Name: Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer hoe je hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes produceert met envelopglycoproteïnen van H5N1 en H7N9. Deze methode evalueert infectiviteit via qRT-PCR in BSL-2 omgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van Zhejiang Provincial Medicine en Health Science and Technology Plan (subsidie nummers, 2017KY538), Hangzhou gemeentelijke geneeskunde en Gezondheidswetenschappen en technologie plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science en Technologisch sleutel project (subsidie nummers, 2014Z11) en gemeentelijk autonome toepassings project van Hangzhou voor sociale ontwikkeling en wetenschappelijk onderzoek (subsidie nummers 20191203B134).

1. dag 1: celkweek en seeding
<ol><li>Cultiveer de menselijke embryonale nier (HEK) 293T/17 cellen in 60 mm gerechten met Dulbecco's gemodificeerde Essential medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U/mL penicillaire-streptomycine (DMEM complete medium, DCM) in a 37 °C, 5% kooldioxide (CO2) incubator tot ongeveer 80% Confluent. Opmerking: HEK 293T/17 lage passage cellen worden aanbevolen.</li>
	<li>Was de cellen voorzichtig met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x. Let op: handmatige hantering van de HEK 293T/17 cellen moet zeer zacht zijn, omdat ze gemakkelijk los te koppelen.</li>
	<li>Verwijder PBS en dissocieren de cellen met 1 mL 0,25% trypsine-ethyleen diamine-tetraazijnzuur (EDTA)-oplossing. Plaats de schaal in een incubator van 37 °C, 5% CO2 voor niet meer dan 5 minuten totdat de cellen zijn losgekoppeld.</li>
	<li>Deactiveer trypsine door 5 mL DCM toe te voegen. Dispergeer de cellen in een eencellige suspensie door meerdere malen op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Breng de celsuspensies over naar een voorgekoelde centrifugebuis van 15 mL. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.</li>
	<li>Decanen zo veel mogelijk van het supernatant. Respendeer de celpellet met 6 mL DCM medium en Tel de cellen. Verdun de cellen tot 1 x 106 cellen/ml met DCM-medium.</li>
	<li>Zaai de cellen in een 6-put plaat met 1 mL celsuspensie per put. DEP de plaat zachtjes om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incuberen de plaat 's nachts (14 – 16 uur) in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>2. dag 2: vier-plasmide Cotransfection gemedieerd door Lipofection
<ol><li>Controleer de celmorfologie en dichtheid onder een omgekeerde lichtmicroscoop. Idealiter moeten cellen ongeveer 85% Confluent Health zijn bij transfectie. Vervang het medium met 1 mL serumvrij DMEM-medium per put en plaats de plaat vervolgens weer in de incubator. Let op: handmatige hantering van de HEK 293T/17 cellen moet zeer zacht zijn, omdat ze gemakkelijk los te koppelen.</li>
	<li>Voor elke put van gekweekte cellen die moeten worden getransventeerd, Verdun 8 μL van het transfectiereagens tot een volume van 150 μL met verlaagd serum medium (buis 1). Meng zachtjes en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT, ongeveer 20 °C). Opmerking: voor elk transfectie monster, bereid twee 1,5 ml micro centrifugebuizen, genummerd 1 en 2.</li>
	<li>Verdun in buis 2 2,5 μg plasmide DNA in 150 μL verlaagd serum medium. NB: Verdun in buis 2 elk plasmide DNA, zoals weergegeven in tabel 1. Een plasmide codering vesiculaire stomatitis virus (VSV) G glycoproteïne (plasmide pLP-VSVG) werd gebruikt als een positieve controle, omdat VSV een breed scala aan cellen kan infecteren. Negatieve controle deeltjes die een gebrek hebben aan influenza-enveloppe glycoproteïnen (Δenv PPS) werden gegenereerd met behulp van pcDNA-gag-Pol en pcDNA-GFP plasmiden.</li>
	<li>Na een incubatie van 5 minuten combineert u het verdunde DNA met het verdunde transfectie reagens. Meng zachtjes en inincuberen voor nog eens 15 min bij RT.</li>
	<li>Voeg het DNA-lipide-complex toe aan de overeenkomstige put met de cellen en serumvrij medium. Meng zachtjes door de plaat heen en weer te rocken.</li>
	<li>Na incubatie voor 4 – 6 h in een 37 °C, 5% CO2 incubator, verwijder het medium en vervang het door 2 ml DMEM. Incuberen voor nog eens 36 – 48 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2 . Opmerking: Vervang met serum vrije en antilichaam-vrije DMEM. In dit protocol kunnen twee HAs en Two NAs worden gebruikt om acht soorten PPS te genereren (weergegeven in tabel 1).</li>
</ol>3. dag 3: gevoelige cellen zaaien
<ol><li>Voor de infectiviteit Assay, zaad elk type gevoelige cellen op 1 x 104 cellen per put in een 96 goed plaat. Opmerking: gebruik twee soorten doelcel om de infectiviteit assay in dit artikel uit te voeren: een alveolaire-afgeleide menselijke cellijn (A549 cellen) en de Madin-Darby Canine nier (MDCK) cellen. MDCK-cellen worden veel gebruikt in influenza onderzoek en kunnen een goede controle zijn. Deze stap is flexibel. Alle andere doelcellijnen kunnen worden gebruikt volgens de onderzoeksvereisten.</li>
	<li>Incuberen de plaat 's nachts (14 – 16 uur) in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>4. dag 4: verzameling van pseudo-getypte virale deeltjes, kwantificering en infectiviteit assay
