De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Deze methode combineert de mogelijkheid om vlekken voor een membraan eiwit, terwijl ook het behoud van membraan integriteit en subcellulaire architectuur. Dus het is echt krachtig voor het precies lokaliseren van een membraan geassocieerd eiwit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het gebruik van een robuuste genetisch kloonbare tag, APEX2, combineert met state-of-the-art methoden in cellulaire bewaring voor elektronenmicroscopie, inclusief cryofixatie en vriessubstitutie.

Samen maken deze nauwkeurige eiwitlokalisatie mogelijk in een goed bewaarde cel. Dit protocol kan worden gebruikt om mechanismen te ontleden waarmee virussen zich in de hostcel vermenigvuldigen. Virussen zullen vaak kapen gastheer eiwitten tijdens hun infectie regeling.

Virussen zijn de kleine genomen, die ze gebruiken om te repliceren in deze gastheercellen. Onlangs hebben we in staat geweest om in ongepubliceerde gegevens, label deze eiwitten met behulp van deze technologie om te begrijpen hoe virussen repliceren. Deze techniek bleek echt kritisch in een recente collaboratieve studie over een bacteriële toxine dat golgi afbraak veroorzaakt.

Met cryoAPEX konden we het toxine nauwkeurig lokaliseren met de gefragmenteerde golgi-stukken, iets dat echt moeilijk was om anders te zien met behulp van normale immunofluorescentietechnieken. Het aantonen van deze techniek zal Elaine Mihelc, een afgestudeerde student, en onderzoek medewerker, Stephanie Angel, uit onze laboratoria. Na het zaaien van HEK293 cellen in de schotel, transfect de cellen met APEX2 gelabeld zoogdier expressie plasmiden met behulp van transfectie reagens volgens de aanwijzingen van de fabrikant.

Was de cellen na 12-15 uur na de transfectie één keer met PBS. Vervolgens, was de cellen met PBS uit de schotel in een 15 milliliter conische buis. Centrifuge op 500 x g gedurende vijf minuten.

Verwijder de supernatant voorzichtig en zet de pellet opnieuw op in twee milliliters van 2%glutaraldehyde en 0,1 molaire natriumcaanoodylaatbuffer bij pH 7,4 bij kamertemperatuur. Leg het monster 30 minuten in het ijs om uit te broeden. Dan, pellet het monster op 500 x g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.

Was de pellet drie keer gedurende vijf minuten elk met twee milliliter van 0,1 molaire natrium cacodylaat buffer door centrifugeren op vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie de supernatant. Om de peroxidasereactie uit te voeren, was de pellet door de pellet opnieuw op te schorten in drie milliliter DAB-oplossing, gevolgd door pelleting op 500 x g gedurende vijf minuten.

Hang vervolgens de pellet opnieuw op in drie milliliter DAB-oplossing met 5,88 millimolar waterstofperoxide. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. De pellet wordt zichtbaar bruingekleurd, wat de aanwezigheid van het onoplosbare DAB-reactieproduct aangeeft.

Na het wassen opnieuw met natriumcaanoodylaat buffer in DMEM, volgens het manuscript, opnieuw opschorten de cel pellet in 500 microliter van een cryoprotectant oplossing van DMEM met 10% foetale runderserum en 15% runder serum albumine. Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter. Pellet weer, iets verhogen van de centrifuge snelheid van 500 x g.

Gooi het grootste deel van de supernatant weg, zodat er voldoende vloeistof overblijft, zodat de pellet niet uitdroogt. Wick weg alle resterende vloeistof uit de cel pellet met behulp van de hoek van een laboratorium doekje of papieren handdoek. Laat genoeg vloeistof blijven dat de pellet vormt een pasta, vergelijkbaar met de tandpasta.

Aspirate twee tot drie microliter van de cel pellet en deponeren op een membraan drager. Vul de put van de membraandrager volledig, zodat de oppervlaktespanning een lichte koepel bovenop creëert. Schuif de membraandrager in de cartridge en bevestig.

Plaats de cartridge in de HPF-machine die is voorbereid en voorbereid en druk op het bevriezen. Houd de cartridges ondergedompeld in vloeibare stikstof, verwijder de membraandrager uit de cartridge. Plaats in een plastic capsule en plaats de plastic capsule in een Cryovial vol vloeibare stikstof.

Bereid in een chemische kap één milliliter per monster van de oplossing van 0,2% gewichtspercenten tanninezuur en 5%DI-water in aceton in een Cryovial. Plaats ze in vloeibare stikstof te bevriezen. Plaats de vriessubstitutiemix een flesjes en de Cryovials met de bevroren celpellets in de monsterkamer van de vriessubstitutie.

Breng de binnenste capsule met de membraandrager van de vloeibare stikstof flacon over in het overeenkomstige flacon dat vriessubstitutie mengt. Start een freeze substitutie protocol bij 90 graden Celsius. Na 24 uur pauzeer je de vriessubstitutie en was je de monsters drie keer gedurende vijf minuten met aceton dat is afgekoeld tot 90 graden Celsius.

