Name: Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Ontdek hoe je zuurstofverbruik meet in pancreas-eilandjes van niet-menselijke primaten. Deze methode evalueert mitochondriale functie en verbetert de reproduceerbaarheid van assays met kleine monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Vanderbilt High throughput screening core voor het gebruik van hun faciliteiten, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) voor niet-menselijke primaten-eilandje-isolaties en Eric Donahue (Vanderbilt University) voor hulp bij figuur 1, erkennen. J.M.E. werd gesteund door NIGMS van de National Institutes of Health onder het awardnummer T32GM007347. M.G. werd gesteund door de NIH/NIDDK (R24DK090964-06) en het departement Veterans Affairs (BX003744).

1. bereiding van de microplaat en de sensor cartridge op de dag voorafgaand aan het uitvoeren van de test
Islets werden geïsoleerd van drie jaar oude Japanse makagen zoals eerder beschreven13. Deze methode is zeer vergelijkbaar met die gebruikt voor het isoleren van menselijke eilandjes van kadaver donoren, maar verschilt van muizen, waarin pancreata vaak worden opgeblazen met collagenase oplossing terwijl het dier onder sedatie en voorafgaand aan orgaanverwijdering. Het ophalen van een eilandje werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Oregon National Primate Research Center (ONPRC) en de Oregon Health and Science University en werden goedgekeurd door de ONPRC IACUC. De ONPRC houdt zich aan de dierenwelzijns wet en-regelgeving die wordt afgedwongen door het Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA) en het beleid inzake de volksgezondheid inzake humane verzorging en het gebruik van proefdieren overeenkomstig de gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren die door de National Institutes of Health worden gepubliceerd.
<ol><li>Bereiding van Spheroid-microplaat<ol>
<li>Bereid 3 mL van een 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing. Filter steriliseren de oplossing. We gebruikten een 0,45 μm filter (tabel van materialen).</li>
		<li>Voeg in een celkweek-kap 200 μL cel-en weefsellijm (tabel met materialen) toe aan 2,8 ml van 0,1 m natriumbicarbonaat. Voeg vervolgens 20 μL van deze oplossing toe aan de onderzijde van elke put van de 96-well spheroid-microplaat (tabel met materialen). Zorg ervoor dat luchtbellen uit de pipetpunt worden verwijderd en dat alleen de onderkant van de plaat bedekt is. Coating van de microplaat voorkomt dat eilandjes de zijkanten van de putjes omhoog bewegen wanneer geneesmiddelen worden toegevoegd en in de put worden gemengd tijdens de test. Opmerking: het is alleen nodig om zoveel putjes te gebruiken als voor eilandjes wanneer de test wordt uitgevoerd. Als er slechts een paar putten zullen worden gebruikt, kan de cellijm oplossing op de juiste manier worden geschaald. De cellijm die in de test wordt gebruikt, is een samengestelde eiwit oplossing die uit de mariene mossel is geëxtraheerd. Als alternatief kunnen microplaat putten worden gecoat met 20 μL van 100 μg/mL poly-D-Lysine.</li>
		<li>Incueren van de plaat in een 37 ° c, niet-CO2 incubator gedurende één uur.</li>
		<li>In een steriele omgeving, aspiraat cel lijm oplossing van de plaat. Was elke put tweemaal met 400 μL 37 °C steriel water met behulp van een pipet met meerdere kanalen. Laat de lucht drogen.</li>
		<li>Bedek na 30-40 minuten de plaat en bewaar deze op 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydratatie van de sensor cartridge<ol>
<li>In een steriele omgeving, open het sensor cartridge pakket (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast de gebruiks plaat.</li>
		<li>Vul elke put van het hulpstuk plaat met 200 μL steriel water en verlaag de sensor cartridge terug in de gebruiks plaat. Plaats geassembleerde sensor cartridge en hulp plaat in een 37 ° c, niet-CO2 incubator 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van Kalibrerende<ol>
