Name: De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Leer de cryoAPEX-methode voor lokalisatie van membraaneiwitten met behoud van celultrastructuur via elektronenmicroscopie. Deze techniek helpt onderzoekers virale replicatiemechanismen in HEK293-cellen bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het hier beschreven protocol komt voort uit een publicatie van Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dit werk wordt ondersteund door subsidies R01GM10092 (aan S.M.) en AI081077 (R.V.S.) van de National Institutes of Health, CTSI-106564 (aan S.M.) van Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, en PI4D-209263 (naar S.M.) van het Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

1. Celcultuur en transfection
<ol><li>Zaad HEK-293T cellen met een diameter van 60 mm of grotere weefselkweekschotel en groeien tot 60%-90% samenvloeiing in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Transfect-cellen met APEX2-gelabelde zoogdierexpressieplasmiden met transfection reagens (zie Tabel met materialen)volgens de aanwijzingen van de fabrikant.</li>
	<li>Bij 12-15 uur na het transfectie, wascellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder cellen uit de schotel door zacht wassen met PBS. Een dissociatiereagens zoals trypsine kan worden gebruikt indien nodig voor een bepaald celtype. Centrifugeer bij 500 x g voor 5 min om een pellet tevormen.
</li>
</ol>2. Chemische fixatie en peroxidasereactie
<ol><li>Verwijder voorzichtig de supernatant en brep de pellet opnieuw in 2 mL van 2% glutaraldehyde (v/v) in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer, pH 7.4, bij kamertemperatuur. Plaats monster op ijs en uitbroed gedurende 30 min. Pellet het monster op 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Houd vanaf dit punt tot stap 2.3.3 het monster en de oplossingen op ijs en voer centrifugeren bij 4 °C. LET OP: Zowel glutaraldehyde als natriumcacodylaatbuffer (met arseen) zijn giftig. Tijdens het hanteren moeten goede veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt. Oplossingen die glutaraldehyde en/of natriumcacodylaatbuffer bevatten, moeten als gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd.</li>
	<li>Was de pellet 3x gedurende 5 min met 2 mL natriumcacodylaatbuffer. Voor deze en latere wasbeurten, voorzichtig opnieuw opschorten van de cel pellet in de vereiste oplossing, dan centrifugeeren voor 5 min op 500 x g en zorgvuldig verwijderen en gooi de supernatant. Zorg moet worden genomen met de herhaalde pelleting en resuspension stappen, om monsterverlies te minimaliseren.</li>
	<li>Voer de peroxidasereactie uit<ol>
<li>Bereid een verse oplossing voor die 1 mg/mL van 3,3%-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) bevat in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Los de DAB op door 5-10 min krachtig vortexen. LET OP: DAB is giftig en een potentieel kankerverwekkend en moet worden behandeld met de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Oplossingen die DAB bevatten, moeten worden behandeld als gevaarlijk chemisch afval.</li>
		<li>Was pellet door resuspending in 3 mL DAB-oplossing gevolgd door pelleting op 500 x g voor 5 min.</li>
		<li>Resuspend de pellet in 3 mL DAB oplossing waaraan waterstofperoxide is toegevoegd om een definitieve concentratie van 5,88 mM te bereiken. Incubeer voor 30 min op kamer temp. De pellet wordt zichtbaar bruingekleurd, wat de aanwezigheid van het onoplosbare DAB-reactieproduct aangeeft. OPMERKING: De DAB-incubatietijd moet mogelijk voor elk monster worden geoptimaliseerd. De kleurverandering kan worden gecontroleerd op de lichtmicroscoop. In onze ervaring is een incubatie van 15-45 min voldoende voor de meeste eiwitten. Waterstofperoxide moet worden verkregen uit een vers geopende fles of een die goed is bewaard na het openen.</li>
		<li>Pellet de cellen, dan wassen 2x voor 5 min met 0,1 M natrium cacodylaat buffer, gevolgd door een wassen in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) of cel media naar keuze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schorsde de celpellet in 500 μL van een cryoprotectivistische oplossing van DMEM (of andere celmedia naar keuze) met 10% foetaal runderserum en 15% runderserumalbumine. Pellet weer, licht verhogen van de centrifuge snelheid van 500 x g indien nodig om een pellet te bereiken in de dikke cryo-protectant oplossing. Gooi de meerderheid van de supernatant weg, zodat er voldoende vloeistof overblijft, zodat de pellet niet uitdroogt. Transport de celpellet naar het hogedrukvriesinstrument.</li>
</ol>3. Hogedrukbevriezing
