Name: Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Ontdek een nieuw 3D tumor-sferoïde model met stromale fibroblasten voor het bestuderen van tumor-stroma interacties en het testen van kankertherapeutica. Deze methode bootst in vivo tumoromstandigheden nauwkeurig na.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Omaida C. Velazquez (Universiteit van Miami) voor behulpzame samenwerking, overleg en discussie; Dr Jie Li (Universiteit van Miami) voor het verstrekken van MeWo cellen; en Dr Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) voor het verstrekken van alle andere melanoom cellen. We danken ook Dr. Marcia Boulina, directeur van Analytical Imaging Core Facility, Universiteit van Miami, voor beeldvormingsanalyse. Zhao-Jun Liu werd ondersteund door subsidies van Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women's Cancer Association (de53e jaarlijkse subsidie) en interne fondsen van de Universiteit van Miami.

1. Kweekmelanoomcellen en huidfibroblasten
<ol><li>Kweken van menselijke melanoomcellen<ol>
<li>Kweek menselijke melanoomcellen, C816131 onder conventionele aanhangende celkweekomstandigheden in volledig W489-medium (zie stap 1.2) in een 37 °C-incubator die wordt geleverd met 5% CO2, zoals eerderbeschreven 32. Splits de cellen op een 1:5 verhouding wanneer ze ~ 90% samenvloeiing bereiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Melanoom celkweekmedium (W489)<ol>
<li>Gebruik voor volledig W489 medium 80% MCDB153 medium, 20% L-15 medium (zie Materiaaltabel),2% foetaal runderserum (FBS), 5 μg/mL insuline, 1,68 mM CaCl2en 0,11% natriumbicarbonaat. Voor cocultuur, voeg geen FBS, insuline en CaCl2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De huid fibroblastisolatie van de muis<ol>
<li>Snijd een huidfragment van 1 cm x 1 cm van een muis volgens de relevante richtlijnen en voorschriften van het Comité dierenverzorging en -gebruik van de instelling (IACUC).</li>
		<li>Verteer de huid door dispase (zie Tabel met materialen)bij 4 °C 's nachts. Strip de dermis uit de opperhuid en verteer verder met collageen (1 mg/mL in DMEM, zie Tabel met materialen) bij kamertemperatuur (RT) 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De huid fibroblast die van de muis wordt kweekt<ol>
<li>Was de weefselpellets met PBS en kweek ze in DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine in 37 °C/5% CO2. Splits de cellen op een 1:2 verhouding wanneer ze ~ 90% samenvloeiing bereiken.</li>
		<li>Transduceer de huid fibroblasten met GFP/lentivirus met behulp van standaardmethoden voor cocultuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Karakterisering van de fibroblasten van de muishuid door immunostaining<ol>
<li>Celvoorbereiding voor kleuring<ol>
<li>Zaai de huid fibroblasten in 24 put plaat met een dichtheid van 2 x 104 cellen / goed. Op dag 2, was de cellen met PBS 2x en bevestig ze in 2% neutrale gebufferde formaline voor 10 min. Verwijder de formaline en was de vaste cellen met PBS tweemaal.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunostaining<ol>
<li>Voeg 200 μL blokkeringsoplossing toe aan elke put en cubede de plaat gedurende 30 min bij RT, voeg vervolgens de anti-α-SMA van de muis toe verdund om 1:200 en uitbroed bij 37 °C gedurende 1 h. Was met PBS 3x, 5 min elk.</li>
			<li>Voeg Alex Fluor 488 geit anti-muis IgG toe bij 1:400 verdunning en incubeer bij RT gedurende 1 uur. Was de antilichamen 3x met PBS, 5 min per stuk.</li>
			<li>Voeg 1 μg/mL DAPI toe en incubeer bij RT voor 2 min. Verwijder DAPI-oplossing en voeg 500 μL PBS toe aan elke put.</li>
			<li>Observeer de cellen en maak beelden met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prelabeling fibroblasten en melanoomcellen<ol>
<li>Zaad fibroblasten in een 100 mm schotel op dag 1, zodat de cel samenvloeiing bereikt ~ 60% de volgende dag. Verwijder op dag 2 het kweekmedium en voeg GFP/lentivirus (~1:3–1:5 verdund uit voorraad) toe aan een regulier kweekmedium met 4 μg/mL polybreen. Incubeer cellen in een 37 °C incubator gedurende 6 uur, verwijder het medium en vervang door vers regelmatig kweekmedium. Na 2 dagen, observeer het GFP-signaal van de cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Transduceer C8161 cellen met DsRed/lentivirus onder vergelijkbare omstandigheden. Protocollen voor de bereiding van GFP/lentivirus en DsRed/lentivirus zijn eerder beschreven14,34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Celcocultuur
<ol><li>Zaai de C8161-fibroblast cocultuur.<ol>
<li>Los op dag 0 van de sferoïde formatietest zowel de C8161 als de huidfibroblasten los met 0,25% trypsin-EDTA. Draai de cellen op 250 g voor 5 min bij RT en was één keer met PBS.</li>
		<li>Resuspend de cellen in cel cocultuur medium (serum vrij, insuline vrij, en calcium vrij W489 medium gemengd met serum vrije DMEM bij een 1:1 verhouding). Pas de celconcentratie aan op 2 x 104 cellen/mL.</li>
		<li>Meng de C8161 cellen met de fibroblasten op een verhouding van 1:1 en voeg 2 mL van de celmengsels toe aan elke put van een 24-putplaat. Elke put moet 2 x 104 van elk type cellen bevatten. Elke voorwaarde moet worden gedaan in drievoud. OPMERKING: Het is belangrijk om een niet-weefselkweek behandelde plaat te gebruiken (zie Tabel met materialen). Anders hechten de cellen zich sterk aan een plaat en kunnen ze spheroïden niet opschorten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer cellen bij 37 °C gedurende 4 uur totdat de cellen zich aan de plaat hechten en voer vervolgens time-lapse imaging of confocale scanning uit op de aangegeven tijdpunten voor elke test.</li>
</ol>3. Live Cell Time-lapse Imaging
<ol><li>Schakel vóór de cocultuur het time-lapse imaging-systeem in (zie Materiaaltabel)volgens de instructies van de fabrikant en laat de incubator 37 °C en 5% CO2bereiken . Het duurt meestal 1 uur voor het systeem om evenwicht te bereiken. Plaats de kweekplaat voorzichtig op het podium van de microscoop in de couveuse en doe de deur veilig op slot.</li>
