Karakteriseren exon overslaan efficiëntie in DMD patiënt monsters in klinische proeven van antisense oligonucleotiden
7 mei 2020
Hier presenteren we de moleculaire karakterisering van dystrofine 38 expressie met behulp van Sanger sequencing, RT-PCR, en westerse blotting in de klinische studie.
Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methodologie voor het voorbereiden en hanteren van spierweefsel in preklinische omgevingen en klinische studies, wat belangrijk is voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten binnen het DMD-veld. De technieken zijn relevant voor exon het overslaan van try-outs voor DMD. En het belangrijkste voordeel is dat ze goed ingeburgerd en reproduceerbaar zijn als ze collectief worden uitgevoerd.
Deze technieken zijn voornamelijk gericht op exon overslaan in DMD, maar met een verandering van primers, dezelfde technieken kunnen worden toegepast op andere ziekten behandeld met splicing therapieën. Deze methoden kunnen worden gebruikt om exon overslaan efficiëntie zowel en RNA en eiwit te bereiken. Om een monster voor te bereiden voor analyse, meng eerst gelijke volumes tragacanth gom en water tot het tandvlees zacht en plakkerig wordt.
Laad dit mengsel in 25 milliliter spuiten en werp 0,5 tot een centimeter gom op individuele kurkschijven. Label de schijven aan de andere kant en plaats een container met isopentane in vloeibare stikstof totdat een deel van de vloeistof bevriest. Plaats elk monster in de tragacanth gom op de schijven met een longitudinale as van elke spier loodrecht op de kurk.
Plaats gom rond aan de bodem van elke spier om te helpen de spier op zijn plaats te houden, en gebruik pincet om de exemplaren in de koude isopentane te bevriezen. Verplaats de exemplaren continu gedurende een minuut of tot ze volledig bevroren zijn voordat ze tijdelijk op droogijs worden gezet. Plaats vervolgens de exemplaren in glazen flesjes voor 80 graden Celsius opslag.
Om het bevroren spierweefsel voor analyse te snijden, stel een cryostat in op een werktemperatuur van 25 graden Celsius en monteer je het spierblok op de houder. Trim het weefselblok tot vlakke delen zijn bereikt. Voor omgekeerde transcriptase PCR en Western blot analyse, verkrijgen 10 micrometer dikke plakjes.
Voor immunohistochemische analyse, verkrijg zes tot acht micrometer dikke plakjes, en voor hematoxylin en eosine kleuring, verkrijgen 10 tot 12 micrometer dikke plakjes. Na de overname, plaats de gesneden secties in twee milliliter buizen. Bewaar de monsters voor PCR en western blotting op 80 graden Celsius.
Hier, microchip elektroforese systeem, een gel beelden van omgekeerde transcriptase PCR reacties, en de volgorde resultaten van de overgeslagen band van twee patiënten voor en na de behandeling met een antisense oligonucleotide in een dosis escalatie fase een studie worden getoond. Beide patiënten herbergen verwijderingen. Zoals verwacht, voor de behandeling, beide patiënten toonde geen overslaan en alleen een niet-overgeslagen band kon worden gevisualiseerd.
Na 12 weken behandeling werd een duidelijke overgeslagen onderband gevisualiseerd voor de tweede patiënt, maar het was nog steeds moeilijk om een overgeslagen product voor de eerste patiënt op te sporen. De sequencing resultaten toonden een samenvoeging van exons 47 en 54 voor de tweede patiënt, en exons, 44 en 54 voor de eerste patiënt. Om het overgeslagen percentage te berekenen, werd de kiesconcentratie voor de overgeslagen band gedeeld door de overgeslagen en niet-gespeende banden.
Zoals verwacht, geen dystrofie band werd gedetecteerd door westerse vlek voor de behandeling. Na de behandeling werd een band gedetecteerd van de tweede patiënt met een lager moleculair gewicht in vergelijking met die waargenomen in de gezonde controle. De eerste patiënt vertoonde echter geen detecteerbare niveaus van dystrofie na de behandeling.
Het is van cruciaal belang om het spierweefsel correct te behandelen en elk monster op de tragacanth gom op consistente manier te plaatsen. De weefselsecties kunnen op verschillende manieren worden geanalyseerd, waaronder kunstmatige tot PCR, digitale PCR, Westerse vlek, immunohistochemie en met verschillende soorten omics. Deze technieken kunnen worden versneld, de ontwikkeling, extra exon overslaan drugs gericht op verschillende exonen, en kan worden toegepast op de ontwikkeling van virale gebaseerd en opnieuw in het bewerken voor DMD.
Overzicht
Deze studie presenteert een gestandaardiseerde methodologie voor het prepareren en behandelen van spierweefsel in klinische studies met betrekking tot Duchenne spierdystrofie (DMD). De focus ligt op exon-skipping-technieken, die essentieel zijn voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Klinische studies
Achtergrond
- Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige spierziekte die leidt tot spierafbraak.