<li>Aliquot 25 mL kalibrant (tabel van de materialen) in een conische buis van 50 ml. Plaats de buis in een 37 °C, niet-CO2 -incubator 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. protocol voor het voorbereiden van de media, het laden van eilandjes en het laden van de sensor cartridge op de dag van de test
<ol><li>Voorbereiding van media<ol>
<li>Tot 48,5 mL basismedia (minimale DMEM, Zie tabel met materialen), voeg 500 μL toe van 1 mm natrium pyruvaat en 2 mm glutamine. Voeg bovendien 496 μL van 200 mg/ml glucose (uiteindelijke concentratie van glucose in de media is 5,5 mM). Opmerking: Baseline glucoseconcentratie werd constant gehouden voor deze experimenten. Echter, glucose kan ook worden gebruikt om het stimuleren van de ademhaling naast de farmacologische manipulaties beschreven Blow10.</li>
		<li>Bevestig dat de pH 7,4 +/-0,1 is, indien nodig aanpassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de sensor cartridge<ol>
<li>Neem sensor cartridge uit de incubator, verwijder het deksel van de sensor cartridge en stort water uit putten. Plaats 200 mL voorverwarmde kalibrant in elk goed en vervang het deksel van de sensor cartridge.</li>
		<li>Plaats de sensor cartridge ongeveer 1 uur terug in de incubator (totdat nodig).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van geneesmiddelen voor mitochondriale stress assay<ol>
<li>Open de stress testkit (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Make-up voorraad en werkoplossingen voor Oligomycine, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazone (FCCP), en Rotenone/Antimycine A (AA) als volgt.<ol>
<li>Oligomycine: Voeg 630 μL geassembleerde media toe aan de buis om 100 μM voorraad te maken. Verdun vervolgens tot 45 μM met media om de poort concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie na injectie is 4,5 μM)</li>
			<li>FCCP: Voeg 720 μL geassembleerde media toe aan de buis om 100 μM voorraad te maken. Verdun tot 10 μM met media om de haven concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie is 1 μM) Opmerking: BSA en/of FBS mogen niet worden toegevoegd aan media, omdat dit de werking van mitochondriale uncouplers kan beïnvloeden14.</li>
			<li>Rotenone/AA: Voeg 540 μL geassembleerde media toe aan de buis om 50 μM voorraad te maken. Verdun tot 25 μM met media om de haven concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie is 2,5 μM) Opmerking: de bovenstaande concentraties hebben consistente resultaten in onze handen opgeleverd. Extra FCCP leidde tot geen verdere toename van de ademhaling. Echter, drugs concentraties moeten afhankelijk van de grootte van het eilandje worden aangepast, en vooral met eilandjes van verschillende soorten of niet-eilandje-spheroïden. Ter referentie, de gemiddelde diameter van een niet-menselijk primaten eilandje is ongeveer 150 μm15.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van spheroid-plaat en overdracht van eilandjes<ol>
<li>Hand-pick alvleesklier eilandjes in een celkweek schaal van 60 mm x 15 mm met geassembleerde media te verkrijgen in de buurt van 100% zuiverheid. Opmerking: Islets moeten worden afgerond, met een duidelijk gedefinieerde omtrek, en lijken dichter dan exocriene weefsel contaminanten. Vermijd eilandjes die beschadigd of gerafeld lijken. In dit experiment werd de grootte van het eilandje niet direct gemeten, hoewel we probeerden om eilandjes van ongeveer dezelfde grootte voor elke put en sample te kiezen.</li>
		<li>Laad elke put van spheroid-microplaat met 175 μL geassembleerde media met behulp van een multikanaalspipet.</li>
		<li>Gebruik een P20-pipet ingesteld op 15 μL, aspiraat 15 eilandjes van celkweek schotel. Islets moeten zichtbaar zijn in de pipetpunt tot het blote oog.</li>
		<li>Om eilandjes over te brengen naar spheroid-microplaat, verlaagt u de pipetpunt naar de onderkant van de put, gaat u nauwelijks omhoog en Pipetteer u langzaam een zeer klein volume (~ 5 μL). Bevestig dat alle eilandjes de pipetpunt hebben verlaten. Elk goed moet 15 eilandjes ontvangen. Controleer af en toe de spheroid-microplaat onder de Microscoop om te controleren of de eilandjes zich aan de onderkant van elk goed bevinden in plaats van vast te zitten aan de zijkanten. Opmerking: Vermijd het laden van de hoek putten met eilandjes. Zuurstof en pH-flux uit het plastic kan optreden tijdens de bepaling, en dit wordt verergerd in de vierhoek putten.</li>
