorzichtig aan en breg de pellet opnieuw op in resuspensiebuffer bij een concentratie van 4 x 107 cellen/mL. Voeg de cellen van de 1,5 mL buis bereid in stap 2.4 bij een concentratie van 400.000 cellen per put en meng ze voorzichtig door op en neer te stampen.</li>
	<li>Plaats de buis in de elektroporatie-inrichting en vul deze met 3,5 mL elektrolytische buffer.</li>
	<li>Steek een vergulde elektrodetip in een pipet door de zuiger volledig te drukken. Meng voorzichtig de inhoud van de 1,5 mL buis en trek de cellen voorzichtig aan met de pipet. Wees voorzichtig om te voorkomen dat luchtbellen de tip binnendringen, omdat dit elektrische arcing zal veroorzaken tijdens elektroporatie en zal leiden tot verminderde transfection-efficiëntie.</li>
	<li>Steek de pipet in het elektroporatiestation totdat er een klikkend geluid is.</li>
	<li>Selecteer het juiste elektroporatieprotocol voor alveolar epitheelcellen, overeenkomend met een pulsspanning van 1.450 V en 2 pulsen met een breedte van 20 ms, en druk op Start op het touchscreen.</li>
	<li>Onmiddellijk na het transfection, verwijder de pipet en breng de cellen naar een goed eerder gevuld met volledige MEM zonder antibioticum dat is voorverwarmd tot 37 °C.</li>
	<li>Herhaal stap 2.11-2.14 voor de overige monsters.</li>
	<li>Schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig over het putoppervlak te verspreiden. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2 in een bevochtigde couveuse. Vervang na 2 dagen het medium door volledige MEM door antibiotica.</li>
	<li>Bevestig het succes van de transfection door de expressie van eGFP onder een fluorescentiemicroscoop of door stroomcytometrie te observeren met behulp van een controlevector (figuur 1). OPMERKING: Deze stap is optioneel en vereist een extra transfection stap met behulp van een andere plasmid uitdrukken eGFP, zoals pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>3. Inductie van de transcriptieremming van de Indez
OPMERKING: De cellen kunnen worden voorbehandeld met de gewenste behandelingen vóór doxycycline inductie om hun impact op mRNA stabiliteit te beoordelen (figuur 5).
<ol><li>Bereid een doxycycline stock oplossing van 1 mg/mL in gedeïoniseerd water. Bewaar de voorraadoplossing op -20 °C beschermd tegen licht. Doxycycline, een tetracycline derivaat, wordt gebruikt in plaats van tetracycline omdat het een langere half-life (2x) dan tetracycline heeft. Bovendien is een lagere concentratie van doxycycline vereist voor de volledige inactivering van de tet operon23. OPMERKING: Doxycycline kan de mRNA-expressie van de endogene IG beïnvloeden. Om dit te verifiëren, moet het effect van een behandeling van 24 uur met doxycycline op alveolarcellen worden getest om de afwezigheid van veranderingen in de Init-expressie te bevestigen (figuur 2).</li>
	<li>Bereid een verse 1 μg/mL doxycycline oplossing in volledige MEM 72 h posttransfection en verwarm deze tot 37 °C.</li>
	<li>Vervang het medium door 1 mL volledig MEM met 1 μg/mL doxycycline per put om de transcriptie van de Ini te remmen.</li>
	<li>Incubeer meerdere putten bij 37 °C in 5% CO2 voor verschillende hoeveelheden tijd van 15 min-6 uur om de mRNA halfwaardetijd van de Ini te beoordelen.</li>
	<li>Aan het einde van de behandeling, was de cellen met ijskoude PBS en lyse ze met een commercieel beschikbare fenol-chloroform RNA extractie kit door het toevoegen van 500 μL buffer per put en schudden van de plaat om de cellen te homogeniseren.</li>
	<li>Isoleer het RNA volgens het protocol van de fabrikant. Bepaal de RNA-opbrengst en -zuiverheid door spectrofotometrie op 230, 260 en 280 nm. RNA-monsters met respectievelijk 260:230 en 260:280-ratio's van respectievelijk 1,8 en 2,0 worden als zuiver beschouwd. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
</ol>4. Het bepalen van de mRNA stabiliteit van de Indev.
<ol><li>Behandel 1 μg totaal RNA met RNAse-vrije DNAse I (versterkingsgraad) om elk spoor van plasmidDNA te verwijderen dat de daaropvolgende DNA-versterking zou kunnen verstoren.<ol>
<li>Combineer in een 0,2 mL PCR-buis 1 μg totaal RNA, 1 μL van 10x DNase I-reactiebuffer, 1 μL DNAse I (1 U/μL) en RNAse-vrij water om een totaal volume van 10 μL te verkrijgen.</li>
		<li>Incubeer de reactie bij RT gedurende 20 min.</li>
		<li>Deactiveer DNAse I door 1 μL van 25 mM EDTA toe te voegen aan de 10 μL-reactiemix en de reactie gedurende 10 min bij 70 °C uit te broeden.</li>
	</ol></li>
	<li>Reverse-transcriberen van de DNA-uitgeput totale RNA in cDNA met behulp van een commercieel beschikbare cDNA synthese kit met een mix van oligo (dT) en willekeurige hexamer primers om de omgekeerde transcriptie efficiëntie te verbeteren.<ol>