- Exon skipping is een veelbelovende therapeutische benadering voor DMD.
- Betrouwbare weefselverwerking is essentieel voor accurate experimentele resultaten.
- Gestandaardiseerde methoden kunnen de reproduceerbaarheid in onderzoek verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol op te stellen voor de preparatie van spierweefsel.
- Om exon-skipping-proeven voor DMD te faciliteren.
- Om een kader te bieden dat toepasbaar is op andere ziekten die worden behandeld met splicing-therapieën.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van spierweefsel met behulp van tragacanthgom en isopentaan.
- Invriezen en doorsnijden van spiermonsters voor analyse.
- Reverse transcriptase PCR en Western blotting voor het detecteren van dystrofine-expressie.
- Sequencing om de efficiëntie van exon-skipping te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van overgeslagen banden bij behandelde patiënten.
- Detectie van dystrofine bij één patiënt na de behandeling.
- Variabiliteit in de respons op de behandeling tussen patiënten.
- Benadrukking van het belang van consistente weefselverwerking voor accurate resultaten.
Conclusies
- Gestandaardiseerde methoden zijn essentieel voor de verdere ontwikkeling van DMD-therapieën.
- Exon skipping vertoont potentie, maar vereist verdere optimalisatie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methoden voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol stelt een gestandaardiseerde workflow vast voor het beoordelen van de efficiëntie van exon-skipping in monsters van DMD-patiënten, wat direct bijdraagt aan de validatie van targets bij de ontwikkeling van antisense-oligonucleotiden. Door kwantitatieve meting van moleculaire herstel mogelijk te maken, biedt het mechanistische risicoreductie voor therapieën gericht op exon 53-skipping, zoals viltolarsen. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de translatie van preklinisch naar klinisch onderzoek door biochemische resultaten te koppelen aan het therapeutische mechanisme.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar exon-skipping gemedieerd door antisense-oligonucleotiden als therapeutische hypothese in monsters afkomstig van patiënten.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare methoden voor Sanger-sequencing, RT-PCR en Western blot om on-target moleculaire activiteit te bevestigen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve ratio's van gesprongen-ten-opzichte-van-totale banden voor dosis-responsbeoordeling van de efficiëntie van exon-skipping.
- Operationele waarde: Standaardiseert protocollen voor weefselpreparatie en coupesnijden om de reproduceerbaarheid van de assay te waarborgen over preklinische en klinische monsterreeksen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt analyse van ziekterelevante systemen door de herstel van dystrofine in daadwerkelijke spierbiopten van patiënten te karakteriseren.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door gebruik te maken van consistente moleculaire read-outs over verschillende modelsystemen heen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt moleculaire bevestiging van het mechanisme vóór functionele efficiëntietests.
- Ontdekkingsbiologie: Bevestigt on-target exon-splicingcorrectie in patiëntmonsters, wat bijdraagt aan de hypothesevalidatie voor antisense-oligonucleotiden.
- Screening: Levert kwantitatieve percentages van exon-skipping via gel-imaging en sequencing, waardoor een vergelijking tussen verbindingen mogelijk is.
- Analytiek: Biedt kwantificering van de geskippede band op basis van molaire concentratie voor comparatieve analyse tussen doses en patiënten.
- Translationeel onderzoek: Koppelt moleculair exon-skipping aan de detectie van dystrofine-eiwit, waardoor de brug wordt geslagen tussen het mechanisme op RNA-niveau en het resultaat op eiwitniveau.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een herbruikbaar kader voor weefselverwerking en -analyse dat toepasbaar is op meerdere exon-targets en splicingtherapieën.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie door directe visualisatie van exon-skipping en dystrofineherstel in menselijk weefsel.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde inbedding met tragacanthgom en cryosectie garanderen monsterconsistentie en verminderen variabiliteit.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door moleculaire bewijzen van target-engagement te leveren voorafgaand aan functionele eindpunten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van antisense-oligonucleotiden mogelijk op basis van de efficiëntie van exon-skipping in relevante patiëntgenotypes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculairbiologische technieken, waaronder RT-PCR, Western blotting en Sanger-sequencing.
- Afhankelijk van cryostaatapparatuur voor weefselcoupes en vloeibare stikstof/isopentaan voor snelvriezen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor weefselverwerking om de integriteit van monsters over verschillende locaties of tijdstippen te behouden.
- Moet rekening houden met variabiliteit in patiëntspecifieke mutaties bij het ontwerpen van primers voor de detectie van exon-skipping.
- Beperkt door het semi-kwantitatieve karakter van gel-gebaseerde methoden zonder validatie via digitale PCR of capillaire elektroforese.