<ol><li>Pseudo-getypte virale deeltjes collectie<ol>
<li>Controleer de kleur van het medium. Idealiter moet het lichtroze of licht oranje zijn. Onderzoek de cellen met een omgekeerde fluorescerende biologische Microscoop onder 440 – 460 nm.</li>
		<li>Bij 36 – 48 h posttransfectie, oogst de PPS door door te gaan door een 0,45 μm Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraanfilter om celresten te elimineren.</li>
		<li>Verdeel de PPS in kleine volume aliquots.</li>
		<li>Bewaar de PPS bij-80 °C. Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Dit wordt echter niet aangemoedigd, omdat de infectiviteit van de KKS na bevriezing en ontdooiing sterk zal dalen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pseudo-getypte virale deeltjes kwantificering<ol>
<li>Breng 20 μL gezuiverde PPS over naar een 1,5 mL ribonuclease (RNase)-vrije microcentrifuge buis.</li>
		<li>Voeg 1 μL van 0,24 e/mL benzonase Nuclease toe. Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur om DNA-en RNA-besmetting te elimineren. Opmerking: target RNA, vaak gedowngereguleerd cytomegalovirus (CMV)-GFP RNA, is verpakt in de PPS en kan voorkomen dat het wordt aangetast door benzonase Nuclease.</li>
		<li>Vries het monster bij-70 °C in om de benzonase Nuclease te deactiveren.</li>
		<li>Voeg 2 μL proteïnase K. inincuberen bij 50 °c gedurende 30 minuten om de envelop eiwitten te verteren en het CMV-GFP-RNA vrij te geven. Inactiveren van de proteïnase K bij 100 °c gedurende 3 min.</li>
		<li>Kwantificeer de PPS door real-time kwantitatieve reverse-transcriptie (qRT)-PCR met een Universal probe One-Step RT-qPCR Kit, met behulp van de voorwaartse primer 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', de omgekeerde primer 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ', en de sonde 5 '-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3 ', op een real-time PCR-Thermo cycler. Normaliseer de PPS voor RNA-kopie nummer vóór infectiviteit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infectiviteit assay<ol>
<li>Verdun elk type PPS in termen van de qRT-PCR-gegevens tot 4 x 105 kopieën/ml (PP-normalisatie).</li>
		<li>Voeg Tosyl-fenylalanine Chlooromethyl-keton (TPCK)-trypsine toe aan een eindconcentratie van 40 μg/mL in PPS die haven H7N9 HA. Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur om de functionele subeenheden HA1 en HA2 te vormen. Opmerking: er is geen noodzaak om de PPS die Harbor H5 met TPCK-trypsine behandelen, omdat ze hebben meerdere arginine en lysine residuen op de HA1-HA2 decolleté site. Deze multi-Basic decolleté site kan worden gesplitst door alomtegenwoordige cellulaire proteasen.</li>
		<li>Meng genormaliseerde PPS met DMEM medium (serumvrij) bij een verhouding van 1:1 (volume/volume).</li>
		<li>Breng de plaat met gevoelige cellen in de bioveiligheidskast.</li>
		<li>Aspireren de supernatant en was de cellen één keer met 0,1 mL voorverwarmde PBS.</li>
		<li>Voeg 0,1 mL PPS-DMEM mengsel toe aan één put. Drie keer de infectiviteit testen van elk type PPS naar één vatbare cellijn ( overzien in figuur 2).</li>
		<li>Incuberen de 96 goed plaat voor 4 – 6 h in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Aspireren de supernatant en vervang met 0,1 mL DCM.</li>
		<li>Incuberen de 96 goed plaat voor nog eens 24 – 36 h in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. dag 5 of 6: infectiviteit detectie
<ol><li>Breng de 96 well plate naar de bioveiligheid Cabinet.</li>
	<li>Aspireren de supernatant en was de cellen 1x met 0,2 mL voorverwarmde PBS.</li>
	<li>Verwijder PBS en dissocieren de cellen met 0,1 mL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing.</li>
	<li>Plaats de schaal in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 minuten totdat de cellen zijn losgekoppeld. Opmerking: Vermijd incuberen gedurende meer dan 5 min, omdat dit zal leiden tot het klonteren van de cel.</li>
	<li>Deactiveer trypsine door toevoeging van 0,4 mL DCM.</li>
	<li>Dispergeer de cellen in eencellige suspensie door meerdere malen op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Breng de celsuspensies over in een gekoelde micro centrifugebuis van 1,5 mL.</li>
	<li>Bepaal de GFP reporter-positieve cellen met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Opmerking: om de ratio van GFP reporter-positieve doelcellen te bepalen, stelt u flow cytometer-Gates in met behulp van de controlemonsters (PPS-onbehandelde A549 cellen of MDCK-cellen) en telt u vervolgens de GFP reporter-positieve cellen van 10.000 cellen per monster.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol beschrijven we een methode om influenzavirus pseudo-getypte deeltjes (PP) in een BSL-2-instelling te produceren. De verslaggever plasmide pcDNA-GFP is opgenomen in de PPS en kan worden gebruikt om PPS te kwantificeren door FACS in een infectiviteit assay. We kozen voor twee soorten gevoelige cellijnen omdat ze op grote schaal worden gebruikt in influenza onderzoek. MDCK-cellen zouden een goede controle geven op de variabele vereeuwigd menselijke cellen die in deze studies worden gebruikt.
<p class="jo...