<li>Voeg kort 4 μL 5x reactiemix, 1 μL omgekeerde transcriptase en 4 μL RNAse-vrij water toe aan 11 μL van de DNA-uitgeputte totale RNA-mix om een totaal reactievolume van 20 μL te verkrijgen. Meng de reactie goed door het op en neer te beten.</li>
		<li>Incubeer de reactie gedurende 5 min bij 25 °C, gevolgd door 20 min bij 46 °C, en activeer vervolgens de reactie door deze gedurende 1 min bij 95 °C uit te broeden. Elke reactie levert 50 ng/μL cDNA-product op.</li>
		<li>Verdun de cDNA-reactie tot een concentratie van 5 ng/μL door 180 μL moleculair biologisch waardig water toe te voegen aan de 20 μL-reactiemix. Bewaar de cDNA-producten op -80 °C of ga onmiddellijk over tot het uitvoeren van real-time kwantitatieve PCR (qPCR). LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontwerp vooruit en draai qPCR primers specifiek voor de GoI.<ol>
<li>Vanwege de endogene expressie van de Ini in de cellen, moeten de primers zijn ontworpen om een 100-150 bp amplicon van de V5-epitoop gekoppeld aan de Ini (tabel 1) te versterken.</li>
		<li>Interne referentiegenprimers moeten ook worden gebruikt als normalisatiecontrole. Meestal worden huishoudelijke genen, zoals de bèta-actine en hypoxanthine fosforibosyltransferase 1 genen, gebruikt als referentiegenen. Deze kunnen echter niet worden gebruikt met dit inductiesysteem vanwege de variatie van de transfection-efficiëntie. In plaats daarvan wordt de expressie van het tTA-Ad transcript beoordeeld met het oog op normalisatie, omdat de expressie ervan constitutief is in cellen als gevolg van de activiteit van de cytomegaloviruspromotor. Elke variatie in de expressie gemeten door qPCR zal representatief zijn voor de transfection-efficiëntie (primers: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' en reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) en zal de normalisatie van de expressie van de transfected klonen mogelijk maken (figuur 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid elke qPCR reactie in drievoud met behulp van een SYBR Green kleurstof master mix.<ol>
<li>Verdun het 5 ng/μL cDNA-mengsel tot een concentratie van 1,25 ng/μL met behulp van water van moleculaire biologiekwaliteit.</li>
		<li>Combineer 5 μL SYBR Green dye master mix (2x), 0,1 μL moleculair biologisch waardig water, 0,45 μL van 7,5 μM voorwaartse primer, 0,45 μL van 7,5 μM omgekeerde primer, en 4 μL van 1,25 ng/μL cDNA om een totaal reactievolume van 10 μL te verkrijgen. Meng goed door op en neer te stampen in een 96 goed PCR-plaat. Gebruik optische kleeffolie om ervoor te zorgen dat de plaathoes wordt verzegeld en om verontreiniging en verdamping te voorkomen.</li>
		<li>Draai de reactiemix kort naar beneden door centrifugeren en plaats de plaat in een qPCR thermocycler.</li>
	</ol></li>
	<li>Versterk de V5-gelabelde GoI- en tTA-Ad-amplicons met behulp van de volgende qPCR-omstandigheden: 95 °C voor 10 min als denaturatiestap, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 10 s, 58 °C voor 15 s en 72 °C voor 20 s. Na de versterkingscycli moet een smeltcurve met hoge resolutie worden gegenereerd om de specifieke smelttemperaturen van de gewenste ampliconen te beoordelen en de afwezigheid van geluidsversterkingspieken te garanderen.<ol>
<li>Neem negatieve controles voor de qRT-PCR door het uitvoeren van qPCR met RNA als een sjabloon zonder omgekeerde transcriptase om te dienen als een controle voor mogelijke plasmid DNA-besmetting en qPCR zonder cDNA toegevoegd aan de qPCR mix om het gebrek aan primer dimers of Verontreinigingen.</li>
		<li>De optimale cDNA-concentratie, primer-efficiëntie en concentratie moeten volgens de GoI worden geoptimaliseerd door een standaard curvetest. Voer hiervoor een seriële verdunning uit met behulp van cDNA uit onbehandelde cellen (gekweekt zonder doxycycline). De standaardcurve wordt gegenereerd door de Cq-waarden af te plotten tegen het logboek van de cDNA-verdunningsfactor en de versterkingsefficiëntie (E) wordt berekend op basis van de helling van de standaardcurve met behulp van de volgende formule: E = 10-1/helling OPMERKING: De versterkingsefficiëntie moet ongeveer 0,9 tot 1,05 bedragen. Anders moeten de primers opnieuw worden ontworpen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de qPCR-gegevens met behulp van de vergelijkende Cq-methode door de expressiewaarden van de Ini te normaliseren tot de expressie van tTA-Ad om de relatieve expressieniveaus van de Ini te verkrijgen en de expressie ervan te rapporteren als een percentage van de mRNA-expressie van de Ini in cellen van hetzelfde dier bij het beginpunt (t = 0) (figuur 4).</li>
	<li>De half-life wordt bepaald aan de hand van de koersconstante (K) van de GoI mRNA degradatiecurve aan de hand van de volgende vergelijking: t1/2 = ln 2/K.</li>
</ol>