	<li>Open de software van time-lapse imaging systeem (zie Tabel met materialen)en kies de plaat type en fabrikant, zodat de microscoop kan het scangebied nauwkeurig lokaliseren. Kies de putten van belang en een 10x objectieve lens. Kies de instellingen voor het scangebied, de intervaltijd tussen de scans en een begin- en eindtijd. In dit protocol is het maximale opmaaknummer voor het scangebied voor 1 put 36 en de intervaltijd 1 uur.</li>
	<li>Record time-lapse imaging van 4-52 uur. OPMERKING: De begintijd, eindtijd en duur moeten worden geoptimaliseerd op celtype en het doel van het experiment.</li>
	<li>Gebruik bij het voltooien van de beeldopname de time-lapse imaging systeemsoftware om de gegevens op te halen en video's of beeldsets te exporteren.</li>
</ol>4. Confocale microscopie en 3D-films
<ol><li>Plaats de celcocultuurplaat op het podium van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel)en gebruik rode en groene laserstralen. Observeer de cellen onder een 5x of 10x objectieve lens en kies een sferoïde om te beginnen met scannen.</li>
	<li>Gebruik een z-stap van 1 μm om van onder naar boven van de sferoïde te scannen. Verwerk de gegevens met behulp van beeldverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen)om een 3D-beeld te reconstrueren dat verder kan worden gedraaid en opgeslagen als een 3D-film.</li>
</ol>5. Solocultuur van Melanoomcellen en vorming van 2D-clusters/aggregaten
<ol><li>Zaad 2 x 104 C8161 melanoomcellen in elke put van een 24-putten plaat zoals beschreven in punt 2.1. Kweek de cellen 7-10 dagen en fotografeer ze met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>6. Controleren of 3D-sferoïden en 2D-celclusters/aggregaten in het medium zijn opgehangen of aan de platen zijn bevestigd
<ol><li>Voor celcocultuur, controleer de 3D sferoïden gevormd op dag 7. Controleer voor eencellige cultuur de 2D-clusters/aggregaten die op dag 10 zijn gevormd.</li>
	<li>Stel celkweekplaten op het platform van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Doe een gebogen naald met een spuit in een put en trek het kweekmedium zachtjes aan om het kweekmedium in de putten te verstoren. Neem dit proces op met behulp van de filmmodus van de filmsoftware (zie Tabel met materialen). De 3D sferoïden zullen mobiel zijn, maar de 2D-celclusters/aggregaten blijven standvastig.</li>
</ol>7. Confocale afbeelding van 3D Sferoïden
OPMERKING: Cokweekcellen beginnen sferoïden te vormen van 48-72 uur, afhankelijk van het type fibroblasten dat wordt gebruikt. Over het algemeen, sferoïden geleidelijk vergroten met de tijd. Kleine sferoïden kunnen smelten tot grotere sferoïden tot dag 7. Nadat sferoïden zijn gestabiliseerd in grootte, kunnen ze langer dan 10 dagen duren. Daarna komen de sferoïden vaak los van de onderkant van de kweekplaat en komen ze samen in het midden van de putten. Tijdens de uitbreiding van de sferoïden sterven de cellen in het midden meestal als gevolg van onvoldoende voeding en/of een giftige micro-omgeving. Vandaar dat de piek van 3D sferoïde vorming en timing om de volwassen sferoïden beeld moet worden geoptimaliseerd met behulp van proefexperimenten. Voor dit protocol werd confocale microscopie uitgevoerd rond dag 7 toen de sferoïden volwassen waren en de cellen in het midden van sferoïden nog in leven waren volgens de fluorescentie en morfologie van de cellen in het centrum.
<ol><li>Om confocale microscopie te doen, gebruik een groene en rode laser om de sferoïden te scannen. Bepaal het scangebied onder een doelstelling van 10x en ga van de onderkant naar boven van de sferoïde met een z-stap van 1 μm.</li>
	<li>Genereer de 3D-sferoïde formatie- en rotatievideo's met behulp van de 3D-projectiefunctie van de beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld ImageJ).</li>
</ol>8. Intracellulaire Notch1 Signalering Pathway Activiteit bij het bepalen van stromal verordening van kanker stem / initiëren van cellen
<ol><li>Isolatie en karakterisering van de huid fibroblasten van gain- en loss-of-function Notch1 muizen<ol>
<li>Oleisoleer huidfibroblasten van twee paar genetisch gemodificeerde muizen: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) muizen versus hun tegenhanger controle (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) muizen en Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) muizen versus hun tegenhanger controle (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) muizen31, respectievelijk. Oleisteen en karakteriseren van de huid fibroblasten met behulp van het protocol beschreven in de secties 1.3-1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transduceer de fibroblasten van de muishuid met GFP/lentivirus.<ol>
<li>Zie sectie 1 voor de methode om de cellen te transduceren met de lentivirale vector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cocultuur van fibroblasten en melanoomcellen<ol>
<li>Voer het celcocultuurexperiment uit zoals beschreven in sectie 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beoordeling van het effect van intracellulaire Notch1-padactiviteit in de fibroblasten op het bepalen van de stromale regulatie van kankerstamcellen/initiërende cellen door de grootte van de 3D-sferoïden te meten<ol>
<li>Voer de kwantificering van sferoïdevorming onder elke voorwaarde uit door de sferoïden te fotograferen op het moment dat sferoïden volwassen zijn (aangegeven door het stoppen van de groei rond dag 5-7, afhankelijk van de soorten fibroblasten). Meet de afmetingen van de 3D-sferoïden met behulp van de beeldverwerkingssoftware.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Het testen van de drugrespons van kankerstam /initiëren van cellen met behulp van de 3D Sferoïde Assay
OPMERKING: CAF kan kanker heterogenicity reguleren en induceren fenotype van kanker stam / initiëren de cellen. CAF ondersteunt ook kanker stam / initiëren van cellen om klinische behandelingen te doorstaan. Kankercellen zijn aangetoond dat ze verantwoordelijk zijn voor resistentie tegen geneesmiddelen. Daarom gebruikten we dit 3D-sferoïde model om de medicijnrespons van kankerstamcellen/initiërende cellen te evalueren. De uitkomst kan beoordelen potentiële klinische werkzaamheid van anti-kanker medicatie goed.