		<li>Zodra alle eilandjes zijn overgebracht naar de spheroid-microplaat, incueren de microplaat in een incubator van 37 °c, niet-co2 , terwijl u de onderstaande stappen uitvoert.</li>
	</ol></li>
	<li>Het laden van de sensor cartridge en het uitvoeren van de test<ol>
<li>Verwijder de sensor cartridge uit de incubator. Poorten A-C voor elke put moeten worden geladen met een van beide geneesmiddelen of media. Putten met eilandjes en de vierhoek putten moeten worden geladen met geneesmiddel. Niet-hoek putten zonder eilandjes moeten worden geladen met media. Poort D kan leeg worden gelaten. Laadpoort A (linksboven van elke sensor) met 20 μL oligomycine of media. Laadpoort B (rechtsboven) met 22 μL FCCP of media. Laadpoort C (linksonder) met 25 μL Rotenone/AA of media.</li>
		<li>Program meer een extracellulaire flux Analyzer test voor een ademhalings periode van 30 minuten Baseline (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), 42 minuten oligomycine meetperiode (7 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), 30 minuten FCCP (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), en 30 minuten Rotenone/AA (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat).</li>
		<li>Voer de test uit en volg de instructies op het scherm voor het kalibreren van de sensor en het plaatsen van de microplaat.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
<li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li>
<li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420(1970).</li>
<li>Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li>
<li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139(2019).</li>
<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).</li>
<li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023(2012).</li>
<li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li>
<li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li>
<li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBS%2FBSA+media+concentration+determines+CCCP%27s+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li>
<li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+%28Rhesus%29+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De studie van het zuurstofverbruik in het eiland is eerder belemmerd door de bolvormige vorm van eilandjes, hun gebrek aan naleving van cultuur oppervlakken en het aantal vereiste eilandjes per put. In dit protocol benadrukken we de werkzaamheid van de 96-well spheroid-microplaat voor het meten van het zuurstofverbruik op het eilandje op een klein aantal eilandjes en demonstreren we een techniek voor het hanteren en laden van eilandjes die technisch haalbaar is en consistente Resultaten.
Om te...

Om de normale bloedglucosespiegels te handhaven, moet de cel alvleesklier β een verhoging in glucose voelen en insuline dienovereenkomstig afscheiden. De koppeling van insuline secretie met glucoseniveaus is direct gekoppeld aan glucose metabolisme en de productie van ATP via Mitochondriale oxidatieve fosforylering. Dus, mitochondriën spelen een cruciale rol in stimulus-secretie koppeling1. Beoordeling van β-cel mitochondriale functie kan defecten die leiden tot verminderde insuline secretie onthullen. De secretie van glucagon door pancreas α-cellen is ook nauw verbonden met de mitochondriale functie2. Hoewel vereeuwigd eilandje-cellijnen nuttig zijn gebleken voor sommige soorten assays, geeft de Fysiologie van deze cellen niet nauwkeurig de hele eiland functie weer, zoals geïllustreerd door de potentiëring van de insuline secretie door glucagon3,4 en de remming van de glucagonsecretie door insuline/Somatostatine5,6 in intacte eilandjes. Dit toont aan dat het zuurstofverbruik moet worden gemeten met behulp van hele, intacte eilandjes.
