Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de assemblagefuncties van bacteriële afscheidingscomplexen en kan leiden tot een fundamenteel begrip van de moleculaire mechanismen die nodig zijn voor interacties met gastheerpathogen. Deze techniek integreert complementaire benaderingen die de inheemse structuur van het monster behouden en maakt het mogelijk en te zien aan visualisatie van eiwitten complexen in intacte bacteriële cellen. Het verhoogt ons begrip van de structurele functierelaties van bacteriële afscheidingssystemen.

Deze methode kan worden aangepast om andere soorten afscheidingssystemen of andere cellulaire complexen in een breed scala van bacteriële soorten te bestuderen. Begin met het maken van agarose pads voor live cel beeldvorming. Bereid ongeveer 30 mL van 1%laag smelten agarose oplossing in water en magnetron het in een glazen kolf voor ongeveer 90 seconden wervelende het af en toe totdat de agarose volledig is opgelost.

Plaats twee glazen schuifglijden van 22 bij 22 bij 0,15 mm op de rand van een glazen schuif van 25 bij 75 bij 1,1 mm bovenop de andere. Stapel vervolgens nog twee van de kleinere dia's aan de andere rand. Pipette ongeveer 1 mL van de gesmolten agarose in het midden dia tussen de twee bovenste glazen platen en plaats een andere grote dia op de top van de gesmolten agarose om ervoor te zorgen dat de vorming van luchtbellen te voorkomen.

Koel de dia's op vier graden celsius gedurende 15 minuten gebruik dan een scalpel of scheermesje om het pad voorzichtig te snijden in kleine vierkantjes. Bevestig een dubbelzijdig lijmframe op een 25 bij 75 bij 1,1 mm glazen schuif en plaats verschillende pads op de glijbaan. Los een zware patch legionella Pneumophila op in 1 mL dubbelgedestilleerd water.

Dan vortex en pipet twee tot drie microliters van de verdunning op de pads. Plaats voorzichtig een afdek van 58 bij 24 bij 0,15 mm over het kleefframe. Selecteer cellen voor beeldvorming met heldere veldverlichting.

Vervolgens, in het vangstvenster van de software van de microscoop, pas de ND aan 180 en de binning aan twee door twee. Gebruik het kanaal van 488 nanometer om het monster 500 tot 1000 milliseconden bloot te leggen en valideer de specificiteit van de fluorescentie door niet-getagged Legionella Pneumophila met dezelfde parameters te berekenen. Om polariteit te kwantificeren, past u het beeldcontrast aan zodat de bacteriën duidelijk zichtbaar zijn.

Zoom vervolgens in op het interessegebied en gebruik het gebiedsgereedschap om een rechthoek van 0,25 bij 1,3 micrometer te plaatsen vanaf de paal en zich uit te breiden tot het cytoplasma om ervoor te zorgen dat de rechthoek binnen de bacteriële grenzen blijft. Markeer ten minste 200 bacteriën en maak maskers met behulp van de regio te maskeren knop in het analysemenu. Klik op maskerstatistieken en kies object onder maskerbereik.

Markeer vervolgens de gemiddelde intensiteit en variantie onder functies en intensiteit. Exporteer de gegevens als een tekstbestand en gebruik de spreadsheettoepassing om de polariteitsscores van elke bacterie te berekenen als de verhouding tussen de variantie en de gemiddelde intensiteit. Voor toepassingen met een hoge doorvoer gebruik maken van face contrast microscopie om dual channel beelden te verwerven.

Zorg ervoor dat u velden van mening te kiezen waar de bacteriën volledig zijn gescheiden. Pas vervolgens het gezichtskanaalcontrast van het beeld aan op een niveau waarop de bacteriën duidelijk zichtbaar zijn. Open de dual-channel afbeelding en start het venster Segmentmasker maken.

Pas de juiste drempelwaarde aan en verwijder vervolgens de kleine objecten door op de knop Objecten definiëren te klikken en de minimumgrootte aan te passen aan 100 pixels. Selecteer onder het verfijnen van masker de optie Randenobjecten verwijderen en afzonderlijke maskers van bacteriën die naast elkaar liggen. Om de dynamiek van de fusie-eiwitten te kwantificeren, opent u het beeldopnamevenster en markeert u time lapse.