<ol><li>Drugstoediening<ol>
<li>Direct na het coculturen van de cellen in een 24-putplaat, bereid je de geneesmiddelen in een seriële verdunning in kweekmedium voor tot 5x van een gewenst bereik van concentraties op basis van proefexperimenten (d.w.z. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM en 25 nM). Voeg 0,5 mL van de bijbehorende geneesmiddelen oplossingen aan elke put van de cocultuur cellen. Behandel de controlegroep met regelmatige cocultuurmedia zoals hierboven vermeld.</li>
		<li>OPMERKING: MEK-remmer is oplosbaar in celkweekmedia. Daarom zijn blanco besturingselementen 2,5 mL celkweekmedium. Als het medicijn echter niet oplosbaar is in waterige oplossing en oplosmiddelen zoals DMSO vereist, moeten celkweekmedia met dezelfde concentratie DMSO op de controlegroep worden toegepast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificering van de reactie op geneesmiddelen door het tellen van sferoïden<ol>
<li>Observeer de behandelde cellen en onbehandelde cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop en fotografeer de cellen elke dag. Kwantificeer de sferoïdevorming in de verschillende experimentele groepen en vergelijk het sferoïde-vormend vermogen van de celculturen onder verschillende medicijnconcentraties. OPMERKING: De sferoïden hebben de neiging om te verschijnen ~ 5−7 dagen na de cocultuur. De effecten van geneesmiddelen zullen merkbaar worden op dat moment.</li>
		<li>Gebruik fluorescentiemicroscoop om de sferoïden en cellen in de putten te beeld/fotograferen en gebruik vervolgens de beeldsoftware om de gemiddelde grootte van de sferoïden en de aantallen sferoïden gevormd per laag vermogen veld (LPF x 4) in elke behandelingsgroep in de tijd te berekenen. OPMERKING: Cellen die effectieve medicamenteuze behandeling krijgen, moeten minder of geen sferoïden vormen in vergelijking met de controlegroep. Dit is een indicatie van de effectiviteit van het geteste geneesmiddel bij het onderdrukken van kankercellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).</li>
<li>Anton, K., Glod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tumor+stroma+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeting the tumor stroma in cancer therapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501, 346-354 (2013).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Lynch, C. C., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+tumor-host+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication.</a> Differentiation. 70, 561-573 (2002).</li>
<li>Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+and+the+dynamics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).</li>
<li>Olumi, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+direct+tumor+progression+of+initiated+human+prostatic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium.</a> Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li>
<li>Luga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+mediate+stromal+mobilization+of+autocrine+Wnt-PCP+signaling+in+breast+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration.</a> Cell. 151, 1542-1556 (2012).</li>
<li>Zhang, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+bone+metastasis+seeds+by+mesenchymal+signals+in+the+primary+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma.</a> Cell. 154, 1060-1073 (2013).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Notch1+signaling+in+stromal+fibroblasts+inhibits+melanoma+growth+by+upregulating+WISP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1.</a> Oncogene. 30, 4316(2011).</li>
<li>Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+Antitumor+Immune+Response+by+Cancer-Associated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontier+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Frontier in Immunology. 9, 414(2018).</li>
<li>Kraman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+antitumor+immunity+by+stromal+cells+expressing+fibroblast+activation+protein-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha.</a> Science. 330, 827-830 (2010).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).</li>
<li>Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes%3A+from+morphology+to+application%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Melanocytes: from morphology to application.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).</li>
<li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+melanoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Healthcare+%28basel%29%22%5BJournal%5D)">Modeling melanoma in vitro and in vivo.</a> Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+flow+cytometry-based+analysis+of+cell+position+and+the+cell+cycle+in+3D+melanoma+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17, 1-15 (2015).</li>
<li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multicellular+spheroids+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).</li>
<li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Review%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).</li>
<li>Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+high-throughput+image+analysis+for+therapeutic+efficacy+of+architecturally+complex+heterotypic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids.</a> Scientific Reports. 7, 16645(2017).</li>
<li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroid+based+on+a+triple+coculture%3A+A+novel+3D+model+to+mimic+pancreatic+tumor+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity.</a> Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).</li>
<li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li>
<li>Gu, L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+and+emerging+anticancer+therapeutics%3A+engineering+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment.</a> Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).</li>
<li>Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedded+Spheroids+as+Models+of+the+Cancer+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment.</a> Advanced Biosystems. 1, (2017).</li>
<li>Welch, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+invasive+and+spontaneously+metastatic+human+malignant+melanoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).</li>
<li>Balint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Notch1+signaling+is+required+for+beta-catenin-mediated+human+primary+melanoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+%3A+biological+significance+of+bFGF%5BTitle%5D)+AND+%22the+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Notch1+Signaling+in+Cancer-Associated+Fibroblasts+Dictates+the+Plasticity+and+Stemness+of+Melanoma+Stem%2FInitiating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells.</a> Stem Cells. 37, 865-875 (2019).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+Pathway+Activity+Determines+the+Regulatory+Role+of+Cancer-Associated+Fibroblasts+in+Melanoma+Growth+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion.</a> PLoS One. 10, 0142815(2015).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1-WISP-1+axis+determines+the+regulatory+role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+stromal+fibroblasts+in+melanoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis.</a> Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).</li>
<li>Kalluri, R., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+and+its+implications+for+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).</li>
<li>Price, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+in+immunodeficient+animals+%3A+I.+Nude+mice%3A+spontaneous+and+experimental+metastasis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models.</a> Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).</li>
<li>Spaeth, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS One. 4, 4992(2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In vitro 3D celcultuur technieken zijn op grote schaal gebruikt voor decennia in kankeronderzoek. In vergelijking met conventionele 2D-celkweeksystemen recapituleert de 3D-microomgeving de celcel- en/of celmatrixinteracties en maakt het mogelijk om de echte omstandigheden in tumorweefsels na te bootsen. Echter, een 3D-systeem alleen gevormd door kankercellen en homotypische cel-cel interacties houdt geen rekening met het belang van heterotypische cross talk en kan onnauwkeurige resultaten in het onderzoek. We hebben onlangs een nieuw 3D-systeem ontwikkeld dat kankercellen en CAF combineert om de meest recente tumormicroomgeving en de inheemse en stijve desmoplastische reactie beter na te bootsen.