<ol><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li>
<li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li>
<li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+GADD45+and+JNK%2FSAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li>
<li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+isoforms+of+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%2C+NCX1+and+NCX3%2C+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt%2Fprotein+kinase+B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li>
<li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li>
<li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL%3A+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li>
<li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li>
<li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).</li>
<li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+functions+of+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li>
<li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lengthening+of+3%27UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li>
<li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li>
<li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells%3A+involvement+of+purinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li>
<li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+%27megaprimer%27+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGossen%2C+M+%22Tetracyclines+in+Biology%2C+Chemistry+and+Medicine%22">Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine</a>. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).</li>
<li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells%3A+Involvement+of+its+3%27+Untranslated+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li>
<li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modulation+de+la+stabilit%C3%A9+de+l%27ARNm+alphaENaC+dans+les+cellules+%C3%A9pith%C3%A9liales+alv%C3%A9olaires%3A+d%C3%A9termination+du+r%C3%B4le+des+s%C3%A9quences+3%27+non+traduites%22">Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites</a>. , Université de Montréal. (2015).</li>
<li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li>
<li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li>
<li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation-London%22%5BJournal%5D)">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).</li>
<li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+doxycycline%2C+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

De lage transfection rate van alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur is een ernstige beperking voor het gebruik van het Tet-Off systeem om de mRNA stabiliteit in deze cellen te beoordelen. Deze beperking werd echter overwonnen door pipetelektroporatie, waardoor een transfection-efficiëntie van 25-30% mogelijk was (figuur 1 en figuur 3)26.
De meting van transcript stabiliteit is fundamenteel voor het beg...