<ol><li>Vul het hogedrukvriesreservoir met vloeibare stikstof (LN2)en start de pomp om de monsterkamer te vullen met LN2. LET OP: Gebruik de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met vloeibare stikstof. OPMERKING: Deze stappen zijn specifiek voor de Leica EMPACT2 hogedrukvriezer.</li>
	<li>Wick weg alle resterende vloeistof uit de cel pellet met behulp van de hoek van een laboratorium doekje of papieren handdoek. Genoeg vloeistof moet blijven dat de pellet vormt een pasta vergelijkbaar in consistentie met tandpasta. Het moet dun genoeg zijn om te worden aangezogen in een 20 μL pipet tip.</li>
	<li>Aanzuigen 2-3 μL van de celpellet en deponeren op een membraan drager. Vul de put van de membraandrager volledig, zodat de oppervlaktespanning een lichte koepel bovenop creëert, maar de vloeistof lekt niet uit de put. Er mogen geen luchtbellen aanwezig zijn.</li>
	<li>Schuif de membraandrager in de cartridge en zet deze veilig. Plaats de cartridge in de HPF-machine die is voorbereid en geprimed, en druk op Start om te bevriezen.</li>
	<li>Inspecteer de temperatuur vs. tijd en druk grafieken om te controleren of de druk bereikt 2100 bar en de temperatuur bereikt -196 °C binnen 200 ms, en beide parameters stabiel gebleven voor de 600 ms van de meting.</li>
	<li>Herhaal stap 3.3 tot 3,5 totdat de celpellet is gebruikt of het gewenste aantal monsters is ingevroren.</li>
	<li>Houd de cartridges ondergedompeld in LN2,verwijder elke membraandrager van de cartridge, plaats in een plastic capsule en plaats de plastic capsule in een cryo-flacon vol LN2. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. De cryo-flesjes met monsters kunnen worden opgeslagen in een LN2 dewar in cryo-canes of cryo-boxen.</li>
</ol>4. Substitutie bevriezen
LET OP: Gebruik de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met vloeibare stikstof. Bovendien, veel van de chemische stoffen gebruikt in stap 4 zijn giftig, met inbegrip van tanninezuur, osmium tetroxide, en uranyl acetaat. Deze chemische stoffen moeten volgens de juiste veiligheidsprocedures worden behandeld en als gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd.
<ol><li>Vul de geautomatiseerde freeze substitutie-eenheid met LN2. Breng de temperatuur op -90 °C.</li>
	<li>Bereid FS Mix 1 voor en begin FS.<ol>
<li>Bereid in een chemische kap een oplossing van 0,2% tanninezuur (w/v) en 5% DI-water in aceton en aliquot 1 mL per monster in cryo-flacons. Plaats in LN2 om te bevriezen.</li>
		<li>Plaats de FS Mix 1 flacons en de cryo-flacons met de bevroren celpellets in de monsterkamer van de FS-eenheid. Breng de binnenste capsule met de membraandrager van de LN2 flacon over in de bijbehorende flacon met FS Mix 1.</li>
		<li>Start een FS-protocol met de eerste stap is 24 uur bij -90°C. Na de 24 uur, pauzeer de FS, en was de monsters 3x gedurende 5 minuten met aceton die is afgekoeld tot -90 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid FS Mix 2 en voltooi FS LET OP: Osmium tetroxide is een zeer giftige en oxiderende chemische stof die alleen mag worden behandeld door getrainde individuen volgens vastgestelde veiligheidsprotocollen. Protocollen voor de opslag en verwijdering van osmiumhoudende oplossingen moeten worden gevolgd, evenals de etikettering van laboratoriumgebieden waar osmium tetroxide wordt gebruikt. Osmium tetroxide moet worden behandeld in een chemische kap met persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder oogbescherming, een labjas die volledige armbescherming biedt, dubbele Nitrilhandschoenen en een optionele ademhalingsmasker.<ol>
<li>In een chemische kap, bereiden een oplossing van 1% osmium tetroxide, 0,2% uranyl acetaat, en 5% DI water in aceton. Aliquot 1 mL per monster in cryo-flesjes en plaats in LN2 om te bevriezen. OPMERKING: Stockoplossingen van tanninezuur (10% w/v in aceton), osmium tetroxide (10% w/v in aceton) en uranylacetaat (8% w/v in methanol) kunnen worden bereid en opgeslagen in cryo-flesjes in een LN 2-dewar voor het gemak van bereiding van FS Mixen.</li>
		<li>Plaats de cryo-flacons met FS Mix 2 in de FS-unit en breng de capsules van de derde acetonwasin de FS Mix 2 flacons. Incubeer in FS Mix 2 voor 72 uur bij -90 °C, gevolgd door geleidelijke opwarming tot 0 °C over 12-18 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Houd de temperatuur op 0 °C en was 3x gedurende 30 min met voorgekoelde aceton uit een vers geopende fles.</li>
</ol>5. Hars Infiltratie en inbedding
LET OP: De hars die hier wordt gebruikt (zie Tabel met materialen)is giftig voorafgaand aan polymerisatie en moet worden behandeld met de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Ongepolymeriseerde hars moet worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval.