Technieken voor het meten van eilandje Cell respirometrie zijn geëvolueerd in de loop van de tijd, van het gebruik van zuurstof gevoelige fluorescerende kleurstoffen7 tot Solid-State sensoren die direct meten van het zuurstofverbruik8. In eerste instantie ontworpen voor monolayer, aanhandige cellen, veelgebruikte cel cultuur plaat systemen hebben bewezen ondoeltreffend te zijn voor pancreas eilandjes. Omdat eilandjes niet van nature aan de putjes hechten, zijn ze gevoelig voor geduwd naar de periferie van de cultuur, wat resulteert in onnauwkeurige meting van zuurstofverbruik9. Om dit probleem te bestrijden, gespecialiseerde 24-put platen met een centrale depressie die kon bevatten eilandjes werden ontwikkeld9. Het 24-goed plaat systeem werd echter beperkt door het grote aantal vereiste eilandjes (50-80 per put) en het aantal voorwaarden dat tegelijkertijd getest kon worden10. De recente ontwikkeling van 96-well microplaten speciaal ontworpen voor extracellulaire flux analyse in sferoïden heeft deze barrières overwonnen, waardoor de meting van het eilandje respirometrie met 20 of minder eilandjes per put10.
Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem voor het meten van het zuurstofverbruik in eilandjes van de Japanse makaak (Macaca fuscata), een diermodel met vergelijkbare eilandje-biologie voor mensen11,12. In dit protocol worden 15 makaak-eilandjes per put geanalyseerd. In onze handen, 15 eilandjes per goed geproduceerd hogere Baseline zuurstofverbruik dan minder eilandjes, met robuuste activering en onderdrukking van de ademhaling in reactie op de farmacologisch manipulatie. We benadrukken de stappen om voor te bereiden op de Assay, een effectieve methode voor het consistent laden van eilandjes in het midden van elke put, en gemeenschappelijke uitdagingen bij het uitvoeren van deze test.

<table><tbody><tr><td>Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td><td>Corning</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Conical tube, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td>Voor glucose-oplossing, 200 mg/ml, sterieel gefilterd</td></tr><tr><td>Disposable reservoirs (sterieel), 25 ML</td><td>Vistalab</td><td>3054-1033</td><td>voor het laden van multikanaals pipet</td></tr><tr><td>EZFlow steriele 0,45 µm PES spuitfilter, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>Multikanaals pipetpunten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>Multikanaals pipet, 15-1250 µL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672100BT</td><td>Aanbevolen</td></tr><tr><td>P20, P200 en P1000 pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>pH-sonde</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten, 20 µL, 200 µL, 1000 µL</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Basismedium</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Cel Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Bevat Oligomycine, FCCP en Rotenone/Antimycin A</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7800B</td><td>Inclusief voorbereidingsstation met 37 °C niet-CO2-incubator</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroïde Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>Bevat sensorcartridge, sferoïde microplaat en kalibrator</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (sterieel), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>Voor steriele filtratie</td></tr><tr><td>Water (sterieel)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van niet-menselijke primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

De meting van het zuurstofverbruik in spheroid-clusters van cellen, zoals ex-vivo pancreas eilandjes, is van oudsher een uitdaging geweest. We demonstreren de meting van het zuurstofverbruik op het eilandje met behulp van een 96-well microplaat die is ontworpen voor het meten van het zuurstofverbruik in spheroids. In deze test worden spheroid-microplaten op de dag voorafgaand aan de test gecoat met een cel-en weefsellijm. We gebruiken een kleine hoeveelheid lijm oplossing om de hechting van het eilandje aan te moedigen tot alleen de bodem van de put. Op de dag van de assay worden 15 eilandjes direct in de basis van elke put geladen met behulp van een techniek die zorgt voor een optimale positionering van eilandjes en een nauwkeurige meting van het zuurstofverbruik. Verschillende aspecten van de mitochondriale ademhaling zijn geprobed farmacologisch in niet-menselijke primaten eilandjes, met inbegrip van ATP-afhankelijke ademhaling, maximale ademhaling, en Proton lek. Deze methode maakt consistente, reproduceerbare resultaten mogelijk met slechts een klein aantal eilandjes per put. Het kan theoretisch worden toegepast op elke gekweekte sferoïden van vergelijkbare grootte.

