Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie
17 januari 2020
We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.
Onze methode is significant, omdat het de gemiddelde biochemicus in staat stelt om snel te bepalen of monsters geïsoleerd met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie zijn besmet met overgang metalen. Het belangrijkste voordeel is het gemak waarmee de test kan worden uitgevoerd. De test maakt gebruik van instrumentatie en technieken gemeenschappelijk voor de meeste biochemie laboratoria, en het kan gemakkelijk en snel worden geïmplementeerd.
Terwijl in dit artikel passen we deze methode toe voor monsters geïsoleerd met een nikkel-NTA kolom, kan de methode worden gebruikt met een andere metaal affiniteit hars. Eerste keer gebruikers moeten proberen deze methode met een nikkel voorraad oplossing van bekende concentratie. Hiermee worden ze vertrouwd gemaakt met de werkstroom, voorbeeldkleuren en harsen die in spectrale wijzigingen worden weergegeven.
Het aantonen van de procedure zal Cole Swain zijn, een technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen schakelt u de UV-Vis spectrofotometer in en warm u deze op. Bepaal de chromatografiefracties die moeten worden getest met behulp van een diodearray UV-Vis spectrofotometer met optische absorptie op 280 nanometer om het eiwit te kwantificeren.
Verkrijg een monsterbuffer van 10 tot 100 millimolar met een PH tussen 7 en 12, zoals Tris, HEPES, MOPS en fosfaatbuffer. Bereid een volumeoplossing van 12% van de HNB-dispersie in de monsterbuffer voor met behulp van 120 milligram HNB-reagens voor elke bereide milliliter voorraadoplossing. Stel de spectrofotometer in om gegevens te verzamelen op 647 nanometer.
Gebruik een kwarts cuvette gevuld met de monsterbuffer om de spectrofotometer leeg te maken. Bereid een controleoplossing voor in een cuvette met 50 microliter HNB-voorraad per milliliter van het totale testvolume. Laat de bediening minimaal drie minuten bij kamertemperatuur uitbroeden.
Meet en noteer de absorptie op 647 nanometer voor het controlemonster. Bereid de testmonsters voor door 150 microliter HNB-bouillon te mengen met 2850 microliter van op de juiste manier verdunde eiwitfracties met de monsterbuffer. Laat het monster minimaal drie minuten incuberen bij kamertemperatuur.
Herhaal de spectrumopname voor elke te meten fractie. In het geval dat onvoldoende verdunning wordt verkregen, is de gehele spectrale band op 647 nanometer verdwenen. Terwijl met een te sterke verdunning, het monster is niet te onderscheiden van de controle.
Om de concentratie van metaal in elk monster te bepalen, vindt u eerst het verschil van elke monsterabsorptie op 647 nanometer van de HNB-regeling. Bepaal de metaalconcentratie in micromolar met behulp van de formule waarbij DF de verdunningsfactor is voor de testfractie, delta A-B-S 647 is de absorptieverandering op 647 nanometer, 3,65 keer 10 tot negatief 2 de extinctiecoëfficiënt van HNB en ik is het optische pad van Cuvette in centimeters. In deze studie wordt hier het spectrum van vrije HNB bij neutrale PH in representatieve spectra van fracties getoond die voor nikkelion uit de isolatie van MSP1E3D1 worden gessayd.
Een verminderde absorptie op 647 nanometer ten opzichte van de HNB-controle werd waargenomen, wat overeenkwam met de vorming van HNB-complexen in aanwezigheid van een overgangsmetaal. Om de toepassing van deze test aan te tonen, werden twee met zijn getagde membraansteiwitten, MSP1E3D1, MSP2N2 en een roman, drie-heme, c-type cytochrome GSU0105, uit geobacterulfuren, geanalyseerd. Het eiwit- en nikkeliongehalte van elke fractie voor GSU0105 werd aanzienlijk van elkaar verschoven, terwijl de fracties voor MSP1E3D1 en MSP2N2 die het meeste eiwit bevatten ook het hoogste nikkelgehalte hadden.
Het is ook geïllustreerd dat het metaalgehalte niet gelijkmatig kan worden verdeeld over fracties verzameld met behulp van een gemobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. Het is het belangrijkste om adequaat en consequent meng de blanco in alle monsters en zorgen voor gelijke incubatietijden voor de blanco in alle monsters. Eiwitfracties van bijzonder belang kunnen verder worden geanalyseerd met atomaire absorptiespectrometrie of ICPMS om metaalverontreiniging te bevestigen en te testen op gechelated of sterk gebonden eiwitmetaalionen.
Naast overgangsmetaaluitlogingsdetectie kan deze techniek worden gebruikt om bindende affiniteiten in overgangmetaalionen naar eiwitten te meten. HNB en eventuele nikkel aanwezig in monsters zijn irriterend voor de ogen en de huid respectievelijk. Tijdens de methode moet standaard beschermingsmiddelen worden gebruikt, met inbegrip van handschoenen en oogbescherming.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudige analyse voor het kwantificeren van metalen in monsters die zijn voorbereid met behulp van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blue als colorimetrische indicator en hanteert een UV-Vis-spectrofotometer voor detectie.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Analytische Chemie
- Metaalaffiniteitschromatografie
Achtergrond
- Contaminatie van monsters met overgangsmetalen kan de experimentele resultaten beïnvloeden.
- Immobilized metal affinity chromatography is een veelgebruikte techniek in de biochemie.
- Bestaande methoden voor het detecteren van metaalcontaminatie kunnen complex zijn of gespecialiseerde apparatuur vereisen.