De missie van een virale deeltje is het vervoer van zijn genoom van een geïnfecteerde gastheer cel naar een niet-geïnfecteerde host cel en om het te leveren in het cytoplasma of de Nucleus in een replicatie-bevoegde vorm1. Dit proces wordt in eerste instantie veroorzaakt door binding aan host cel receptoren, gevolgd door fusie van virion en cellulaire membranen. Voor omhulde virussen, zoals influenzavirussen, zijn de Spike glycoproteïnen verantwoordelijk voor de receptor binding en Fusion1,2. Virale envelop glycoproteïnen (bijv. pyrogenen, antigenen), zijn betrokken bij veel belangrijke eigenschappen en gebeurtenissen, zoals initiatie van de virus levenscyclus (binding en fusie), virale pathogenese, immunogeniciteit, host Cell apoptosis en cellulaire tropisme, het cellulaire endocytische traject, evenals interspecifieke transmissie en reassortiment1,3,4,5,6,7. Onderzoek naar virale envelop glycoproteïnen zal ons helpen veel aspecten van het virale infectie proces te begrijpen. Pseudo-getypte virale deeltjes (PP), ook wel pseudo virionen of pseudopartikelen genoemd, kunnen worden gegenereerd door middel van een pseudo type techniek8,9,10. Deze technologie is gebruikt om pseudo-getypte deeltjes van veel virussen te ontwikkelen, waaronder hepatitis C11,12, hepatitis B13, vesiculaire stomatitis virus (VSV)14,15en influenzavirus16,17,18,19. Deze technologie is gebaseerd op het gag-Pol-eiwit van lentivirussen of andere retrovirussen.
Pseudo-getypte virale deeltjes kunnen worden verkregen met behulp van een drie-plasmide systeem door cotransfecting een virale envelop glycoproteïne expressie plasmide, een retrovirale verpakking plasmide ontbreekt het omhulsel env gen, en een afzonderlijke verslaggever plasmide in PP-producerende cellen. De retrovirus wordt geassembleerd door zijn gag eiwit, en het knoppen van een geïnfecteerde celmembraan dat de virus envelop eiwit1uitdrukt. Daarom is het mogelijk om hoge titer influenza PPS te verkrijgen met behulp van het retrovirus gag Protein om knoppen te produceren op een cellulair membraan dat influenza HA en NA uitdrukt. In onze vorige studies waren/NAs in alle combinaties functioneel en in staat om hun corresponderende functies uit te voeren in de virale levenscyclus16,17,18,20,21. Deze PPS worden gebruikt voor het onderzoeken van de influenza biologische kenmerken, met inbegrip van hemagglutinatie, neuraminidase activiteit, HA-receptor bindend tropisme, en infectiviteit. Omdat HA en NA beide belangrijke oppervlakte functionele eiwitten in de virale levenscyclus zijn, kan niet-overeenkomende heeft en NAs afgeleid van verschillende soorten influenza gedeeltelijk reassortiment tussen hen aantonen. Hier genereren we acht soorten influenza PPS door twee HAs en twee NAs (afgeleid van de HPAI H5N1-stam en de H7N9 Stain) te combineren met behulp van een drieplasmide pseudo type systeem. Deze acht soorten PPS omvatten twee eigen PPS, H5N1pp, H7N9pp; twee niet-overeenkomende PPS, (H5 + N9) pp, (H7 + N1) pp; en vier KKS die slechts één glycoproteïne (HA of NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. onderzoeken naar het influenzavirus, zoals H5N1 en H7N9, worden beperkt door de bioveiligheidsvereisten. Alle onderzoeken naar de stammen van het wild influenzavirus dienen te worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudo-getypte virale deeltjes technologie kan worden gebruikt voor het verpakken van een kunstmatige virion in een bioveiligheid Level 2 (BSL-2)-instelling. Daarom vertegenwoordigen PPS een veiliger en nuttig hulpmiddel om de influenzavirus processen te bestuderen, afhankelijk van de twee belangrijkste glycoproteïnen: hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA).
Dit protocol beschrijft het genereren van deze PPS met een drie-plasmide cotransfection-strategie ( overzien in figuur 1), hoe PPS te kwantificeren, en infectiviteit detectie. De PP-productie omvat drie soorten plasmiden (Figuur 1). Het gag-Pol- gen, dat het retrovirus gag-Pol-eiwit codeert, werd gekloond uit een retrovirus pakkingsset en ingebracht in de pcdna 3,1 plasmide en benoemde Pcdna-gag-Pol. Het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP)-gen, dat groene fluorescerende eiwitten codeert, werd gekloond uit pTRE-EGFP-vector, ingebracht in het pcDNA 3,1 plasmide en riep pcDNA-GFP. Tijdens het klonen werd een sequentie van het verpakkings signaal (ψ) toegevoegd via een primer. De genen van HA en NA werden gekloond in een pVRC plasmide, respectievelijk pVRC-HA en pVRC-NA. De laatste plasmide codeert het fusie-eiwit en kan worden vervangen door elke andere fusie-eiwit van belang. Ons pseudo type-platform bevat twee glycoproteïne expressie plasmiden: pVRC-HA en pVRC-NA. Dit kan het onderzoek naar reassortiment tussen verschillende virusstammen in een BSL-2-instelling te vereenvoudigen.