Om eilandjes in microplaat te laden, moeten 15 μL media worden aangezuigen, zoals weergegeven in Figuur 1A. Islets zullen zich binnen enkele seconden natuurlijk in de richting van de onderkant van de pipetpunt vestigen. Vervolgens wordt de pipetpunt naar de bodem van de put verlaagd. De punt is zeer licht opgeheven en een klein volume (ongeveer 5 μL) wordt samen met de eilandjes uitgelicht. Deze techniek resulteert in een consistente plaatsin...

Dit protocol demonstreert de nauwkeurige en reproduceerbare meting van het zuurstofverbruik in niet-humane primaat alvleesklier eilandjes. De laad technieken van het eilandje en de coating van de microplaat bieden een kader voor een efficiënte meting van de ademhaling in andere soorten gekweekte spheroids.

Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Deze methode maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik te kwantificeren door kleine aantallen eilandjes van relevante soorten, zoals niet-menselijke primaten en mensen, waardoor de mitochondriale functie kan worden beoordeeld. Deze techniek kan worden uitgevoerd met kleine aantallen primaire eilandjes, het verhogen van de technische replica's, waardoor het testen van meerdere voorwaarden, en het verbeteren van de strengheid en reproduceerbaarheid van de test. Deze techniek beoordeelt mitochondriale gezondheid, een belangrijke determinaat van eilandje functie en insuline secretie die vaak wordt aangetast bij diabetes en is een belangrijke voorspeller van succesvolle eilandjetransplantatie.Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de eilandjes zijn gelokaliseerd in het centrum van de putten na overdracht. Als u dit niet doet, leidt dit tot inconsistente metingen van het zuurstofverbruik. Het aantonen van deze procedure zal zijn, Valerie Ricciardi, een student die in mijn laboratorium werkt.De dag voor de test, voeg 200 microliter van cel-en weefselkleef aan 2,8 milliliter van 0,1 molaire bicarbonaat oplossing en voeg 20 microliter van de resulterende oplossing aan de onderkant van elke put van een 96 goed sferoïde microplate. Zorg ervoor dat eventuele luchtbellen uit de pipetpunt worden verwijderd. Wanneer alle putten zijn geladen, plaats de plaat in een 37 graden Celsius niet-kooldioxide incubator.Na een uur, aspirate de cel lijm oplossing van de plaat in een steriele omgeving en was elke put twee keer met 400 microliters van 37 graden Celsius steriel water. Laat vervolgens de putten 30 tot 40 minuten aan de lucht drogen voordat u de plaat bedekt voor 's nachts opslag bij vier graden Celsius. Om de sensorcartridge te hydrateren, open u in een steriele omgeving de sensorcartridge en verwijdert u de inhoud.Plaats de sensorcartridge ondersteboven naast de hulpplaat en vul elke put van de utility plate met 200 microliter steriel water. Wanneer alle putten zijn geladen, laat u de sensorcartridge in de hulpplaat zakken en plaats u de geassembleerde sensorcartridge en de hulpplaat 's nachts in de 37 graden Celsius niet-koolstofdioxide incubator. Verwijder op de dag van de test het deksel van de sensorcartridge en decanteer het water uit de putten van de nutsplaat.Voeg 200 milliliter voorverwarmde calibrant aan elke put toe en vervang het sensorcartridgedeksel. Plaats vervolgens de sensorcartridge ongeveer een uur terug in de couveuse. Om de eilandjes voor te bereiden op overdracht, kies de eilandjes in een 60 bij 15 millimeter cel kweekschotel met geassembleerde medium tot een bijna 100%zuiverheid.Wanneer alle eilandjes zijn verzameld, laad elke put van de voorbereide sferoïde microplaat met 175 microliter van geassembleerd medium en gebruik