Voer er twee in het vak tijdstippen in. Verwerven twee succesvolle beelden van Legionella Pneumophila uitdrukken van de fluorescerende eiwit van belang. Pas het afbeeldingscontrast aan totdat de cellen duidelijk zichtbaar zijn.

Gebruik vervolgens het gebiedsgereedschap om een vierkant van 0,25 bij 0,25 micrometer in het midden van ten minste 400 cellen te plaatsen. Gebruik vervolgens de knop Regio om de knop te maskeren in het analysemenu om een masker van de vierkanten van belang te maken. Maak een nieuw leeg masker en gebruik het pixelgereedschap om het hele celgebied van ten minste 25 willekeurige cellen te markeren.

Maak een ander masker en gebruik het grote penseel om gebieden tussen de cellen te markeren. Selecteer ten slotte maskerstatistieken en controleer of het object is geselecteerd onder maskerbereik voor masker één. Kies onder functies en intensiteit de gemiddelde intensiteit.

Exporteer de gegevens en herhaal het proces voor masker 2. Selecteer voor masker 3 het hele masker en exporteer de gemiddelde intensiteit. Om het elektronen cryotomografiemonster voor te bereiden, kweekt u een zware patch Legionella Pneumophila op CYE Agrastreptomisum-platen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius.

Resuspend de cellen in water tot een OD 600 van ongeveer 0,7. Voeg vervolgens vijf microliter colloïdale gouddeeltjes toe aan 20 microliter van de celsuspensie. Gloed ontlading een holey carbon grid en pipet vijf microliters van het celmengsel op.

Laat het even staan. Dep het rooster met filterpapier en bevries het in vloeibaar ethaan met behulp van een zwaartekracht-gedreven zuiger apparaat. Na het inbrengen van superfolder GFP in het Legionella Pneumophila chromosoom, werd levende cel fluorescerende microscopie uitgevoerd om het fluorescerende signaal te vergelijken met dat van de ouderlijke superfolder GFP negatieve stam.

Bovendien werd heldere veldmicroscopie gebruikt om het aandeel cellen met een specifiek fluorescerend signaal te onderzoeken. Slechts een fractie van de cellen die DotB superfolder GFP geproduceerd toonde polaire lokalisatie van de fusie-eiwit. Bij het karakteriseren van de verdeling van DotB tl-signaal, bleek dat de intensiteit van DotB superfolder GFP aan de polen was ongeveer twee keer hoger dan in de cytosol.

Om te onderzoeken of DotB superfolder GFP polarisatie afhankelijk was van een volledig geassembleerd type vier afscheidingssysteem, werden polariteitsscores van DotB superfolder GFP bepaald voor individuele cellen in een wild type, en in een gemuteerd type vier afscheidingssysteem. Inderdaad, polaire positionering van DotB superfolder GFP verdwenen toen de Dot / ICM-systeem werd verwijderd. Dynamische patronen gaven aan dat de DotB ATPase aanwezig was in een dynamische cytosolische populatie en werd aangeworven om de gepolariseerde Dot / ICM type vier secretie systeem in een laat stadium montage reactie.

Hoge doorvoer cryo-ET werd gebruikt om het intacte type vier secretiesysteem apparaat te visualiseren in een Legionella Pneumophila stam uitdrukken DotB superfolder GFP. Reconstructie van de cel bleek meerdere Dot / ICM machines ingebed in de cel envelop. Ook de algehele positionering van DotB en superfolder GFP ten opzichte van de intacte type vier secretiesysteemmachine werd bepaald.

Driedimensionale oppervlakterenders gaven aan dat superfolder GFP onder de DotB-hexamer is geplaatst, die als schijf aan de basis van het cytoplasmische ATPase-complex wordt geplaatst. Bij het proberen van deze techniek, zorg ervoor dat de stabiliteit van de fusie-eiwitten en de functionaliteit van de tag secretie systeem te beoordelen alvorens over te gaan tot beeldverwerving. Modellering en montage kunnen effectieve manieren zijn om de dynamische patronen en structurele dichtheden te analyseren, evenals voor de evaluatie van conformatieveranderingen of lokalisatie van subeenheden in de structuur.

Deze aanpak kan helpen bij het begrijpen hoe verschillende geheime systeemcomponenten van type vier functioneren, hoe ze binnen het grotere complex interageren en welke functies verschillende subassemblages uitvoeren.