<table><tbody><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>Effectieve viscositeitsreductie en verwijdering van nucleïnezuren uit eiwitoplossingen</td></tr><tr><td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Behandeld voor optimale celaanhechting Gesteriliseerd door middel van gammastraling en gecertificeerd nonpyrogeen Individuele alfanumerieke codes voor putidentificatie</td></tr><tr><td>Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Individuele alfanumerieke codes voor putidentificatie Behandeld voor optimale celaanhechting Gesteriliseerd door gamma-irradiatie</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified essential medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Een veelgebruikt basaal medium voor het ondersteunen van de groei van veel verschillende zoogdiercellen</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Excell</td><td>FND500</td><td>foetaal bovien serum dat uitstekende waarde kan bieden voor basiscelcultuur, speciale onderzoeken en specifieke analyses</td></tr><tr><td>Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)</td><td>Beckman coulter</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>Human alveolar adenocarcinoma A549 cells</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Een veelzijdig transfectiereagens dat effectief is gebleken voor het transfecteren van de breedste verscheidenheid aan adherente en suspensiecellijnen</td></tr><tr><td>Inverted fluorescent biological microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Snelle, gevoelige en nauwkeurige sonde-gebaseerde qPCR-detectie en kwantificering van doel-RNA-doelen.</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>Kan tot 14.000 RCF weerstaan RNase-/DNase-vrij Nonpyrogeen</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1,5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, gamma gesteriliseerd</td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0,45 &micro;m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>een verbeterd Minimum Essential Medium (MEM) dat een vermindering van de suppletie van foetaal bovien serum met minimaal 50% mogelijk maakt zonder verandering in celgroeisnelheid of morfologie. Opti-MEM I medium wordt ook aanbevolen voor gebruik met cationische lipide-transfectie reagensen, zoals Lipofectamine reagens.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>De antibiotica penicilline en streptomycine worden gebruikt om bacteriële besmetting van celculturen te voorkomen vanwege hun effectieve gecombineerde werking tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën.</td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Maximale RCF is 12.500 xg Temperatuurbereik van -80 &deg;C tot 120 &deg;C RNase-/DNase-vrij Sterieel</td></tr><tr><td>PP Centrifuge Tubes (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>een stabiele en zeer reactieve serine protease</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>Behandeld voor optimale celaanhechting Gesteriliseerd door gammastraling en gecertificeerd nonpyrogeen</td></tr><tr><td>TC-treated Culture Dish (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Trypsine uit bovien pancreas TPCK-behandeld, vrijwel zout-vrij, gelyofiliseerd poeder, &ge;10.000 BAEE eenheden/mg eiwit</td></tr><tr><td>TPCK-trypsine</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Deze vloeibare formulering van trypsine bevat EDTA en fenolrood. Gibco Trypsin-EDTA is gemaakt van trypsinepoeder, een bestraald mengsel van proteasen afgeleid van porcine pancreas. Vanwege zijn spijsverteringssterkte wordt trypsine veel gebruikt voor celafsplitsing, routine-celcultuurpassagering en primaire weefseldissociatie. De trypsineconcentratie die nodig is voor dissociatie varieert met celtype en experimentele vereisten.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