<ol><li>Infiltreren in de monsters met toenemende concentraties hars opgelost in aceton uit een nieuw geopende fles. Bereid een mengsel van harscomponenten A, B en D in een plastic beker glas volgens de aanwijzingen van de fabrikant en bebroed monsters in de volgende harsconcentraties: 2%, 4%, en 8% voor 2 uur elk bij 0 °C. Incubeer in 15%, 30%, 60%, 90%, en 100% hars voor 4 uur elk bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 4 uur in een mengsel van componenten A, B, C en D.</li>
	<li>Plaats de membraandragers met celpelletzijde omhoog in platte inbeddingsmallen en vul met hars (A, B, C en D). Papieren etiketten voor de monsters kunnen worden toegevoegd aan de putten op dit moment.</li>
	<li>Polymeriseren in een oven bij 60 °C gedurende 24-36 uur. OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na de polymerisatie.</li>
	<li>Verwijder de blokken uit de mal en laat afkoelen. Om de membraandrager te verwijderen, plaats u eerst het monster in de verticale klem van de ultramicrotoom waar het met vergroting kan worden gevisualiseerd. Scheid de membraandrager van het blok door een combinatie van deppen de vloeibare stikstof op de membraandrager om het metaal van het plastic te scheiden, en gebruik een scheermesje om de hars rond de membraandrager weg te snijden. Wanneer gescheiden, voorzichtig weg te tillen het membraan drager het verlaten van de cel pellet koepel op het gezicht van het blok.</li>
	<li>Plaats het blok met de blootgestelde celpellet naar boven gericht in een platte inbedding mal die iets dieper is dan de eerste mal, en vul met hars. Polymeriseren bij 60 °C voor 24-36 uur. OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na de polymerisatie.</li>
</ol>6.
<ol><li>Trim het blok rond de celpellet met behulp van een scheermesje. Plaats vervolgens het blok in de monsterklem op de sectioning arm van een ultramicrotome. Met behulp van een glas of diamant mes, trim het blok in een trapeziumvormige vorm dicht rond de cel pellet.</li>
	<li>Verkrijg 90 nm ultradunne delen van de celpellet met een glas of diamantmes.</li>
	<li>Een lint met secties op een TEM-raster ophalen. Met formvar-gecoate koperen sleufroosters (1 x 2 mm2-sleuf) zijn handig voor beeldvormingsdeelingen. Droog het raster door de rand op een stuk filterpapier te smeten en op te slaan in een TEM-rasteropslagbox. OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na sectie.</li>
</ol>7. TEM-beeldvorming
<ol><li>Monteer het raster op de TEM-houder en plaats in de microscoop. We gebruiken routinematig een Tecnai T12 bij 80 kV voor het screenen van cryoAPEX monsters. Verwerf afbeeldingen van cellen en subcellulaire structuren van belang met APEX2 labeling.</li>
	<li>Verkrijg indien gewenst extra membraancontrast door het gebruik van lood na het vlekken. Zie figuur 2 voor vergelijking van niet-post-gekleurde monsters(figuur 2I-K) en lood post-gekleurde monsters(figuur 2A–H).<ol>
<li>Drijf droge roosters sectie-kant naar beneden op een druppel verdunde natriumchloride oplossing (~ 1,5 mM), 2x voor 1 min per stuk, dan 1x voor 10 min.</li>
		<li>Float roosters op een druppel van sato's lood oplossing voor 1 min. Wassen door te zweven op natriumchloride oplossing 3x voor 1 min, dan op DI water 3x voor 1 min. Blot overtollige vloeistof uit de roosters en op te slaan in een netdoos. LET OP: Lood is een giftige chemische stof en moet worden behandeld met de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Oplossingen die lood bevatten, moeten worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Afbeelding post-gekleurdmonsters op de TEM. OPMERKING: In de traditionele monstervoorbereiding voor TEM wordt de loodcontrasterende stap uitgevoerd voordat TEM-beeldvorming wordt uitgevoerd. Het wordt echter aanbevolen dat voor cryoAPEX-monsters eerst beeldvorming wordt uitgevoerd op niet-contrasterende monsters. Dit zorgt ervoor dat het signaal van de tag gemakkelijk kan worden geplaatst door het sterke contrast met de meer licht gekleurde cellulaire structuren. Voor veel monsters is geen verdere kleuring nodig; als echter extra membraancontrast gewenst is, kan lood na kleuring worden uitgevoerd (stap 7.2) en wordt het monster opnieuw weergegeven.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Het hier gepresenteerde cryoAPEX-protocol biedt een robuuste methode om de lokalisatie van membraaneiwitten in de cellulaire omgeving te karakteriseren. Niet alleen zorgt het gebruik van een genetisch gecodeerde APEX2-tag voor nauwkeurige lokalisatie van een eiwit van belang, maar het gebruik van cryofixatie en uitdroging bij lage temperaturen zorgt voor een uitstekende bewaring en kleuring van de omringende cellulaire ultrastructuur. Gecombineerd zijn deze benaderingen een krachtig hulpmiddel voor het lokaliseren van ee...

