Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring
23 juni 2020
Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.
Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen met slechts een fluorescentiemicroscoop te analyseren en de intensiteit van de reactieve zuurstofsoorten te kwantificeren met fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief. Begin met het zaaien van twee keer 10 tot de vijfde HCT116 colorectale kankercellen in DMEM in elke put van een 24-put plaat.
Broed de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. Vervang de volgende dag het kweekmedium door 100 micromolar ferrosulfaat, of 10 micromolar doxorubicinehoudend medium, en broed de plaat nog 24 uur uit. Bereid de DCFH-DA-oplossing voor door 4,85 milligram DCFH-DA op te lossen in één milliliter DMSO om een 10 millimolar voorraadoplossing te maken.
Vlak voordat u het aan de putten toevoegt, verdun de voorraad met voorverwarmde DMEM om een 10 micromolar werkoplossing te maken en draaikolk het gedurende 10 seconden. Om de cellen te bevlekken, verwijder het medicijnhoudende medium en was ze één keer met DMEM. Voeg 500 microliter DCFH-DA werkoplossing toe aan elke put en ontcubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Na de incubatie, verwijder de DCFH-DA uit de putten, en was ze twee keer met DMEM, en een keer met PBS. Voeg vervolgens 500 microliter PBS toe aan elke put. Gebruik het groene fluorescerende eiwitkanaal op de fluorescentiemicroscoop om representatieve beelden van de cellen te maken.
Verwijder vervolgens de PBS en voeg 200 microliters radioimmunoprecipitatietestbuffer toe aan elke put. Broed de plaat vijf minuten op ijs en verzamel de cellysates in buizen van 1,5 milliliter. Centrifugeren de buizen op 21, 130 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.
Breng vervolgens 100 microliter van de supernatant over naar een zwarte 96-putplaat. Gebruik een microplate lezer op een excitatie golflengte van 485 nanometer, en een emissie golflengte van 530 nanometer, om de fluorescentie te meten in elke put. Meet vervolgens de eiwitconcentratie met de Bradford-test door een microliter van de supernatant over te brengen naar een duidelijke 96-putplaat met 100 microliters eiwittestoplossing.
Gebruik de eiwitconcentraties om de fluorescentieintensiteiten te normaliseren. HCT116 colorectale kankercellen werden behandeld met 100 micromolar ferrosulfaat, of 10 micromolar doxorubicine, om oxidatieve stress te veroorzaken. Zoals verwacht, werd de groene fluorescentie dramatisch verhoogd door beide behandelingen.
Om de relatieve intensiteitsveranderingen te kwantificeren, werden de cellen gelyseerd en genormaliseerd met eiwitconcentraties. De relatieve fluorescentieintensiteit werd aanzienlijk verhoogd door ferrosulfaat of doxorubicine. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om DCFH-DA-oplossing fris te maken en blootstelling aan licht te voorkomen, evenals om de storing in de celstatus te minimaliseren en om vlak voor het maken van beeld uitgebreide PBS-was uit te voeren.
Naast de detectie van de totale ROS door dit protocol, kan specifiek ROS zoals peroxide worden uitgevoerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren van totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van DCFH-DA. De methode maakt het mogelijk om de lokalisatie van ROS in adherente cellen te visualiseren en de ROS-intensiteit te kwantificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire biologie
- Analyse van reactieve zuurstofsoorten
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Reactieve zuurstofsoorten spelen een cruciale rol bij cellulaire signalering.
- Inzicht in de lokalisatie van ROS kan inzicht verschaffen in cellulaire processen.
- Fluorescentietechnieken worden algemeen gebruikt voor de detectie van ROS.
- Dit protocol is ontworpen voor gebruiksgemak en kosteneffectiviteit.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het detecteren van ROS in adherente cellen.
- Om de visualisatie en kwantificering van ROS via fluorescentiemicroscopie mogelijk te maken.
- Om het proces voor onderzoekers in dit vakgebied te vereenvoudigen.
Gebruikte methoden
- Uitplaatten van HCT116 colorectale kankercellen in een 24-wellplaat.
- Incuberen van cellen met ijzersulfaat of doxorubicine.
- Bereiden van de DCFH-DA-oplossing voor ROS-detectie.
- Gebruik van fluorescentiemicroscopie en een plaatlezer voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de ROS-lokalisatie in cellen.
- Kwantificering van de ROS-intensiteit demonstreerde de effectiviteit van de methode.
- Het protocol bleek eenvoudig en efficiënt voor onderzoekers.
- Kosteneffectieve aanpak voor ROS-analyse in cellulaire studies.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige methode voor de detectie van ROS.
- Het kan worden toegepast op diverse typen adherente cellen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode voor diepere inzichten in cellulaire mechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve detectie van totale reactieve zuurstofspecies (ROS) in adherente cellen met behulp van DCFH-DA-kleuring biedt een gestandaardiseerde readout voor oxidatieve stress, een sleutelfactor bij ziekte modellering en studies naar medicijnrespons. Deze methode maakt een robuuste beoordeling van de cellulaire redoxstatus mogelijk na chemische of genetische perturbaties, wat bijdraagt aan mechanistische de-risking en targetvalidatie in de vroege ontdekkingsfase. De kosteneffectiviteit en schaalbaarheid maken het geschikt voor integratie in high-throughput screening en translationele workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve analyse van oxidatieve stresspaden in ziekte-relevante celmodellen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van targets die de cellulaire redoxbalans moduleren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door verbindingen of genetische interventies te koppelen aan de ROS-output.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare, op fluorescentie gebaseerde assay voor de kwantificering van ROS in adherente cellen.
- Ondersteunt de standaardisatie en normalisatie van de assay middels eiwitconcentratiemetingen.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van door verbindingen geïnduceerde oxidatieve stress mogelijk voor screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt oxidative stress-metingen af met ziektemodellen voor de translationele ontwikkeling van biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van in vitro ontdekking naar preklinische validatie van redox-modulerende middelen.
- Biedt predictieve waarde voor de veiligheid en effectiviteit van verbindingen met betrekking tot oxidatieve mechanismen.
Pipeline- & workflowintegratie
Dit DCFH-DA-gebaseerde ROS-detectieprotocol past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie en biedt een kwantitatieve readout voor de modulatie van oxidatieve stress in cellulaire systemen.
- Discovery-biologie: Maakt hypothese-testen van redox-gerelateerde targets en pathways mogelijk.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve ROS-metingen voor de triage van verbindingen.
- Analytica: Integreert normalisatie van fluorescentie-intensiteit voor een robuuste gegevensvergelijking.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro bevindingen over oxidatieve stress en validatie in preklinische modellen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een breed toepasbare, kosteneffectieve assay voor diverse celtypen en interventies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de redoxbiologie en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de ROS-kwantificering met schaalbare, reproduceerbare workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door interventies te koppelen aan resultaten van oxidatieve stress.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van redox-modulerende assets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en het bedienen van een plaatlezer.
- Toegang tot standaardinfrastructuur voor celkweek en eiwitkwantificatie is noodzakelijk.
- Voorzichtig gebruik van het DCFH-DA-reagens is vereist om lichtgeïnduceerde degradatie te voorkomen.
- Standaardisatie van de was- en normalisatiestappen is cruciaal voor de reproduceerbaarheid.
- Het protocol is aanpasbaar voor diverse adherente cellijnen, maar kan optimalisatie vereisen voor specifieke modellen.