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om de halflevensduur van mRNAs te bepalen. De pulse-chase verval techniek, die gebruik maakt van gelabelde mRNAs, zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van een grote pool van mRNAs met minimale cellulaire verstoring. Deze benadering staat echter geen directe schatting toe van de halfringstijd van één enkel gentranscript en kan niet worden uitgevoerd om de posttranscriptional modulatie van een mRNA te bestuderen na stimulatie met groeifactoren, ROS, alarminen ofontsteking1.
Het gebruik van transcriptieremmers, zoals actinomycine D en α-amanitine, is een relatief eenvoudige methode voor het meten van mRNA afbraakkinetiek in de tijd. Een belangrijk voordeel van deze aanpak ten opzichte van die van eerdere technieken(d.w.z. pulse-chase) is afhankelijk van de mogelijkheid om de halfduur van een bepaald transcript direct in te schatten en te vergelijken hoe verschillende behandelingen de afbraakkinetiek kunnen beïnvloeden. De aanzienlijke schadelijke impact van transcriptieremmers op de celfysiologie vormt echter een groot nadeel van de aanpak2. Inderdaad, de remming van de hele cel transcriptome met deze geneesmiddelen heeft de negatieve bijwerking van verstoren de synthese van belangrijke elementen die betrokken zijn bij mRNA stabiliteit, zoals microRNAs (miRNAs), evenals de expressie en synthese van RNA-bindende eiwitten, die belangrijk zijn voor mRNA afbraak en stabiliteit. De ernstige verstoring van gentranscriptie door deze geneesmiddelen zou daarom de degradatiekrommen van transcripties artefactually kunnen wijzigen.
Het promotorinductiesysteem vertegenwoordigt een derde benadering om de halfduur van een specifiek mRNA te meten. Deze methode meet de afbraak van een specifiek mRNA op een vergelijkbare manier als methoden die transcriptieremmers gebruiken. Er worden vaak twee soorten inductiesystemen gebruikt: de door serum geïnduceerde c-fos promotor3 en het Tet-Off onducible systeem4. Met het c-fos-systeem is het gebruik van transcriptieremmers die giftig kunnen zijn voor de cel niet nodig. Deze methode vereist echter synchronisatie van de celcyclus, waardoor de evaluatie van de werkelijke stabiliteit van een transcript tijdens interfase5wordt voorkomen. Het Tet-Off-systeem maakt daarentegen de sterke expressie van het gen of interest (GoI) mogelijk onder controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Dit systeem vereist de aanwezigheid van twee elementen die moeten worden gecotransfected in de cel functioneel te zijn. De eerste plasmid (pTet-Off) drukt het regelgevende eiwit tTA-Adv uit, een hybride synthetische transcriptiefactor bestaande uit de prokaryotische repressor TetR (van Escherichia coli) versmolten tot drie transcriptietransactivatiedomeinen van het virale eiwit HSV VP16. De Ingoi wordt gekloond in de pTRE-Tight plasmid onder controle van een synthetische promotor (PTight),bestaande uit de minimale volgorde van het cytomegalovirus (CMV) promotor gesmolten tot zeven herhalingen van de tetO operator sequentie. De transcriptie van het gen stroomafwaarts van PTight is afhankelijk van de interactie van TetR met tetO. In aanwezigheid van tetracycline of zijn afgeleide, doxycycline, verliest de TetR-onderdrukker zijn affiniteit met de tetO-operator, wat leidt tot een stopzetting van de transcriptie4. De kenmerken van het Tet-Off-systeem maken het een ideaal model voor de studie van specifieke mRNA-expressie in eukaryotische cellen, terwijl potentiële pleiotropische effecten worden vermeden die ondergeschikt zijn aan de afwezigheid van prokaryotische regulerende sequenties in eukaryotische cel6. Meestal worden dubbel stabiele Tet-Off-cellijnen (HEK 293, HeLa en PC12) met dit systeem gebruikt om kopieën van de regulator en responsplasmids te integreren voor gemakkelijke toegang tot controleerbare genexpressie7,8,9.
Verschillende modellen van alveolar epitheelcellen in de cultuur zijn gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. Jarenlang hebben onderzoekers op grote schaal gebruik gemaakt van menselijke of knaagdier primaire cellen10,11 evenals vereeuwigde cellijnen zoals de menselijke A549 of rat RLE-6TN cellen12,13. Hoewel ze over het algemeen minder proliferative en moeilijker te kweken en transfect, alveolar epitheel cellen in de primaire cultuur blijven de gouden standaard voor de studie van de functie en disfunctie van de alveolar epitheel in fysiologische en pathologische omstandigheden. Inderdaad, vereeuwigde cellijnen zoals A549 cellen vertonen niet de complexe kenmerken en fenotypen van primaire cellen, terwijl alveolar epitheliale cellen in de primaire cultuur de belangrijkste eigenschappen van het alveolaire epitheel samenvatten, met name het vermogen om een gepolariseerde en strakke barrière te vormen14,15. Helaas zijn deze cellen zeer resistent tegen conventionele transfection technieken, zoals die gebruik te maken van liposomen, waardoor het gebruik van een promotor-geïnduceerde systeem zoals Tet-Off zeer moeilijk.
De posttranscriptional modulatie van mRNAs is een van de meest effectieve methoden voor het snel moduleren van de genexpressie van een transcript16. De onvertaalde regio mRNA 3 (3' UTR) speelt een belangrijke rol in dit mechanisme. Het is aangetoond dat, in tegenstelling tot de 5' UTR, er een exponentiële correlatie is tussen de lengte van de 3' UTR en de cellulaire en morfologische complexiteitvan een organisme. Deze correlatie suggereert dat de 3' UTR, net als de mRNA-coderingsgebieden, is onderworpen aan natuurlijke selectie om in evolutie17steeds complexere posttranscriptiemogelijk te maken. De 3' UTR bevat verschillende bindende sites voor eiwitten en miRNAs die de stabiliteit en vertaling van het transcript beïnvloeden.
In het huidige werk ontwikkelden we een tool om de rol van sterk bewaarde domeinen in de 3' UTR van een InI voor de controle van de stabiliteit van het transcript te onderzoeken. We richtten ons op het epitheliale natriumkanaal, alfa subunit (αENaC), die een belangrijke rol speelt in alveolar epitheelfysiologie18. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur werden met succes tijdelijk transfected met de twee componenten van het Tet-Off-systeem, dat het mogelijk maakt voor de studie van de rol van de 3' UTR in mRNA stabiliteit met een systeem dat minimaal van invloed op de celfysiologie en metabolisme in vergelijking met het gebruik van transcriptieremmers met andere protocollen. Een kloonstrategie werd ontwikkeld om de expressie van de Ini te onderscheiden van die van het endogene gen met behulp van een nonendogene uitgedrukte epitope (V5). De respons en regelgevende plasmiden werden vervolgens overgebracht naar alveolar epitheel cellen met behulp van een pipet elektroporatie techniek. Vervolgens werd de expressie van het transcript gemeten door de cellen met doxycycline op verschillende tijdstippen uit te broeden. De halfwaardetijd van het transcript werd geëvalueerd door RT-qPCR met een aangepaste Cq-methode met behulp van het transfected tTA-Ad mRNA product voor normalisatie. Door middel van ons protocol bieden we een handige manier om de posttranscriptional modulatie van een transcript onder verschillende voorwaarden te bestuderen en de betrokkenheid van de onvertaalde regio's in meer detail te definiëren.