Biologische studies omvatten vaak vragen over het oplossen van subcellulaire eiwitlokalisatie in cellen en organellen. Immunofluorescentie microscopie biedt een nuttige lage resolutie weergave van eiwitlokalisatie, en de recente vooruitgang in super-resolutie beeldvorming duwen de grenzen van de resolutie voor fluorescerende gelabelde eiwitten1,2,3. Echter, elektronenmicroscopie (EM) blijft de gouden standaard voor beeldvorming hoge resolutie cellulaire ultrastructuur, hoewel de etikettering van eiwitten is een uitdaging.
Historisch gezien zijn verschillende EM-methoden gebruikt om vragen van ultrastructurele eiwitlokalisatie te benaderen. Een van de meest gebruikte methoden is immuno-elektronenmicroscopie (IEM), waarbij antigeenspecifieke primaire antilichamen worden gebruikt om het eiwit van belang te detecteren. EM-signaal wordt gegenereerd door de toepassing van secundaire antilichamen die zijn vervoegd met elektronendichte deeltjes, meestal colloïdaal goud4,5. Afwisselend kunnen antilichamen die zijn vervoegd met enzymen zoals mierikswortel peroxidase (HRP) worden gebruikt om een elektronendicht neerslag te produceren6,7,8. Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor IEM, de zogenaamde pre-embedding en post-embeding labeling. Bij pre-inbedding van IEM worden antilichamen rechtstreeks in cellen geïntroduceerd, wat lichte fixatie en permeabilisatie van de cellen9,10,11noodzakelijk maakt. Beide stappen kunnen ultrastructuur12,13beschadigen. De ontwikkeling van aanzienlijk kleinere antilichamen bestaande uit een antilichaam Fab fragment vervoegd met 1,4 nm nanogoud maakt het mogelijk zeer zachte permeabilisatie voorwaarden te gebruiken; nanogold is echter te klein voor directe visualisatie onder TEM en vereist extra verbeteringsstappen om zichtbaar te worden14,15,16. Bij post-inbedding IEM worden antilichamen aangebracht op dunne delen van cellen die volledig zijn verwerkt door fixatie, uitdroging en inbedding in hars17. Hoewel deze aanpak de permeabilisatiestap vermijdt, is het behoud van de epitoop van belang tijdens de steekproefvoorbereiding een uitdaging18,19,20. De Tokuyasu-methode van lichtfixatie gevolgd door bevriezing, cryo-sectioning en antilichaamdetectie zorgt voor een verbeterde epitoopconservering21,22. De technische vereisten van cryo-ultramicrotomie en het suboptimale contrast in de cel zijn echter nadelen23.
Het gebruik van genetisch gecodeerde tags elimineert veel van de moeilijkheden van IEM in verband met de detectie van het eiwit van belang. Er zijn verschillende tags beschikbaar, waaronder HRP, ferritine, ReAsH, miniSOG en metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Elk van deze heeft voordelen ten opzichte van eerdere methoden, maar elk heeft ook nadelen voorkomen wijdverbreid gebruik. Deze nadelen variëren van inactiviteit van HRP in de cytosol tot de grote omvang van de ferritinetag, lichtgevoeligheid van ReAsH en kleine omvang en gebrek aan compatibiliteit met cellulaire vlekken van metallothionein. Onlangs is een eiwit afkomstig van ascorbaat peroxidase ontworpen als een EM-tag, genaamd APEX233,34. Als peroxidase kan APEX2 de oxidatie van 3,3' diaminobenzidine (DAB) katalyseren, waardoor een neerslag ontstaat dat reageert met osmium tetroxide om lokaal EM-contrast te bieden met minimale diffusie van het eiwit van belang (minder dan 25 nm)33,35. In tegenstelling tot traditionele HRP-gebaseerde methoden is APEX2 uiterst stabiel en blijft het actief in alle cellulaire compartimenten33. Monsters kunnen voor TEM worden verwerkt met behulp van traditionele EM-monsterkleuring en methoden die een goede visualisatie van de omringende structuren mogelijk maken33,34,36. Door zijn kleine omvang, stabiliteit en veelzijdigheid is APEX2 uitgegroeid tot een EM-tag met een groot potentieel.