productie van hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene h5n1 en aviaire h7n9 virussen

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

De occasionele rechtstreekse overdracht van het hoogpathogene aviaire influenza A-virus H5N1 (HPAI H5N1) en H7N9 op de mens en hun letaliteit zijn ernstige volksgezondheidsproblemen en suggereren de mogelijkheid van een epidemie. Echter, ons moleculair begrip van het virus is rudimentair, en het is noodzakelijk om de biologische eigenschappen van haar envelop eiwitten te bestuderen als therapeutische doelen en om strategieën te ontwikkelen om infectie te beheersen. We ontwikkelden een solide virale pseudo getypte deeltje (PP) om het aviaire-influenzavirus te bestuderen, met inbegrip van de functionele analyse van zijn hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) envelop glycoproteïnen, de reassortimentkarakteristieken van de HAs en NAs, receptoren, tropismen, neutraliserende antilichamen, diagnose, infectiviteit, voor de toepassing van de ontwikkeling van geneesmiddelen en vaccin ontwerp. Hier beschrijven we een experimentele procedure om PPS vast te stellen met de envelop glycoproteïnen (HA, NA) van twee influenza A-stammen (HAPI H5N1 en 2013 Avian H7N9). Hun generatie is gebaseerd op de capaciteit van sommige virussen, zoals Murine leukemievirus (MLV), envelop glycoproteïnen in een PP opnemen. Daarnaast wordt ook gedetailleerd beschreven hoe deze PPS worden gekwantificeerd met RT-qPCR, en de infectiviteit detectie van native en niet-overeenkomende virus PPS, afhankelijk van de oorsprong van de HAs en NAs. Dit systeem is zeer flexibel en aanpasbaar en kan worden gebruikt voor het vaststellen van virale PPS met envelop glycoproteïnen die kunnen worden opgenomen in elk ander type omhuld virus. Dus, dit virale deeltjes platform kan worden gebruikt om wilde virussen te bestuderen in veel onderzoek onderzoeken.

Afhankelijk van de hierboven beschreven algemene procedure, hebben we 10 soorten PPS gegenereerd die twee groep HAs/NAs of VSV-G glycoproteïne of no-Envelope glycoproteïnen (weergegeven in tabel 1) combineren. Zeven van hen zijn besmettelijk. De PPS die de haven van no-Envelope glycoproteïne of enige haven NA geen infectiviteit hier vertonen. De productieprocedure voor influenza PP wordt in Figuur 1weergegeven. Transmissie elektronen micrografen van PPS (bijv. H5N1pp) worden...