- Er is behoefte aan een eenvoudige en toegankelijke methode voor routinematige analyse in biochemische laboratoria.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige analyse te bieden voor het detecteren van metaalcontaminatie in monsters.
- Om biochemici in staat te stellen de zuiverheid van monsters snel te beoordelen.
- Om het gebruik van gangbare laboratoriumapparatuur voor de kwantificering van metalen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van hydroxynaphtholblauw als colorimetrische indicator.
- Toepassing van UV-Vis-spectrofotometrie voor detectie.
- Testen met nikkel-NTA-kolommen en andere metafafiniteitharsen.
- Initiële proeven met bekende concentraties van nikkel-stockoplossingen.
Belangrijkste resultaten
- De assay maakt een snelle beoordeling van metaalcontaminatie mogelijk.
- Resultaten kunnen worden verkregen met behulp van standaard laboratoriumtechnieken.
- De methode is aanpasbaar aan diverse metaalaffiniteitharsen.
- Gebruikers kunnen zich via initiële proeven vertrouwd maken met de workflow.
Conclusies
- De voorgestelde assay vereenvoudigt de detectie van metaalcontaminatie.
- Deze is toegankelijk voor gemiddelde biochemici met gangbare laboratoriumapparatuur.
- De methode verhoogt de betrouwbaarheid van monsters die zijn geprepareerd via metaalaffiniteitschromatografie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Metaaluitloging uit kolommen voor geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) introduceert overgangsmetaalcontaminanten die de enzymactiviteit kunnen remmen en de betrouwbaarheid van assays in biofarmaceutisch onderzoek en ontwikkeling kunnen compromitteren. Dit protocol biedt een eenvoudige, toegankelijke methode voor het kwantificeren van dergelijke contaminatie met behulp van algemeen beschikbare UV-Vis spectrophotometrie en hydroxynaphthol blue (HNB), waardoor routinematige kwaliteitscontrole mogelijk is zonder gespecialiseerde instrumentatie. Door nanomolaire gevoeligheid te leveren met standaard laboratoriumapparatuur, ondersteunt de assay de data-integriteit in vroege stadia van targetvalidatie en workflows voor eiwitzuivering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om vast te stellen of de geobserveerde enzymremming voortkomt uit de biologie van het doelwit of uit metaalcontaminatie, waardoor het aantal fout-positieven bij de validatie van doelwitten wordt verminderd.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van bestaande UV-Vis-spectrofotometers en gangbare buffers, waardoor snelle implementatie binnen discovery-teams mogelijk is zonder investeringen in nieuwe apparatuur.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metingen van metaalionen bij 647 nm, waardoor uitlogingsniveaus kunnen worden gecorreleerd aan de zuiverheid van fracties bij IMAC-zuivering.
- Operationele waarde: Standardiseert de beoordeling van contaminatie over verschillende eiwitvarianten en harsen, wat bijdraagt aan de reproduceerbare ontwikkeling van assays voor de productie van his-tagged eiwitten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt de metaalvrije status van gezuiverde eiwitten voorafgaand aan functionele assays, wat het voorspellend vertrouwen in downstream studies naar target-engagement verbetert.
- Operationele waarde: Biedt een vrijgavecriterium voor eiwitbatches, waardoor go/no-go-beslissingen kunnen worden genomen voordat men overgaat tot preklinische werkzaamheidstesten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode vormt de schakel tussen IMAC-zuivering en daaropvolgende biochemische of biofysische karakterisering, en dient als controlepunt voor de zuiverheid van het monster voorafgaand aan enzymkinetiek, bindingsassays of structurele studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen door metaal-gemedieerde artefacten in enzymactiviteit of proteïne-interactiegegevens uit te sluiten.
- Screening: Garandeert de gereedheid van assays door te verifiëren dat gezuiverde proteïnefracties vrij zijn van inhiberende overgangsmetalen die de resultaten van compound-screening kunnen beïnvloeden.
- Analytics: Genereert kwantitatieve absorptie-deltawaarden bij 647 nm, wat de berekening van micromolaire metaalconcentraties voor lot-tot-lot vergelijkingen mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de zuiveringskwaliteit met preklinische continuïteit door te waarborgen dat metaalcontaminatie de target-validatie of biomarker-metingen niet vertroebelt.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbare QC-stap die toepasbaar is op elke IMAC-gebaseerde zuivering, ongeacht het type hars of het doeleiwit.
Operationele en bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door een veelvoorkomende bron van biochemische ruis in enzymgebaseerde assays te elimineren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door het gebruik van een colorimetrische methode met gedefinieerde incubatie- en meetparameters.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op mislukte experimenten door ongedetecteerde metaalinhibitie, wat de kapitaalefficiëntie bij lead-identificatiecampagnes verbetert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van eiwit-targets mogelijk op basis van bevestigde zuiverheid, wat bijdraagt aan een betere toewijzing van middelen in de vroege ontdekkingsfase.
Overwegingen voor de uitvoering
- Vereist bekendheid met UV-Vis-spectrofotometrie en de basisbereiding van oplossingen voor HNB-reagens.
- Afhankelijk van de toegang tot kwartscuvetten en een spectrofotometer die in staat is tot absorptiemetingen bij 647 nm.
- Vereist consistente monsterverdunning en incubatietijden om nauwkeurige delta-AB-berekeningen te garanderen.
- Kan optimalisatie vereisen voor eiwitten met een sterke intrinsieke absorptie of kleurinterferentie bij 647 nm.
- Bij voorkeur te combineren met orthogonale methoden zoals AAS of ICPMS voor bevestiging wanneer een metaalkwantificering met een hoge betrouwbaarheid noodzakelijk is.