Veel van de hierboven besproken benaderingen kunnen of zijn nog niet gecombineerd met de huidige stand van de techniek in ultrastructurele conservering, cryofixatie en lage temperatuur vriessubstitutie. Zo hebben ze last van een gebrek aan membraanbehoud en/of celkleuring om nauwkeurige eiwitlokalisatie te bepalen. Dit beperkt noodzakelijkerwijs de resolutie en interpretatie van de gegevens die kunnen worden verkregen. Cryofixatie door hoge druk bevriezing (HPF) omvat een snelle bevriezing van monsters in vloeibare stikstof bij een hoge druk (~ 2.100 bar), die vitrificatie veroorzaakt in plaats van kristallisatie van waterige monsters, waardoor cellen in een bijna-inheemse toestand37,38,39. HPF wordt gevolgd door vriessubstitutie (FS), een lage temperatuur (-90 °C) uitdroging in aceton in combinatie met incubatie met typische EM-vlekken zoals osmium tetroxide en uranylacetaat. HPF en FS samen bieden een duidelijk voordeel ten opzichte van de traditionele chemische fixatie (een langer proces dat kan leiden tot artefacten) en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur of op ijs (wat kan leiden tot extractie van lipiden en suikers), en dus wenselijk zijn om te combineren met de beste EM-tags voor eiwitdetectie.
Een van de redenen dat HPF/FS niet is gecombineerd met APEX2-etikettering is dat lichte chemische fixatie een voorwaarde is voor de peroxidasereactie, waardoor de verspreiding van het DAB-reactieproduct wordt beperkt. In APEX2-studies tot nu toe worden fixatie en peroxidasereactie gevolgd door traditionele EM-methoden voor kleuring en alcoholuitdroging33,36. Er is echter aangetoond dat het volgen van chemische fixatie met HPF/FS een duidelijk voordeel biedt bij het behoud ten opzichte van traditionele chemische fixatie en alcoholuitdroging alleenal 40. Het verlies van ultrastructurele integriteit gezien in de traditionele TEM monsters lijkt minder verbonden met fixatie dan met uitdroging, die meestal wordt gedaan met behulp van alcohol bij kamertemperatuur of op ijs, en kan leiden tot extractie van lipiden en suikers40,41. Om de cryoAPEX-methode te ontwikkelen, veronderstelden we dat chemische fixatie en peroxidasereactie, gevolgd door HPF en FS, een optimaal resultaat zou opleveren in termen van ultrastructurele conservering.
Hier presenteren we het cryoAPEX-protocol, dat APEX2-tagging combineert met cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden(figuur 1). Dit eenvoudige protocol bestaat uit transfection van een APEX2-gelabeld eiwit van belang, chemische fixatie van cellen, en de peroxidase reactie. HPF en FS worden vervolgens uitgevoerd, gevolgd door typische hars inbedding en dunne delen. TEM imaging onthult een uitstekende bewaring van ultrastructuur met behulp van deze methode. Daarnaast werden subcellulaire lokalisatie met hoge resolutie en ruimtelijke verdeling van een endoplasmische reticulum (ER) luminaaleiwit waargenomen. Deze methode is op grote schaal nuttig voor de detectie van membraan eiwitlokalisatie binnen cellen voor elektronenmicroscopie analyse. In onze handen, heeft de methode met succes gewerkt voor een verscheidenheid van cellijnen geteeld in weefselcultuur, met inbegrip van HEK-293T (menselijke embryonale nier), HeLa (menselijke baarmoederhalskanker), Cos7 (Afrikaanse groene aap nier fibroblast), en BHK (baby hamster nier). Gedetailleerde instructies worden hieronder beschreven met behulp van HEK-293T cellen.