Fibroblasten zijn belangrijke componenten van tumor stroma. CAF zijn betrokken bij het reguleren van tumorprogressie door oplosbare factoren, ECM/remodellerende enzymen10,11en exosomen uit te lokken. Daarnaast speelt CAF een rol in resistentie tegen geneesmiddelen en tumorrecidief16,17. Ons meercellige 3D-sferoïde systeem kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen van tumor-stromal interacties te verkennen en om resistentie tegen geneesmiddelen en tumorrecidief aan te pakken. CAF zijn voornamelijk afgeleid van geactiveerde lokale rustige fibroblasten en aangeworven circulerend beenmerg MSC, die ondergaan in situ differentiatie in CAF in tumorweefsel37,38,39. In de huidige studie gebruikten we fibroblasten van de huid om een meercellig 3D-sferoïde model te maken. Echter, andere soorten fibroblasten (bijvoorbeeld MSC-DF), werken ook op een zeer vergelijkbare manier als de huid fibroblasten om tumorcel 3D sferoïde vorming te reguleren34. MSC-DF kan worden gegenereerd uit murine beenmerg MSC, die wordt verrijkt door het kweken van beenmerg mononucleaire cellen in MSC cel kweek medium voor ongeveer 10 dagen met periodieke medium veranderingen om de 3 dagen. Deze MSC worden gekarakteriseerd als CD73+/CD105+/Lin-. Om MSC te onderscheiden tot fibroblasten, wordt MSC vervolgens nog 2 weken met volledige DMEM gekweekt. MSC-DF worden gekarakteriseerd als α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ cellen36. MSC-DF kan belangrijke tumorregulatoren zijn. Omdat een fractie van CAF in vele soorten vaste tumoren worden onderscheiden van aangeworven circulerende MSC vrijgegeven uit beenmerg36, MSC-DF kan veelbelovende behandeling doelen. Ze zijn ook veel gemakkelijker therapeutisch gemanipuleerd of gericht voordat ze worden aangeworven om tumorweefsels en gedifferentieerd in CAF. Zo biedt ons 3D-model een ideaal systeem om niet alleen kankercellen te bestuderen en te testen, maar ook verschillende fracties of subpopulaties van CAF. De methode voor 3D sferoïde vorming is eenvoudig. De kritische stappen omvatten het gebruik van serum vrij medium voor cocultuur, het toepassen van de juiste verhouding van fibroblasten op tumorcellen, en het gebruik van de juiste kweekplaten voor cocultuur. De potentiële beperking van onze methode is dat de vorming van 3D sferoïden grotendeels afhankelijk is van kankercel. Onze sferoïde vorming protocol kan vereisen optimalisatie van de verhouding tussen fibroblasten en kankercellen als verschillende kankercel lijnen worden gebruikt. Opgemerkt moet worden dat we een menselijke melanoom cel en muis fibroblast cel cocultuur model voor de vorming van 3D sferoïden gebruikt, omdat het veel gemakkelijker is om GOF of LOF cellen te creëren in de muis fibroblasten voor de studie van de rol van een molecuul of signalering pad in het reguleren van tumor sferoïde vorming. Het vermogen van menselijke melanoomcellen en muisfibroblasten om sferoïden te vormen geeft aan dat moleculen die nodig zijn voor celcelcommunicatie cross-species werken. We hebben onlangs getest cocultuur van menselijke fibroblasten met menselijke melanoom cellen en vond dat menselijke fibroblasten kan ook reguleren menselijke melanoom cellen te vormen 3D sferoïden.
We gebruikten menselijke gemetastaseerde melanoomcellen, C8161, in ons meercellige 3D sferoïde model. We hebben ook andere menselijke melanoomcellen getest, bijvoorbeeld 1205Lu32, die de BRAFV600E-mutatie draagt, en MeWo, die hoge niveaus van CDK4/Kit (ATCC HTB-65) uitdrukt en ontdekte dat ze ook 3D-sferoïden in cocultuur kunnen vormen. Dit geeft aan dat de vorming van 3D-sferoïden door tumorcellen onafhankelijk is van de soorten oncogene mutaties. Hoewel we niet hebben getest of andere soorten niet-melanoom tumorcellen in staat zijn om 3D sferoïden te vormen met fibroblasten, geven onze bevindingen aan dat de vorming van 3D-sferoïden niet beperkt is tot een melanoomcellijn en mogelijk niet afhankelijk is van een specifieke kankercellijn.
We toonden twee voorbeelden van praktische toepassingen van ons 3D sferoïde model. Een voorbeeld was om de intracellulaire Notch signalering pad activiteit bij het reguleren van de kanker stam / initiëren cel fenotype en 3D sferoïde vorming. We hebben aangetoond dat de intracellulaire Notch signalering traject in CAF is een moleculaire schakelaar die het fenotype van kanker stam / initiërende cellen met behulp van deze 3D sferoïde model. Onze bevindingen niet alleen blootleggen een moleculair mechanisme ten grondslag liggen aan stromal regulatie van kanker stam / initiëren van cellen en kanker heterogenicity, maar ook benadrukken dat de Notch traject in CAF is een kritisch doelwit voor melanoom therapeutica. Dit voorbeeld geeft aan dat onze 3D sferoïde model is zeer nuttig om de mechanismen voor kanker cel-stromal fibroblast interacties te bestuderen en potentiële therapeutische doelen te identificeren. Een ander voorbeeld was het testen van de medicijnrespons van kankerstam/initiërende cellen in aanwezigheid van CAF. Het is algemeen bekend dat de medicijnrespons van kankercellen, waaronder kankercellen/initiërende cellen, varieert in de aanwezigheid en afwezigheid van CAF. De aanwezigheid van CAF in dit in vitro systeem maakt dit model klinisch relevanter en gegenereerde testresultaten betrouwbaarder. Bovendien is ons 3D sferoïde systeem veelzijdig. Het kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden. Bijvoorbeeld, als resistente kankercellen worden gebruikt in dit 3D-model, kan het worden gewijzigd om resistentie tegen geneesmiddelen en misschien tumor recidief aan te pakken. Het kan ook worden gewijzigd om te testen of te screenen geneesmiddelen die voornamelijk richten CAF voor kanker behandeling. CAF zijn onlangs veelbelovende therapeutische doelen geworden. Er zijn voordelen aan het richten van CAF. Ten eerste, in vergelijking met tumorcellen die abnormaal zijn (vaak met genetische veranderingen) en slim (gemakkelijk resistentie tegen chemo- en radiotherapies), CAF in tumorweefsel zijn normale cellen en genetisch stabieler, zodat ze minder kans om weerstand tegen de behandelingen te ontwikkelen. Ten tweede, gericht OP CAF is niet afhankelijk van het type oncogene mutaties in de tumorcellen. Ten derde, gericht caf kan bereiken meerdere hit effecten door fibroblasten afhankelijke anti-tumor, anti-angiogenese, en / of de modulerende kanker immuunrespons. Onze 3D sferoïde model is een krachtig hulpmiddel voor de ontdekking van diverse sets van kanker therapeutische strategieën.

Vaste tumoren vertegenwoordigen complexe weefsels bestaande uit neoplastische cellen en een grote verscheidenheid aan stromalcellen1,2,3,4. Stromal fibroblasten, of kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF), zijn een van de prominente stromal cel populaties in de meeste soorten vaste tumoren. Ze zijn kritisch betrokken bij het reguleren van tumorgroei, stamkracht, metastase, angiogenese en resistentie tegen geneesmiddelen door de productie van groeifactoren, cytokinen/chemokinen, synthese van ECM en remodellerende enzymen (bijvoorbeeld collageen, fibronectine en matrixmetalloproteases), afgifte van exosomen en directe heterotypische celcelinteractie5,6,7,8,9,10,11 . CAF neemt ook deel aan het bepalen van kanker orgaan-specifieke metastase door het voorselecteren van een subset van tumor klonen van heterogene tumorcel populaties in de primaire laesie en het bevorderen van deze geselecteerde klonen te worden voorbereid voor metastase naar een specifieke verre orgaan waarvan de micro-omgeving is optimaal voor herkolonisatie van geselecteerde klonen12. Bovendien nemen fibroblasten en hun uitgescheiden oplosbare factoren en ECM deel aan de modulatie van tumorangiogenese13,14, anti-tumor immuunrespons15, en zijn zelfs betrokken bij resistentie tegen geneesmiddelen en tumorrecidief16,17.