Dit protocol beschrijft een experimenteel proces voor het produceren van hoogtiter infectieuze virale pseudo-getypte deeltjes (PP) met envelop glycoproteïnen uit twee influenza-A-stammen en hoe ze hun infectiviteit kunnen bepalen. Dit protocol is zeer aanpasbaar om PPS te ontwikkelen van elk ander type omhulde virussen met verschillende envelop glycoproteïnen.

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Deze techniek van het produceren van influenza virale PP en het bepalen van de infectiviteit kan het onderzoek van influenza virus in een BSL-2 stad te vereenvoudigen. We normaliseerden de PPS voor de infecties op basis van qRT-PCR gegevens van PPS. Twee glycoproteïne expressie plasmi zijn gecodeerd, die het onderzoek naar virus reassortment kan vereenvoudigen.Een dag na het zaaien van cellen, controleer de celmorfologie en dichtheid onder een omgekeerde lichtmicroscoop. Idealiter moet de cel ongeveer 85% samenvloeien bij transfectie. Vervang het medium door een milliliter serumvrije DMEM per put en leg de plaat terug in de couveuse.Verdun acht microliter van het transfectiereagensmiddel voor elke put van cellen tot een volume van 150 microliters met verlaagd serummedium. Meng de oplossing voorzichtig en laat het vijf minuten op kamertemperatuur zitten. Verdun ondertussen 2,5 microgram plasmide DNA tot 158 microliter met verlaagd serummedium.Combineer na de vijf minuten incubatie het verdunde DNA met verdund transfectiereagens, meng de oplossing voorzichtig en laat het 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg het DNA lipidecomplex toe aan de overeenkomstige putten met de cellen in serumvrij medium. Meng vervolgens de plaat voorzichtig door heen en weer te wiegen.Incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende vier tot zes uur. Na de incubatie, verwijder het medium en vervang het door twee milliliter DMEM per put. Dan incuberen voor nog eens 36 tot 48 uur.Zaad elk type vatbare cel op 10.000 cellen per put en een 96 putplaat. Laat de plaat dan 's nachts in een 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide incubator. Controleer op de derde dag na de doorfectie de kleur van het medium dat roze of licht oranje moet aansteken en onderzoek de cellen met een omgekeerde fluescente biologische microscoop onder de golflengte van 440 tot 460 nanometer.Oogst na 38 tot 48 uur na de transfectie de pseuotyped-deeltjes of PPS door ze door een 0,45 micrometer polyvinylidenefluoridemembraanfilter te laten gaan om celpuin te elimineren, verdeel ze vervolgens in kleine hoeveelheden en bewaar ze op min 80 graden Celsius. Om de PPS te kwantificeren, breng je 30 microliter van de gezuiverde virale deeltjes over naar een 1,5 microliter RNase-vrije buis en voeg je één microliter Benzonase Nuclease toe. Broed de buis een uur lang in op 37 graden Celsius om dna- en RNA-besmetting te elimineren.Na de incubatie bevries je het monster tot min 70 graden Celsius om de nuclease te actiefen en voeg twee microliters proteinase K.Incubate het mengsel gedurende 30 minuten toe om de envelopeiwitten te verteren en het CMV-GFP RNA vrij te geven. Dan inactief de Proteinase K op 100 graden Celsius gedurende drie minuten. Kwantificeer de PPS met kwantitatieve omgekeerde transcriptie RTPCR met behulp van de Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit in de primers en sondes die in het tekstmanuscript zijn opgegeven.Normaliseer de PPS tot vier keer 10 tot vijfde RNA-kopieën per milliliter. Voeg vervolgens TPCK-trypsine toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter in de PPS die H7N9 hemagglutinine herbergt. Broed de PPS een uur lang op 37 graden Celsius om de functionele subeenheden HA1 en HA2 te vormen.Meng de genormaliseerde PPS met DMEM medium op een een-op-een verhouding en breng de plaat met gevoelige cellen naar de bioveiligheidskast. Spoel de supernatant aan en was de cellen één keer met 100 microliter voorverwarmde PBS. Voeg 100 microliter PPS-DMEM mengsel in elke put, verdrievoudigen van de infectiviteit tests van elk type PPS aan een gevoelige cel lijn.Incubeer de plaat voor vier tot zes uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Aspirate vervolgens de supernatant en vervang deze door 100 microliters van DCM Incubaal de plaat voor nog eens 24 tot 36 uur voor infectiedetectie. Onze resultaten zijn PPS worden beschouwd als nu besmettelijk voor mensen.Dus noodzakelijke safe guard procedures worden aanbevolen om te nemen, zoals het dragen van een masker en het uitvoeren van de infectiviteit tests in een biosafety kast. Dit protocol werd gegenereerd om 10 soorten pseudo-getypte deeltjes of PPS te genereren met twee gegroepeerde hemaglutinine en neuraminidase vesiculaire stomatitis virus G glycoprotein of geen envelop glycoproteïnen. De PPS werden afgebeeld met transmissie elektronenmicroscopie en hun infectiviteit werden geëvalueerd in twee cellijnen, A549 en MDCK.In de PPS-groep die H5 herbergde, bedroeg de infectiviteit van H5N1, H5 plus N9 en H5 respectievelijk ongeveer 90%18% en 10%voor cellijn A549 en 40%5% en 5% voor MDCK. In de PPS-groep die H7 herbergde, bedroeg de infectiviteit van H7N9, H7 plus N1 en H7 respectievelijk ongeveer 10%7% en 1% voor cellijn A549 en 8%4% en 1% voor MDCK. De infectiviteit van het vesiculaire stomatitisvirus G glycoprotein PP was ongeveer 21% voor A549 en 16% voor MDCK-cellen.Terwijl de delta envelop glycoproteins PP toonde geen infectiviteit. Het is van cruciaal belang om te onthouden dat de PP-producent HEK-293T/17 cellen vormen aan de basis van deze procedure. Dus de optimale groei leert ons HEK-293T/17 cellen is het belangrijkst.Na deze procedure of een andere test, zoals L2-recipiënt, kan de omsluitende test worden uitgevoerd. Deze test kan bijna geven ontdoen van de biologische eigenaardigheden van de receptor voorkeur en het patroon zal onthullen het tropisme van de PPS. Aangezien ze namen de glycoproteins van influenza virus worden gekloond in twee plus max.HA en de NA-eiwitten kunnen afzonderlijk worden bestudeerd, zodat we er tussen terugkoppelen. De mutanten en de volwassen effecten kunnen worden onderzocht.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors — encoding different viral structural proteins — in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