<table><tbody><tr><td>3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acetone (Glass Distilled)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knifemaker</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Gearchiveerd product Vervangen door Leica EM ICE</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide, crystalline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Tannic Acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate Dihydrate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

de cryoapex-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Belangrijke cellulaire gebeurtenissen zoals signaaltransductie en membraanhandel vertrouwen op de juiste eiwitlocatie in cellulaire compartimenten. Inzicht in nauwkeurige subcellulaire lokalisatie van eiwitten is dus belangrijk voor het beantwoorden van veel biologische vragen. De zoektocht naar een robuust label om eiwitlokalisatie te identificeren in combinatie met voldoende cellulaire conservering en kleuring is historisch uitdagend. Recente vooruitgang in elektronenmicroscopie (EM) beeldvorming heeft geleid tot de ontwikkeling van vele methoden en strategieën om cellulaire conservering te verhogen en het label doel eiwitten. Een relatief nieuwe peroxidase-gebaseerde genetische tag, APEX2, is een veelbelovende leider in kloonbare EM-actieve tags. Monstervoorbereiding voor transmissieelektronenmicroscopie (TEM) is de laatste jaren ook gevorderd met de komst van cryofixatie door hoge drukbevriezing (HPF) en uitdroging en vlekken bij lage temperaturen via vriessubstitutie (FS). HPF en FS bieden een uitstekende bewaring van cellulaire ultrastructuur voor TEM-beeldvorming, op de tweede plaats om cryo-beeldvorming van glasachtige monsters te direct. Hier presenteren we een protocol voor de cryoAPEX methode, die het gebruik van de APEX2 tag combineert met HPF en FS. In dit protocol wordt een eiwit van belang getagd met APEX2, gevolgd door chemische fixatie en de peroxidase reactie. In plaats van traditionele vlekken en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur, het monster is cryofixed en ondergaat uitdroging en vlekken bij lage temperatuur via FS. Met behulp van cryoAPEX kan niet alleen een eiwit van belang worden geïdentificeerd in subcellulaire compartimenten, maar ook aanvullende informatie kan worden opgelost met betrekking tot de topologie binnen een structureel bewaard membraan. We tonen aan dat deze methode een hoge resolutie kan bieden om eiwitverdelingspatronen binnen een organellelumen te ontcijferen en om de compartimentering van een eiwit binnen één organelle te onderscheiden in de nabijheid van andere niet-gelabelde organellen. Verder is cryoAPEX procedureel eenvoudig en vatbaar voor cellen die in de weefselkweek worden gekweekt. Het is technisch niet uitdagender dan typische cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden. CryoAPEX is op grote schaal toepasbaar voor TEM-analyse van membraaneiwit dat genetisch kan worden getagd.

Om de ultrastructurele conservering met behulp van de cryoAPEX-methode te vergelijken met traditionele fixatie en uitdroging, hebben we monsters gemaakt waarin een endoplasmatisch reticulum membraan (ERM; ER membraan) peptide werd gelabeld met APEX2 en omgezet in HEK-293T cellen. ERM-APEX2 lokaliseert het cytoplasmatische gezicht van de ER en hermodelleert de ER-structuur tot morfologische verschillende structuren die bekend staan als georganiseerde gladde ER (OSER)34,...

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Deze methode combineert de mogelijkheid om vlekken voor een membraan eiwit, terwijl ook het behoud van membraan integriteit en subcellulaire architectuur. Dus het is echt krachtig voor het precies lokaliseren van een membraan geassocieerd eiwit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het gebruik van een robuuste genetisch kloonbare tag, APEX2, combineert met state-of-the-art methoden in cellulaire bewaring voor elektronenmicroscopie, inclusief cryofixatie en vriessubstitutie.Samen maken deze nauwkeurige eiwitlokalisatie mogelijk in een goed bewaarde cel. Dit protocol kan worden gebruikt om mechanismen te ontleden waarmee virussen zich in de hostcel vermenigvuldigen. Virussen zullen vaak kapen gastheer eiwitten tijdens hun infectie regeling.Virussen zijn de kleine genomen, die ze gebruiken om te repliceren in deze gastheercellen. Onlangs hebben we in staat geweest om in ongepubliceerde gegevens, label deze eiwitten met behulp van deze technologie om te begrijpen hoe virussen repliceren. Deze techniek bleek echt kritisch in een recente collaboratieve studie over een bacteriële toxine dat golgi afbraak veroorzaakt.Met cryoAPEX konden we het toxine nauwkeurig lokaliseren met de gefragmenteerde golgi-stukken, iets dat echt moeilijk was om anders te zien met behulp van normale immunofluorescentietechnieken. Het aantonen van deze techniek zal Elaine Mihelc, een afgestudeerde student, en onderzoek medewerker, Stephanie Angel, uit onze laboratoria. Na het zaaien van HEK293 cellen in de