In vitro 3D tumor sferoïde modellen zijn ontwikkeld en gebruikt in kankeronderzoek als een tussenmodel tussen in vitro kanker celculturen en in vivo tumor modellen18,19,20,21. De 3D-tumor sferoïde modellen hebben aan populariteit gewonnen in kanker stamcelonderzoek, preklinisch kankeronderzoek, en drug screening, omdat deze modellen reproduceren een aantal belangrijke kenmerken van echte tumoren die afwezig zijn in de traditionele 2D monolayers22. Veel bestaande 3D-tumor sferoïde modellen zijn uitsluitend samengesteld uit tumorcellen en missen de deelname van tumor stromal cellen. Dit resulteert vaak in tumor sferoïden met onvoldoende ECM depositie en afwezigheid van heterotypische cel-cel interacties. Conventionele 3D-sferoïden die uitsluitend worden gevormd door kankercellen en homotypische celcelhechting kunnen de in vivo omstandigheden van tumorweefsels slechts gedeeltelijk nabootsen. Om een aantal van deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers voorgesteld het opnemen van meerdere soorten stromalcellen in 3D-coculturen en ontwikkelde verschillende heterotype 3D tumor sferoïde modellen23,24,25,26,27. Daarnaast hebben onderzoekers exogene 3D-matrices gebruikt, waaronder natuurlijke hydrogels of synthetische polymeren zoals polyethyleenglycol, poly(lactide- co-glycolide) en poly(N-isopropylacrylamide), om monocellulaire en meercellige spheroïdemodellen in te bedden, een celondersteunende omgeving te creëren en cel-interactiematrixen28,29te reproduceren, waardoor deze systemen biologisch relevanter worden30. Echter, de integratie van bepaalde soorten stromale cellen, zoals endotheelcellen, in 3D-coculturen brengt extra complexiteit voor een in vitro systeem en maakt het moeilijk om heterotypische cel-cel interacties tussen twee specifieke soorten cellen, zoals kanker cel-fibroblast interacties te bestuderen. Bovendien, endotheelcellen in echte weefsels niet altijd direct interageren met kankercellen en andere stromalcellen, omdat er een laag van kelder membraan gewikkeld buiten de haarvaten die voorkomt dat endotheelcellen van direct interactie met kankercellen en andere stromalcellen. In die 3D sferoïde modellen vormen opgenomen endotheelcellen eigenlijk geen bloedvaten, maar interageren ze direct met kankercellen en andere stromalcellen, iets dat zelden in vivo voorkomt. Op dezelfde manier zijn exogene matrices die in sommige van de 3D-sferoïde modellen worden gebruikt, niet identiek aan de ECM in echte tumorweefsels in termen van structuur en samenstelling. Al deze kunstmatige omstandigheden kunnen leiden tot misleidende gegevens.
We hebben onlangs een nieuwe meercellige 3D sferoïde model samengesteld uit tumorcellen en CAF. In ons model wordt de vorming van 3D tumor sferoïden volledig bepaald door CAF. CAF induceeren en reguleren van het fenotype van tumorstam / initiëren de cellen. De ECM geproduceerd door CAF is natuurlijk en maakt het mogelijk de desmoplastic structuur beter na te bootsen de in vivo tumor micro-omgeving. Dit nieuwe 3D-model kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het screenen van kankergeneesmiddelen en biedt een uniek platform om tumor-stroma-interactie te bestuderen, te verduidelijken hoe CAF kankerstamcellen/initiërende cellen reguleert en de betrokkenheid van stromalinteracties in gevoeligheid en resistentie van kankergeneesmiddelen onderzoekt.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-253-CI</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>351147</td><td>Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid</td></tr><tr><td>Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1.5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2674</td><td>500 mg, 1 mg/mL concentratie in DMEM.</td></tr><tr><td>DakoCytomation</td><td>Dako</td><td>x0909</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase Grade II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>165859</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VMR</td><td>97068-085</td><td>Premium Grade</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Gratis te downloaden, geen licentie nodig.</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom 2016A</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom System</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 Inverted Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCDB 153 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone</td><td>Abcam</td><td>ab18640</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem Chemicals</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>30-002- CI</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate 7.5%</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

een nieuwe stromal fibroblast-gemoduleerde 3d tumor sferoïde model voor het bestuderen van tumor-stroma interactie en drug discovery

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interacties spelen een belangrijke rol in de progressie van kanker. Driedimensionale (3D) tumor sferoïde modellen zijn de meest gebruikte in vitro model in de studie van kanker stam / initiëren van cellen, preklinisch kankeronderzoek, en drug screening. De 3D sferoïde modellen zijn superieur aan conventionele tumorcelcultuur en reproduceren enkele belangrijke karakters van echte vaste tumoren. Echter, conventionele 3D-tumor sferoïden zijn uitsluitend samengesteld uit tumorcellen. Ze missen de deelname van tumorstromalcellen en hebben onvoldoende extracellulaire matrix (ECM) afzetting, dus slechts gedeeltelijk nabootsen van de in vivo voorwaarden van tumorweefsels. We hebben een nieuw meercellig 3D-sferoïde model opgericht dat bestaat uit tumorcellen en stromalfibroblasten die de in vivo heterogene tumormicro-omgeving en de inheemse desmoplasia beter nabootsen. De vorming van sferoïden wordt strikt gereguleerd door de tumor stromal fibroblasten en wordt bepaald door de activiteit van bepaalde cruciale intracellulaire signalering seinen trajecten (bijvoorbeeld Notch signalering) in stromal fibroblasten. In dit artikel presenteren we de technieken voor cocultuur van tumorcellen-stromal fibroblasten, time-lapse beeldvorming om cel-cel interacties te visualiseren, en confocale microscopie om de 3D architectonische kenmerken van de sferoïden weer te geven. We tonen ook twee voorbeelden van de praktische toepassing van dit 3D sferoïde model. Deze nieuwe meercellige 3D sferoïde model biedt een nuttig platform voor het bestuderen van tumor-stroma interactie, verduidelijken hoe stromal fibroblasten reguleren kanker stam / initiëren van cellen, die tumor progressie en agressiviteit te bepalen, en het verkennen van betrokkenheid van stromal reactie in kanker drug gevoeligheid en resistentie. Dit platform kan ook een relevant in vitro model voor drugsontdekking.