Bereid vervolgens in een chemische kap een milliliter per monster van een oplossing van 1%osmiumterroxide, 0,2% uranylacetaat en 5%DI-water in aceton in een Cryovial en plaats ze in vloeibare stikstof om te bevriezen. Plaats de Cryovials met de vriessubstitutiemix twee in de vriessubstitutieunit en breng de capsules van de derde acetonwasspoeling in de vriesvervangingsmix twee flacons. Incubeer ze uit en bevriezen substitutie mix twee voor 72 uur op 90 graden Celsius, gevolgd door geleidelijke opwarming tot nul graden Celsius over 12-18 uur.

Houd de temperatuur op nul graden Celsius en voeg voorgekoelde aceton in de flesjes te wassen drie keer gedurende 10 minuten per stuk. Bereid een hars mengsel van keuze in een plastic beker volgens de aanwijzingen van de fabrikant en voeg 2%4%en 8% van hars in de flesjes om de capsules onder te dompelen. Incubeer gedurende twee uur elk bij nul graden Celsius.

Vervolgens, incubeer in 15%30%60%90%en 100% hars componenten van A, B en D slechts voor vier uur elk bij kamertemperatuur. Bereid na de 20 uur een mengsel van harscomponenten A, B, C en D en broed gedurende vier uur. Plaats het membraan dragers met cel pellet kant omhoog in platte inbedding mallen en vul met hars mengsel A, B, C, en D.Place ze in een oven te polymeriseren op 60 graden Celsius gedurende 24-36 uur.

Na polymerisatie, verwijder de blokken uit de mal en plaats het monster in de verticale klem van de ultra microtome waar het kan worden gevisualiseerd met vergroting. Scheid de membraandrager van het blok door een combinatie van deppende vloeibare stikstof op de membraandrager om het metaal van het plastic te scheiden, en gebruik een scheermesje om de hars rond de membraandrager weg te chippen. Wanneer gescheiden, voorzichtig til de membraan drager, waardoor de cel pellet koepel op het gezicht van het blok.

Plaats het blok met de blootgestelde cel pellet naar boven gericht in een platte inbedding schimmel die iets dieper is dan de eerste mal en vul met hars componenten A, B, C, en D.Polymerize op 60 graden Celsius voor 24-36 uur. Trim het blok rond de cel pellet met behulp van een scheermesje. Plaats vervolgens het blok in de monster chuck op de sectioning arm van een ultra microtome.

Met behulp van een glas of diamant mes, trim het blok in een trapeziumvormige vorm dicht bij de cel pellet. Verkrijg 90 nanometer ultra dunne delen van de celpellet met behulp van een glas of diamantmes. Kies een lint van secties op een TEM-raster.

Droog het raster door de rand op een stuk filterpapier te poten en op te slaan in een OPBERGDOOS VAN HET TEM-raster. Monteer het rooster op de TEM-houder en plaats de houder in de microscoop. Gebruik een Tecnai T12 op 80 kilovolts voor het screenen van cryoAPEX monsters.

Verwerf afbeeldingen van cellen en subcellulaire structuren van belang met APEX2-etikettering. In deze studie resulteerde de voorbereiding van het monster met traditionele APEX-methoden in een duidelijke etikettering van georganiseerde, soepele endoplasmische reticulumstructuren. Bij hoge vergroting verschenen de gestapelde membranen ruches en waren er niet-uniforme openingen aanwezig tussen concentrische membraandichtheden, wat wijst op een slechte membraanconservering en lipideextractie.

Het monster bereid door cryoAPEX had ook duidelijk gedefinieerde etikettering van georganiseerde, gladde endoplasmische reticulum structuren, maar de membranen waren glad en parallel en weinig tot geen lipide extractie werd gezien. Tem-analyse van 90 nanometer dunne secties toonde aan dat Huntington gist interactief eiwit E aanwezig was in het perifere endoplasmatische reticulum en de nucleaire envelop. Bovendien werd de Huntington gist interactie eiwit E dichtheid opgelost in regelmatig gesprede foci langs de luminale endoplasmamische reticulum membraan.

Huntington gist interactie eiwit E distributie en foci waren ook zichtbaar in een monster bereid met traditionele fixatie en uitdroging. Echter, uitgebreide membraan verstoring en extractie aanwezig waren, waardoor het monster suboptimaal. APEX2-etikettering werd uitgevoerd met behulp van drie cellulaire markers, waarvan mito-V5-APEX2 alleen specifieke kleuring van mitochondriën leverde en CAAX-APEX2 alleen een duidelijke kleuring van het plasmamembraan produceerde.

Er werd geen etikettering waargenomen in intracellulaire organellen. Kleuring voor de golgi lumen werd ook beoordeeld met behulp van een Alpha MAN2-APEX2 marker zoals beschreven in onze oorspronkelijke Sengupta et al manuscript. Volgens deze procedure kunnen driedimensionale methoden zoals elektronentomografie of gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscopie worden uitgevoerd om de 3D-verdeling van een interessant eiwit te onderzoeken.

Veel van de chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt, zijn giftig, dus voor gebruik moeten veiligheidsinformatiebladen worden geraadpleegd om ervoor te zorgen dat de chemische stoffen worden behandeld met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en worden verwijderd volgens de institutionele richtlijnen.