The video showcases a method to create cold-adapted recombinant influenza viruses. It involves transfecting human cells with bi-directional plasmids, followed by incubation at lower temperature incubation to yield viruses suitable for vaccine production, characterized by reduced replication in warmer conditions.

Generating  Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

Er is een algemene kennisgebrek over hoe vaccins werken. Hier stellen we het gecombineerde gebruik van omgekeerde genetica en botmerg chimerische muizen voor om inzicht te krijgen in de vroege gastheer immuunreacties op vaccins met een speciale focus op dendritische cellen en T-cel immuniteit.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Beschrijven we een methode waarmee we identificeren kritische residuen nodig zijn voor de binding van de mens of lymfkliertest monoclonal antilichamen die gericht zijn op de virale hemagglutinine van influenza A-virussen. Het protocol kan worden aangepast aan andere oppervlakte glycoproteïnen van virus en hun overeenkomstige neutraliserende antilichamen.

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van pseudotyped deeltjes in een BSL-2 omgeving waarin de proteïne van de piek van de hoogpathogene virussen Midden-Oosten respiratoir syndroom en het ernstig acuut respiratoir syndroom coronaviruses. Deze pseudotyped deeltjes bevatten een luciferase verslaggever gen waardoor kwantificering van virus host doelcellen indienststelling.

Productie van Pseudotyped deeltjes te bestuderen van hoogpathogene Coronaviruses in een omgeving van bioveiligheid niveau 2

Hier beschrijven we een protocol voor pseudovirusverpakking en het meten van antilichaamneutraliserende activiteit.

Bereiding van pseudo-getypeerde H5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Een methode om te bewaren, op te sporen en de volgorde RNA virussen van aviaire influenza werd gevalideerd en uitgebreid met behulp van natuurlijke fecesmonsters van vogels. Deze techniek verwijdert de noodzaak van het handhaven van een koelketen en behandeling van besmettelijke virussen en kan worden toegepast in een 96-wells high-throughput setup.

Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Leer hoe je hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes produceert met envelopglycoproteïnen van H5N1 en H7N9. Deze methode evalueert infectiviteit via qRT-PCR in BSL-2 omgeving.

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen (Video) | JoVE Journal

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

Meer video's verkennen