We ontwikkelden een nieuwe methode om 3D sferoïden te genereren met een in vitro heterotypische celcocultuursysteem dat de in vivo tumormicroomgeving nabootst. Fibroblasten zijn afgeleid van de muis huid fibroblasten. Huidfibroblasten werden gegenereerd zoals hierboven beschreven en werden gekarakteriseerd als α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ cellen. Menselijke gemetastaseerde melanoomcellen (C8161) werden gekweekt in W489 medium zoals beschreven32. Om fibroblasten te visualiseren en te onderscheiden van tumorcellen, werden fibroblasten en melanoomcellen vooraf transtrans-geïnduceerd met respectievelijk GFP/lentivirus en DsRed/lentivirus34,36, vóór celcocultuur.
Figuur 1 toont een voorbeeld van meercellige 3D-sferoïden gevormd door coculturing melanoomcellen en fibroblasten. Melanoomcellen gekweekt in de afwezigheid van fibroblasten vormden geen typische 3D sferoïden, hoewel sommige melanoomcellen 2D-clusters/aggregaten vormen met de uitgebreide cultuur. De gemiddelde grootte van de sferoïden was ongeveer 170-360 μm in diameter (gemiddelde = 275, SD = 37) op dag ~5−7. Met behulp van time-lapse beeldvorming, merkten we op dat fibroblasten en tumorcellen interactie in cocultuur en begon te vormen 3D sferoïden op ongeveer 36 uur cocultuur zoals getoond in Video 1. Time-lapse imaging registreerde het dynamische proces van celcelinteractie en de eerste fase van sferoïdevorming bij ~4-52 uur cocultuur. De piek van 3D sferoïde vorming vond plaats rond dag ~ 5−7. De gevormde 3D sferoïden waren samengesteld uit fibroblasten en melanoomcellen, waarbij de meerderheid (~80%) waren tumorcellen. Video 2 toont het dynamische proces van enkele gekweekte melanoomcellen (DsRed+/C8161) in de vorming van celcluster/aggregaten vanaf ~ 4-52 uur in één cultuur. De vorming van 2D clusters/aggregaten piekte rond dag ~7–10. Video 3 en Video 4 tonen de structuren van een 3D-sferoïde en een 2D-tumorcelcluster die respectievelijk door confocale microscopie wordt gevisualiseerd. De 3D sferoïde en de 2D-tumorcelclusters werden onderzocht door confocale microscopie op dag 7 van celcocultuur. Video 5 laat zien dat de 3D-sferoïden werden opgehangen in het kweekmedium en mobiel, terwijl video 6 laat zien dat het 2D-tumorcelcluster aan de kweekplaat en onbeweeglijk was bevestigd. Vering in het medium is een kenmerk van 3D sferoïden die hen onderscheidt van 2D-clusters. Wanneer het medium in de celkweekschotel of goed wordt verstoord door het kweken of zachtjes beluchten van het kweekmedium, bewegen de opgehangen 3D-sferoïden, terwijl 2D-celclusters onbeweeglijk zijn. Slechts een paar enkele dode cellen zijn mobiel.
Figuur 2A toont een voorbeeld van dit 3D-model dat dient als een uniek platform om tumor-stroma interacties te bestuderen en om te verduidelijken hoe intracellulaire Notch1 signalering pad activiteit in CAF regelt kanker stam / initiëren van cellen en sferoïde vorming. Twee paar fibroblasten (Fb) geïsoleerd van de huid van Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) muizen versus hun tegenhanger controle (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) muizen en Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) muizen versus hun tegenhanger controle (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) muizen35, respectievelijk. Alle fibroblasten werden trans-geïnduceerd door GFP/lentivirus en cogekweekt met C8161 melanoomcellen vooraf transtransduced met DsRed/lentivirus. Time-lapse imaging toont aan dat Fb-GOFNotch1 gestopt C8161 melanoom cellen van de vorming van 3D sferoïden in vergelijking met Fb-GOFctrl tijdens de eerste ~ 4-52 h van de cel cocultuur. Fb-LOFNotch1 daarentegen bevorderde de vorming van 3D-sferoïden door C8161 melanoomcellen in vergelijking met Fb-LOFctrl. Figuur 2B, top, toont representatieve beelden van 3D sferoïden gevormd op dag 7 van celcocultuur met verschillende fibroblasten het uitvoeren van gevarieerde Notch route activiteiten. Figuur 2B, onder, toont de kwantitatieve gegevens over de gemiddelde grootte van 3D sferoïden gevormd op dag 7 van celcocultuur met verschillende fibroblasten die gevarieerde Notch-trajectactiviteiten uitvoeren.