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-LineHemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform - Molecular biology grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, Amplification Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol - Molecular biology grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - Molecular biology grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, powder</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-exU electrophoresis system</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 10 &micro;L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 vector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP plasmid</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Advanced vector</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight vector</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Purified alveolar epithelial cells</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td><td>Applied Biosystems</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet System Approved FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Water, Molecular biology Grade</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënt transcriptionally gecontroleerd plasmid expression system voor onderzoek van de stabiliteit van mrna transcripts in primaire alveolar epitheelcellen

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Het bestuderen van posttranscriptional regulatie is fundamenteel voor het begrijpen van de modulatie van een bepaalde boodschapper RNA (mRNA) en de impact ervan op cel homeostase en metabolisme. Inderdaad, schommelingen in transcript expressie zou kunnen wijzigen van de vertaling efficiëntie en uiteindelijk de cellulaire activiteit van een transcript. Verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om de half-life van mRNA te onderzoeken, hoewel sommige van deze methoden beperkingen hebben die de juiste studie van posttranscriptional modulatie voorkomen. Een promotor inductiesysteem kan een gen van belang uitdrukken onder de controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Deze methode maakt de half-life schatting van een bepaalde mRNA onder een experimentele aandoening zonder storende cel homeostase. Een groot nadeel van deze methode is de noodzaak om cellen transfect, die het gebruik van deze techniek in geïsoleerde primaire cellen die zeer resistent zijn tegen conventionele transfection technieken beperkt. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur zijn uitgebreid gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. De unieke kenmerken en fenotype van primaire alveolarcellen maken het essentieel om de posttranscriptionalmodulaties van genen van belang in deze cellen te bestuderen. Daarom was ons doel om een nieuw instrument te ontwikkelen om de posttranscriptional modulaties van mRNAs van belang in alveolar epitheelcellen in primaire cultuur te onderzoeken. We ontwierpen een snel en efficiënt transieel transfection protocol om een transcriptiegestuurd plasmidexpressiesysteem in primaire alveolar epitheelcellen te plaatsen. Deze kloonstrategie, met behulp van een virale epitope om de constructie te taggen, zorgt voor de gemakkelijke discriminatie van constructexpressie uit die van endogene mRNAs. Met behulp van een gewijzigde ΔΔ kwantificeringscyclus (Cq) methode, kan de expressie van het transcript vervolgens worden gekwantificeerd op verschillende tijdstippen om de halfwaardetijd te meten. Onze gegevens tonen de efficiëntie van deze nieuwe aanpak bij het bestuderen van posttranscriptional regulatie in verschillende pathofysiologische omstandigheden in primaire alveolar epitheelcellen.

Dit protocol werd met succes gebruikt om een Tet-Off transcriptiesysteem te genereren dat plasmaleexpressiesysteem bevat om het belang van verschillende delen van de αENaC 3' UTR in de modulatie van transcriptiestabiliteit in primaire alveolar epitheelcellen te evalueren.
De eerste stap in de implementatie van dit systeem was het vaststellen van een snelle, eenvoudige en efficiënte transfection techniek voor alveolar epitheelcel...

Hier presenteren we een tool die kan worden gebruikt om de posttranscriptional modulatie van een transcript in primaire alveolar epitheelcellen te bestuderen met behulp van een induceerbaar expressiesysteem gekoppeld aan een pipet elektroporatietechniek.