schotel, transfect de cellen met APEX2 gelabeld zoogdier expressie plasmiden met behulp van transfectie reagens volgens de aanwijzingen van de fabrikant.Was de cellen na 12-15 uur na de transfectie één keer met PBS. Vervolgens, was de cellen met PBS uit de schotel in een 15 milliliter conische buis. Centrifuge op 500 x g gedurende vijf minuten.Verwijder de supernatant voorzichtig en zet de pellet opnieuw op in twee milliliters van 2%glutaraldehyde en 0,1 molaire natriumcaanoodylaatbuffer bij pH 7,4 bij kamertemperatuur. Leg het monster 30 minuten in het ijs om uit te broeden. Dan, pellet het monster op 500 x g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.Was de pellet drie keer gedurende vijf minuten elk met twee milliliter van 0,1 molaire natrium cacodylaat buffer door centrifugeren op vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie de supernatant. Om de peroxidasereactie uit te voeren, was de pellet door de pellet opnieuw op te schorten in drie milliliter DAB-oplossing, gevolgd door pelleting op 500 x g gedurende vijf minuten.Hang vervolgens de pellet opnieuw op in drie milliliter DAB-oplossing met 5,88 millimolar waterstofperoxide. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. De pellet wordt zichtbaar bruingekleurd, wat de aanwezigheid van het onoplosbare DAB-reactieproduct aangeeft.Na het wassen opnieuw met natriumcaanoodylaat buffer in DMEM, volgens het manuscript, opnieuw opschorten de cel pellet in 500 microliter van een cryoprotectant oplossing van DMEM met 10% foetale runderserum en 15% runder serum albumine. Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter. Pellet weer, iets verhogen van de centrifuge snelheid van 500 x g.Gooi het grootste deel van de supernatant weg, zodat er voldoende vloeistof overblijft, zodat de pellet niet uitdroogt. Wick weg alle resterende vloeistof uit de cel pellet met behulp van de hoek van een laboratorium doekje of papieren handdoek. Laat genoeg vloeistof blijven dat de pellet vormt een pasta, vergelijkbaar met de tandpasta.Aspirate twee tot drie microliter van de cel pellet en deponeren op een membraan drager. Vul de put van de membraandrager volledig, zodat de oppervlaktespanning een lichte koepel bovenop creëert. Schuif de membraandrager in de cartridge en bevestig.Plaats de cartridge in de HPF-machine die is voorbereid en voorbereid en druk op het bevriezen. Houd de cartridges ondergedompeld in vloeibare stikstof, verwijder de membraandrager uit de cartridge. Plaats in een plastic capsule en plaats de plastic capsule in een Cryovial vol vloeibare stikstof.Bereid in een chemische kap één milliliter per monster van de oplossing van 0,2% gewichtspercenten tanninezuur en 5%DI-water in aceton in een Cryovial. Plaats ze in vloeibare stikstof te bevriezen. Plaats de vriessubstitutiemix een flesjes en de Cryovials met de bevroren celpellets in de monsterkamer van de vriessubstitutie.Breng de binnenste capsule met de membraandrager van de vloeibare stikstof flacon over in het overeenkomstige flacon dat vriessubstitutie mengt. Start een freeze substitutie protocol bij 90 graden Celsius. Na 24 uur pauzeer je de vriessubstitutie en was je de monsters drie keer gedurende vijf minuten met aceton dat is afgekoeld tot 90 graden Celsius.Bereid vervolgens in een chemische kap een milliliter per monster van een oplossing van 1%osmiumterroxide, 0,2% uranylacetaat en 5%DI-water in aceton in een Cryovial en plaats ze in vloeibare stikstof om te bevriezen. Plaats de Cryovials met de vriessubstitutiemix twee in de vriessubstitutieunit en breng de capsules van de derde acetonwasspoeling in de vriesvervangingsmix twee flacons. Incubeer ze uit en bevriezen substitutie mix twee voor 72 uur op 90 graden Celsius, gevolgd door geleidelijke opwarming tot nul graden Celsius over 12-18 uur.Houd de temperatuur op nul graden Celsius en voeg voorgekoelde aceton in de flesjes te wassen drie keer gedurende 10 minuten per stuk. Bereid een hars mengsel van keuze in een plastic beker volgens de aanwijzingen van de fabrikant en voeg 2%4%en 8% van hars in de flesjes om de capsules onder te dompelen. Incubeer gedurende twee uur elk bij nul graden Celsius.Vervolgens, incubeer in 15%30%60%90%en 100% hars componenten van A, B en D slechts voor vier uur elk bij kamertemperatuur. Bereid na de 20 uur een mengsel van harscomponenten A, B, C en D en broed gedurende vier uur. Plaats het membraan dragers met cel pellet kant omhoog in platte inbedding mallen en vul met hars mengsel A, B, C, en D.Place ze in een oven te polymeriseren op 60 graden Celsius gedurende 24-36 uur.Na polymerisatie, verwijder de blokken uit de mal en plaats het monster in de verticale klem van de ultra microtome waar het kan worden gevisualiseerd met vergroting. Scheid de membraandrager van het blok door een combinatie van deppende vloeibare stikstof op de membraandrager om het metaal van het plastic te scheiden, en gebruik een scheermesje om de hars rond de membraandrager weg te chippen. Wanneer gescheiden, voorzichtig til de membraan drager, waardoor