Figuur 3 toont een voorbeeld van dit 3D-model dat wordt gebruikt om de medicijnrespons van kankerstamcellen/initiërende cellen te testen. Kankercellen/initiërende cellen zijn aangetoond dat ze verantwoordelijk zijn voor resistentie tegen geneesmiddelen en kanker recidief. Daarom kan het evalueren van de reactie op geneesmiddelen met behulp van dit 3D-model beter de klinische werkzaamheid van een potentieel geneesmiddel voor de behandeling van kanker onthullen. De C8161 melanoomcellen vertrouwen op actieve MAPK-signalering voor celgroei en invasie. Ze drukken ook hoge niveaus van CDK4 / Kit, maar dragen geen BRAF mutatie. Om de medicijnrespons van kankerstam/initiërende cellen naar de MAPK-remmer te testen met behulp van dit 3D-model, cokweekten we C8161 melanoomcellen en fibroblasten in 24 putplaten. PD0325901 (zie Tabel met materialen), een MAPK-remmer, werd bereid in een seriële verdunning bij een reeks concentraties van 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM en 25 nM. De PD0325901 werd toegevoegd aan de celcoculturen toen celmengsels werden verguld. Onbehandelde cocultuurcellen werden gebruikt als controle. We evalueerden het sferoïde-vormende vermogen van de celcoculturen onder verschillende medicijnconcentraties en vergeleken het met de onbehandelde controle. Figuur 3A toont representatieve beelden van 3D-sferoïden gevormd op dag 5 van celcocultuur onder verschillende drugsconcentraties. Figuur 3B is de kwantitatieve gegevens van de gemiddelde grootte per sferoïde en het aantal 3D-sferoïden dat per laag vermogen (LPF x 4) op dag 5 van de celcocultuur onder verschillende drugsconcentraties wordt gevormd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig01.jpg"> Figuur 1: Vorming van 3D-sferoïden en 2D-clusters. (A) Representatief beeld van 3D sferoïden gevormd door cocultuur van menselijke C8161 melanoomcellen en muishuid fibroblasten. De 3D sferoïden werden gefotografeerd op dag 7 van de cocultuur van melanoomcellen en fibroblasten. De gemiddelde afmetingen van de sferoïden was ~ 170-360 μm in diameter (gemiddelde = 275, SD = 37) op dag ~ 5−7. Het gemiddelde aantal sferoïden was 18-26 (20,5 ± 3,6) per laag vermogensveld (LPF x4). (B) Representatief beeld van 2D tumorcelclusters gevormd door eenenkele cultuur van C8161 melanoomcellen. De 2D melanoom cel clusters werden gefotografeerd op dag 7 van single cultuur van melanoom cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig02.jpg"> Figuur 2: Opheldering van de rol van intracellulaire Notch1 signalering pad activiteit in CAF in het reguleren van kanker stam / initiëren van cellen met behulp van de 3D sferoïde model. (A) Intracellulaire Notch1 signalering pad activiteit in CAF bepaald de vorming van sferoïden door melanoom cellen in cel cocultuur. Time-lapse video toont aan dat Fb-GOFNotch1 gestopt met de vorming van 3D sferoïden door de C8161 melanoom cellen, terwijl Fb-LOFNotch1 bevorderd de vorming van meer 3D sferoïden door de C8161 melanoom cellen tijdens de eerste 4-52 h van de cel cocultuur. (B) Top: Representatieve beelden van 3D sferoïden gevormd op dag 7 van celcocultuur met verschillende fibroblasten die gevarieerde Notch route functies. Bodem: De kwantitatieve gegevens van de gemiddelde grootte (diameter [μm]/sferoïde) van de 3D sferoïden gevormd op dag 7 van celcocultuur met verschillende fibroblasten die gevarieerde Notch-trajectactiviteiten uitvoeren. De t-test van de tweestaartstudenten werd gebruikt voor statistische analyse. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig2alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig03.jpg"> Figuur 3: Beoordeling van de reactie van geneesmiddelen op kankerstam/initiërende cellen met behulp van het 3D-sferoïdemodel. (A) Representatieve beelden van 3D sferoïden gevormd op dag 5 van celcocultuur onder verschillende concentraties van geneesmiddelen. (B) De kwantitatieve gegevens van de gemiddelde grootte (diameter [μm]/sferoïde) en het aantal 3D-sferoïden per laag vermogen (LPF x 4) die op dag 5 van de celcocultuur onder verschillende drugsconcentraties zijn gevormd. Kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig3alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Screenshot 1" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid01.jpg"> Video 1: Dynamisch proces van vorming van 3D sferoïden in de vroege fase van celcocultuur. Time-lapse imaging toont dynamische celcelinteracties tussen fibroblasten en tumorcellen in de cocultuur en vorming van 3D sferoïden tijdens de eerste ~4-52 uur celcocultuur. De cellen begonnen 3D sferoïden te vormen rond 48 uur na het begin van de cocultuur. De piek van 3D sferoïde vorming vond plaats op dag ~ 5−7 (hier niet weergegeven). De 3D sferoïden waren samengesteld uit fibroblasten en melanoomcellen, waarbij de meerderheid (~80%) waren tumorcellen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_1.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Screenshot 2" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid02.jpg"> Video 2: Dynamisch proces van vorming van 2D-clusters in de vroege fase van celcocultuur. Time-lapse imaging toont het dynamische proces van 2D-clusters gevormd door C8161melaomcellen in één cultuur. Vorming van 2D clusters vond plaats rond dag ~ 7–10. Time-lapse imaging registreert de periode van ~ 4-52 uur in enkele cultuur van DsRed+/C8161 melanoomcellen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_2.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Screenshot 3" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid03.jpg"> Video 3: Architectuur en rotatie van een 3D sferoïde zoals gevisualiseerd door confocale microscopie. Architectuur en rotatie van een 3D sferoïde. Groene en rode lasers werden gebruikt om de sferoïden gevormd op dag 7 in cel cocultuur te scannen. Het scangebied werd bepaald onder een doelstelling van 10x. De scan begint van de onderkant naar de bovenkant van de sferoïde bij een z-stap van 1 μm. De 3D sferoïde rotatie film is gemaakt met behulp van Fiji software. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_3.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Screenshot 4" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid04.jpg"> Video 4: Architectuur en rotatie van een 2D tumorcelcluster zoals gevisualiseerd door confocale microscopie. Architectuur en rotatie van een 2D-cluster. Confocale beelden van celclusters werden genomen op dag 7 van melanoom cel enkele cultuur. Het scangebied werd bepaald onder een doelstelling van 10x. De scan begint van de onderkant naar de bovenkant van de sferoïde bij een z-stap van 1 μm. De 2D-cluster rotatie film is gemaakt met behulp van Fiji software. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_4.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Screenshot 5" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid05.jpg"> Video 5: Beweging van 3D sferoïden. De 3D sferoïden werden opgehangen in het kweekmedium en hielden zich niet aan het kweekgerecht/goed. Toen nog medium in de celcultuur goed werd verstoord door zachte pipetteren, de geschorste 3D sferoïden verplaatst. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_5.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Screenshot 6" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid06.jpg"> Video 6: Standvastigheid van 2D tumorcelclusters. De 2D tumorcelcluster werd verankerd aan de cultuurplaat en onbeweeglijk ondanks verstoring van het kweekmedium. Een paar enkele dode cellen waren mobiel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_6.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Een nieuwe drie-dimensionale sferoïde model gebaseerd op de heterotypische interactie van tumorcellen en stromal fibroblasten wordt vastgesteld. Hier presenteren we cocultuur van tumorcellen en stromalfibroblasten, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie om de vorming van sferoïden te visualiseren. Dit driedimensionale model biedt een relevant platform om tumor-stroma interacties te bestuderen en kankertherapieën te testen.