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Dus ons model maakt studie van de post-transcriptional modulatie van een specifieke transcriptie in alveolaire epitheliale cellen in de primaire cultuur en hun fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dus de voorbijgaande transfectie van primaire alveolaire epitheelcellen heeft een minimaal effect op de celfysiologie en metabolisme, wat een duidelijk voordeel vormt ten opzichte van klassieke protocollen met transcriptieremmers. Voor het genereren van een responsplasmid die een gen van belang uitdrukt, moeten de sequentie van het gen en de meervoudige kloonplaatsen van de inducible vector worden geanalyseerd om de herkenningssequenties in de meervoudige kloonplaatsen te identificeren die intern niet in het gen aanwezig zijn.Met behulp van high fidelity taq polymerase en standaard overlap PCR technieken, flankeren het gen van belang met twee geselecteerde beperking enzym herkenning sites met behulp van designer primers. Een sequentie bij het coderen van de V5 epitoop van het gen van belang moet worden opgenomen om de expressie van het transfected gen te onderscheiden van endogene expressie. Mutanten kunnen worden gegenereerd door sequentiële verwijdering om de effecten van verschillende drie eerste onvertaalde gebieden op de stabiliteit van het mRNA van het gen te bestuderen met behulp van omgekeerde primers die een polyadenylation-site coderen die geleidelijk het drieste uiteinde van het onvertaalde gebied verwijdert.Uiteindelijk kan de invoeging van het gen van belang worden bevestigd door beperkingsanalyse. De genoriëntatie en de afwezigheid van mutaties die mogelijk tijdens de RTPCR worden geïntroduceerd, kunnen worden bevestigd door sequencing. Voor de transfectie van primaire rattenlong type twee alveolaire epitheelcellen, zaad de cellen op een een keer 10 tot de zesde cellen per vierkante centimeter in 100 millimeter Petri gerechten in aanwezigheid van volledige minimale essentiële medium.Cultuur voor 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide met vochtigheid. De volgende dag, voeg 500 microliter van volledig medium zonder antibioticum aan elke put van een nieuwe 12 put plaat en pre-warm de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg tijdens deze incubatie één microgram van de responsplasmik en één microgram regulerende vector toe aan één buis van 1,5 milliliter per put.Was de epitheelcellen van de alveolaire met 10 milliliter per put van 37 graden Celsius PBS zonder calcium of magnesium en behandel de cellen met vijf milliliter per put van 37 graden Celsius 0,05%trypsine gedurende twee tot vier minuten in de celkweek incubator. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de trypsine met 10 milliliter per put van compleet medium zonder antibioticum en het verzamelen van de cellen in een nieuwe 50 milliliter buis. Was de schotel met vier milliliter vers medium om de resterende cellen te verzamelen en sediment de cellen door centrifugatie.Resuspend de pellet in een milliliter PBS voor het tellen en centrifugeren van de cellen weer. Resuspend de pellet bij een dichtheid van vier keer 10 tot de zevende cellen per milliliter resuspensie buffer en voeg vier keer 10 aan de vijfde cellen aan elke buis van plasmid en vector met zachte menging. Plaats één buis in het elektroporatieapparaat en vul de buis met 3,5 milliliter elektrolytische buffer.Druk de zuiger volledig onder om een vergulde elektrodepunt in een pipet te plaatsen en meng voorzichtig de buisinhoud. Voorzichtig aanzuigen van de cellen met een pipet en steek de pipet in de elektroporatie station totdat een klikkend geluid is gehoord. Selecteer het juiste elektroporatieprotocol voor epitheelcellen van alveolaire cellen en druk op Start op het touchscreen.Onmiddellijk na de transfectie, verwijder de pipet en breng de cellen in een put van de voorverwarmde 12 put plaat. Wanneer alle cellen zijn geëlektrooeerd en verguld, plaats de plaat in de celcultuur incubator, ter vervanging van de supernatant in elke put met compleet medium met antibiotica na twee dagen. Het succes van de