de cel pellet koepel op het gezicht van het blok.Plaats het blok met de blootgestelde cel pellet naar boven gericht in een platte inbedding schimmel die iets dieper is dan de eerste mal en vul met hars componenten A, B, C, en D.Polymerize op 60 graden Celsius voor 24-36 uur. Trim het blok rond de cel pellet met behulp van een scheermesje. Plaats vervolgens het blok in de monster chuck op de sectioning arm van een ultra microtome.Met behulp van een glas of diamant mes, trim het blok in een trapeziumvormige vorm dicht bij de cel pellet. Verkrijg 90 nanometer ultra dunne delen van de celpellet met behulp van een glas of diamantmes. Kies een lint van secties op een TEM-raster.Droog het raster door de rand op een stuk filterpapier te poten en op te slaan in een OPBERGDOOS VAN HET TEM-raster. Monteer het rooster op de TEM-houder en plaats de houder in de microscoop. Gebruik een Tecnai T12 op 80 kilovolts voor het screenen van cryoAPEX monsters.Verwerf afbeeldingen van cellen en subcellulaire structuren van belang met APEX2-etikettering. In deze studie resulteerde de voorbereiding van het monster met traditionele APEX-methoden in een duidelijke etikettering van georganiseerde, soepele endoplasmische reticulumstructuren. Bij hoge vergroting verschenen de gestapelde membranen ruches en waren er niet-uniforme openingen aanwezig tussen concentrische membraandichtheden, wat wijst op een slechte membraanconservering en lipideextractie.Het monster bereid door cryoAPEX had ook duidelijk gedefinieerde etikettering van georganiseerde, gladde endoplasmische reticulum structuren, maar de membranen waren glad en parallel en weinig tot geen lipide extractie werd gezien. Tem-analyse van 90 nanometer dunne secties toonde aan dat Huntington gist interactief eiwit E aanwezig was in het perifere endoplasmatische reticulum en de nucleaire envelop. Bovendien werd de Huntington gist interactie eiwit E dichtheid opgelost in regelmatig gesprede foci langs de luminale endoplasmamische reticulum membraan.Huntington gist interactie eiwit E distributie en foci waren ook zichtbaar in een monster bereid met traditionele fixatie en uitdroging. Echter, uitgebreide membraan verstoring en extractie aanwezig waren, waardoor het monster suboptimaal. APEX2-etikettering werd uitgevoerd met behulp van drie cellulaire markers, waarvan mito-V5-APEX2 alleen specifieke kleuring van mitochondriën leverde en CAAX-APEX2 alleen een duidelijke kleuring van het plasmamembraan produceerde.Er werd geen etikettering waargenomen in intracellulaire organellen. Kleuring voor de golgi lumen werd ook beoordeeld met behulp van een Alpha MAN2-APEX2 marker zoals beschreven in onze oorspronkelijke Sengupta et al manuscript. Volgens deze procedure kunnen driedimensionale methoden zoals elektronentomografie of gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscopie worden uitgevoerd om de 3D-verdeling van een interessant eiwit te onderzoeken.Veel van de chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt, zijn giftig, dus voor gebruik moeten veiligheidsinformatiebladen worden geraadpleegd om ervoor te zorgen dat de chemische stoffen worden behandeld met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en worden verwijderd volgens de institutionele richtlijnen.

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Hier geven we een eenvoudige, goedkope en tijdbesparende protocol chemisch fixeren primaten hersenweefsel met acroleïne fixatief, waardoor langdurig bewaren die compatibel zijn met pre-inbedding immunohistochemie voor transmissie elektronenmicroscopie is.

De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor het labelen van membraaneiwitten in zoogdiercellen en het monster bedekt met grafeen voor vloeibare-fase scanning transmission electron microscopie. De stabiliteit van de monsters tegen de schade veroorzaakt door straling kan ook bestudeerd met dit protocol.

Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie

Dit protocol demonstreert hoe biologische cryo-geconserveerde monsters kunnen worden afgebeeld met behulp van cryo-gestructureerde verlichtingsmicroscopie. We demonstreren de methodologie door het cytoskelet van U2OS-cellen in beeld te brengen.

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Het doel van dit protocol is om celadhesie en -groei te richten op gerichte gebieden van rasters voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door een aangroeiwerende laag aan te brengen die wordt opgeblazen in door de gebruiker gespecificeerde patronen, gevolgd door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in de patroongebieden voorafgaand aan het zaaien van cellen.

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (&lt;1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Leer de cryoAPEX-methode voor lokalisatie van membraaneiwitten met behoud van celultrastructuur via elektronenmicroscopie. Deze techniek helpt onderzoekers virale replicatiemechanismen in HEK293-cellen bestuderen.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Meer video's verkennen