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

We hebben een nieuw 3D-sferoïdenmodel ontwikkeld dat een platform biedt om kanker-stroma-interacties te bestuderen en kankertherapeutisch te testen. Naar mijn mening combineert dit 3D-systeem kankercellen in een stroma fibroblast om echte tumoraandoeningen beter na te bootsen en kan daarom een zeer krachtig hulpmiddel zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen. Bovendien is dit model niet beperkt tot studie Melanoom.Het kan worden gebruikt om andere vormen van kanker te onderzoeken. Het aantonen van de procedure zal Dr.Hongwei Shao zijn, een senior wetenschapper van mijn lab. Voor de menselijke melanoomcelcultuur, gooi de cellen onder conventionele aanhangende celkweekvoorwaarden en voltooi W489 medium bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide.Wanneer de cellen 90% samenvloeiing bereiken, splits de cellen op een verhouding van één tot vijf. Voor de fibroblastcultuur van de muishuid, was de geoogste weefselkorrels in PBS alvorens de specimens te kweken en DMEM aangevuld met 10 procent foetaal runderserum en één procent penicilline-streptomycine in de celkweek incubator. Splits de cellen met een één-op-twee-verhouding wanneer ze een samenvloeiing van 90 procent bereiken.Voor het opzetten van de coculturen, zaad fibroblasten op een 100 millimeter schotel bij een concentratie zodanig dat de cel samenvloeiing zal bereiken ongeveer 60 procent de volgende dag. De volgende ochtend, vervang de supernatant met een een-op-drie tot een-vijf concentratie van GFP naar lentivirus verdund uit voorraad in de reguliere cultuur medium aangevuld met vier microgram per milliliter polybrene. Plaats de cellen in celcultuur incubator voor zes uur voor de vervanging van de supernatant met verse cultuur medium.Observeer na twee dagen het GFP-signaal van de cellen op een fluorescentiemicroscoop. Wanneer beide celculturen stabiel zijn doorgetransfecteerd, los beide celculturen van 0,25 trypsin-EDTA om de eencellige suspensies te verzamelen door centuvigation. Stel de cellen opnieuw op met twee keer 10 tot vierde cel per milliliter van de cocultuurmediumconcentratie en meng de melanoomcellen en fibroblasten met een één-op-één verhouding.Dan zie twee milliliter cellen aan elke put van een 24 put plaat en drievoud voor elke aandoening en plaats de plaat in de cel cultuur incubator voor vier uur om de cellen te hechten aan de plaat bodem. Voor melanoomcel solo cultuur om 2D celclustervorming te evalueren, zie twee keer 10 tot de vierde melanoomcellen in elke put van een 24 put plaat en cultuur de cellen gedurende zeven tot 10 dagen in de celcultuur incubator. Fotografeer vervolgens de cellen op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop volgens standaard fluorescerende microscopieprotocollen.Als het time lapse imaging-systeem is uitgeschakeld, schakelt u het ten minste een uur voor de beeldvorming in. Wanneer het systeem klaar is, breng je de kweekplaat voorzichtig over naar het stadium van de microscoop en schuif je de couveuse en sluit je de deur stevig af. Open de software van time lapse imaging systeem en klik op vat toevoegen om de plaat type en de fabrikant te selecteren, zodat de microscoop kan het scannen gebied nauwkeurig te lokaliseren.Selecteer een 10 keer objectieve lens en de putten van belang en stel de parameters in voor het scangebied, de intervaltijd tussen de scans en een begin- en eindtijd. Noteer vervolgens de time lapse imaging van vier tot 52 uur. Gebruik aan het einde van de beeldopname de time lapse imaging-systeemsoftware om de gegevens op te halen en de verzamelde video's of afbeeldingssets te exporteren.Voor confocale microscopie beeldvorming van de coculturen, plaats de plaat op het podium van een omgekeerde fluorescentie microscoop en selecteer de rode en groene laserstralen. Observeer de cellen onder een doelstelling van vijf of 10 keer en selecteer de sferoïde om te beginnen met scannen. Met behulp van een een micron z-stap, scannen van de onderkant naar de bovenkant van de sferoïde.Verwerk vervolgens de gegevens met behulp van de juiste software voor beeldverwerking om een 3D-afbeelding te reconstrueren die verder kan worden gedraaid en opgeslagen als een 3D-film. Hier worden afbeeldingen getoond van meercellige 3D-sferoïden gevormd door gecocultureerde melanoomcellen en fibroblasten. Melanoomcellen gekweekt bij afwezigheid van fibroblasten vormen geen typische 3D-sferoïden, hoewel sommige melanoomcellen 2D-clusters vormen met een uitgebreide cultuur.Met behulp van time lapse imaging, fibroblasten en tumorcellen kunnen worden waargenomen interactie in cocultuur, te beginnen met sferoïden op ongeveer 36 uur. In deze film kan het dynamische proces van single gekweekte melanoomcelaggregaatvorming van vier tot 52 uur cultuur worden waargenomen. Hier kan een 3D-sferoïde structuur worden waargenomen door confocale microscopie na zeven dagen cultuur, terwijl in deze film een 2D-celcluster kan worden gevisualiseerd.3D-sferoïden blijven hangen in cultuurmedium en zijn mobiel, terwijl 2D-tumorcelclusters de neiging hebben om zich aan de kweekplaat te hechten en zijn onbeweeglijk. Dit 3D-model dient als een uniek platform voor het bestuderen van tumor-stroma interacties. Bijvoorbeeld, voor het ophelderen van hoe intercellulaire Notch1 signalering traject activiteit en kanker geassocieerd fibroblasten reguleren van kanker stam en het initiëren van cel-en sferoïde vorming.Bovendien kan dit model worden gebruikt om de medicijnreacties van kankerstam en initiërende cellen te testen. Hoewel deze methode eenvoudig en rechttoe rechtaan is, zorg ervoor dat u de juiste celdichtheid en celverhouding gebruikt en de juiste kweekplaten gebruikt zoals aangetoond. Dit 3D-model kan ook worden toegepast voor ofwel sedating cruciale intracellulaire signalering traject activiteit voor het bepalen van de fenotypes van kanker stamcellen, alsmede screening kleine molecule verbindingen waaraan kanker stamcellen zijn zeer gevoelig.

a-novel-stromal-fibroblast-modulated-3d-tumor-spheroid-model-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een sferoïde huidmodel voor 3D organotypic melanoom die zowel de architectuur recapituleert en meercellige complexiteit van een orgel/tumor in vivo maar tegelijkertijd herbergt systematische experimentele interventie.

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Dit protocol presenteert een 3D biomimetisch model met bijbehorend fibrotisch stromaal compartiment. Bereid met fysiologisch relevante hydrogels in verhoudingen die de biofysische eigenschappen van de stromale extracellulaire matrix nabootsen, een actieve bemiddelaar van cellulaire interacties, tumorgroei en uitzaaiingen.

Een biomimetisch model voor leverkanker om tumor-stroma-interacties te bestuderen in een 3D-omgeving met afstembare bio-fysische eigenschappen

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Ontdek een nieuw 3D tumor-sferoïde model met stromale fibroblasten voor het bestuderen van tumor-stroma interacties en het testen van kankertherapeutica. Deze methode bootst in vivo tumoromstandigheden nauwkeurig na.

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery (Video) | JoVE Journal

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Meer video's verkennen