transfectie kan worden bevestigd door de expressie van EGFP zoals waargenomen door fluorescentiemicroscopie of stroomcytometrie met behulp van een controlevector.Om de transcriptie van het gen van belang te remmen, 72 uur na de transfectie vervang de supernatant met een milliliter per goed van compleet medium aangevuld met een microgram per milliliter vers bereide adoxycycline. Om de halvetijd van het mRNA-halfleven van het belang gen te beoordelen, keert u de plaat terug naar de celkweek incubator van 15 minuten tot zes uur. Was een put met een milliliter ijskoude PBS voordat lysing de cellen met 500 microliters van lyse buffer van een commercieel verkrijgbaar fenol chloroform RNA extractie kit en zacht schudden op elk experimenteel tijdstip.Isoleer vervolgens het RNA volgens kitinstructies en bepaal de RNA-opbrengst en -zuiverheid met spectrofotometrie op 230, 260 en 280 nanometer. Om de stabiliteit van het geïsoleerde RNA te bepalen, behandel u eerst één microgram van het totale RNA van elk monster met RNase-vrije DNase om eventuele plasmide DNA-sporen te verwijderen. Gebruik een commercieel verkrijgbaar cDNA synthese kit met een mix van oligo dT en willekeurige hexomer primers om de omgekeerde transcriptie-efficiëntie te verbeteren om het DNA uitgeput totaal RNA om te keren in cDNA volgens de instructies van de fabrikant.Voeg 180 microliter moleculaire biologie kwaliteit water toe aan de 20 microliters van het reactiemengsel om de cDNA-reactie te verdunnen met een concentratie van vijf nanogram per microliter en verdun onmiddellijk de cDNA-mix met vers moleculair biologiewater om een 1,25 nanogram per microliterconcentratie te bereiken. Combineer vijf microliter van cyber groene kleurstof master mix met 0,1 microliter van moleculaire biologie grade water, 0,45 microliters van 7,5 micromolar forward primer, 0,45 microliter van 7,5 micromolar reverse primer, en vier microliter van 1,25 nanogram per microliter van cDNA om een totaal reactievolume van 10 microliter te verkrijgen. Plaats de monsters in een qPCR thermocycler en versterk het V5-taggen van belang en de tetrocycline transactivator voorschotampyl met behulp van de qPCR-omstandigheden zoals aangegeven en genereer een smeltcurve met hoge resolutie om de specifieke smelttemperaturen van de gewenste amplicons te beoordelen en om de afwezigheid van ruisamplylpieken te garanderen.Deze pipet elektroporatie techniek vergemakkelijkt een 25 tot 30% transfectie efficiëntie tarief zoals waargenomen door de verhoudingen van EGFP cellen gedetecteerd door fluorescentie microscopie en flow cytometrie. De behandeling van alveolaire epitheelcellen met één microgram per milliliter doxycycline heeft op geen enkel moment tijdens de behandelingsperiode significante invloed op de expressie van endogene alfa ENaC mRNA. Met behulp van een transcriptie gecontroleerd plasmide expressiesysteem zoals aangetoond, V5 alpha ENaC signaal kan worden genormaliseerd volgens de tetracycline transactivator geavanceerde signaal om de efficiëntie van transfectie te bepalen met behulp van de dubbele delta kwantificering cyclus methode.De halfwaardetijd van alfa ENaC mRNA is tot zeven keer korter in aanwezigheid van het tetracycline off systeem dan in aanwezigheid van actinomycine D, wat bevestigt dat actinomycine D leidt tot een artefactuele alpha ENaC mRNA stabilisatie. Verder, cyclohexamide en tumor necrose factor alpha behandeling aanzienlijk verminderd de stabiliteit van het transcript, terwijl lipopolysaccharides niet. Belangrijke veranderingen in de modulatie van V5 alpha ENaC mRNA stabiliteit kunnen worden veroorzaakt, afhankelijk van de verwijderde en opgenomen regio's van de drie eerste onvertaalde regio.Bovendien vermindert de overexpressie van specifieke RNA-bindende eiwitten de stabiliteit van 5-alfa ENaC mRNA in vergelijking met transfectie met een lege pcDNA drie plasmide. Deze tool zal nuttig zijn voor het opvragen van nieuwe inzichten in de post-transcriptie regulatie van belangrijke genen die betrokken zijn bij de functie van alveololaire epitheel en hun fysiologische of pathologische omstandigheden.

efficient-transcriptionally-controlled-plasmid-expression-system-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

RNA polymerase II transcriptionele kinetiek worden gemeten op specifieke genen in levende cellen. mRNA getranscribeerd van het gen van belang zijn fluorescent gelabeld en het gebruik van Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) de in vivo kinetiek van transcriptionele rek worden verkregen.

Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen

This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Transgene muizen of virale vectoren zijn gebruikt om eiwitexpressie te verhogen in de longen. Echter, deze technieken zijn tijdrovend, technisch uitdagend en hebben off-target effecten die resultaten kan verwarren. Onze eiwit transfectie protocol gebruikt een lipide gebaseerde transfectiereagens en een ultrafijne microsprayer om actief eiwit uniform te leveren aan longcellen.

Protein Transfectie van Mouse Lung

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Primaire humane bronchiale epitheelcellen zijn moeilijk te transduceren. Dit protocol beschrijft de productie van lentivirussen en hun concentratie, evenals de optimale kweekcondities die nodig zijn om zeer efficiënte transductionen in deze cellen te bereiken tijdens differentiatie naar een pseudostratified epitheel.

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Dit protocol biedt een op flow cytometrie gebaseerde methode om levensvatbare alveolaire type II epitheelcellen (AECII) te isoleren uit neonatale, juveniele of volwassen muislongen (geïnfecteerd of niet-geïnfecteerd). Deze aanpak maakt downstream moleculaire en/of functionele studies van AECII mogelijk om hun rol tijdens longontsteking en infectie te identificeren.

Isolatie van alveolaire Type II epitheelcellen uit neonatale, juveniele en volwassen muislongen die zich kunnen aanpassen aan infectieuze experimentele omgevingen

Leer een inducibleel expressiesysteem met pipet-electroporatie voor onderzoek naar mRNA-stabiliteit in primaire alveolaire epitheelcellen. Deze methode minimaliseert verstoring van de fysiologie.

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen (Video) | JoVE Journal

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Meer video's verkennen