een P20 pipet set op 15 microliters om 15 eilandjes in 15 microliter van medium van de celkweek schotel aan te halen. Om de eilandjes op de sferoïde microplaat te zaaien, laat de pipetpunt naar de bodem van de put zakken, tilt u de punt nauwelijks op en geeft u langzaam ongeveer vijf microliters medium af. Om de eilandjes in de putten te laden, laat de eilandjes zich in de pipetpunt nestelen voordat ze voorzichtig direct boven de bodem van het putcentrum in een klein volume van het medium worden losgelaten.Bevestig dat alle eilandjes de pipetpunt hebben verlaten, controleer af en toe de sferoïde microplaat onder de microscoop om te controleren of de eilandjes aan de onderkant van de plaat zijn gezaaid en niet aan de zijkanten van de putten zijn geplakt. Wanneer alle eilandjes zijn overgedragen, plaats de microplaat in de 37 graden Celsius niet-kooldioxide incubator. Voordat u de testprocedure initieert, laadt u poort A van de sensorcartridge met 20 microliters vers bereide 45 micromolar oligomycine, Poort B met 22 microliter vers bereide 10 micromolar FCCP en Port C met 25 microliter vers bereide 25 micromolarrotenone AA. Vervolgens programmeer een extracellulaire flux analyzer test voor een 30 minuten baseline ademhalingsperiode, 42 minuten oligomycine meetperiode, 30 minuten FCCP periode, en 30 minuten rotenone AA periode.Voer vervolgens de test uit volgens de instructies op het scherm voor het kalibreren van de sensor en het invoegen van de microplaat. Voor de levering van eilandjes aan de testplaat moeten 15 eilandjes worden aangezogen in 15 microliter van medium zoals afgebeeld. Deze techniek zal resulteren in de consistente plaatsing van eilandjes in het onderste midden van elke microplaat goed waardoor nauwkeurige metingen van het zuurstofverbruik.In dit representatieve experiment met het zuurstofverbruik van individuele putten, waren de putten slecht geladen wat resulteerde in een zeer laag basisniveau van zuurstofverbruik en weinig tot geen reactie op FCCP. In dit experiment, de meeste van de putten aangetoond een significante baseline ademhaling en reactie op drugs. Echter, twee putten vertoonden geen reactie op rotenone, wat suggereert dat het medicijn niet goed werd vrijgegeven in de put.Deze putten werden uitgesloten van verdere analyses. Hier kunnen de resultaten van een succesvolle test waarbij de putten goed werden geladen met eilandjes en correct geïnjecteerd met geneesmiddelen worden waargenomen. Het is nuttig om de reagentia en platen de dag voorafgaand aan het uitvoeren van de test voor te bereiden, zodat de eilandjes kunnen worden gebruikt kort nadat ze zijn geïsoleerd of ontvangen.Na de test kunnen de eilandjes worden teruggewonnen voor eiwit- of DNA-extractie om de zuurstofverbruiksgegevens te normaliseren of om het mitochondriale DNA-gehalte te kwantificeren. De mogelijkheid om mitochondriale functie te meten in kleine aantallen primaire primaten eilandjes maakt het testen van meerdere geneesmiddelen en andere manipulaties in een enkele biologische repliceren. Personen die werken met primaire primaten eilandjes moeten er zeker van zijn om te worden opgeleid in de juiste en veilige behandeling met deze weefsels.Met name het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen en de juiste verwijdering van deze monsters.

analysis-of-non-human-primate-pancreatic-islet-oxygen-consumption

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Het doel van dit protocol is om een ​​standaard methode te presenteren aan intraveneuze glucose tolerantie testen (IVGTTs) uit te voeren om de glykemische controle van niet-menselijke primaten te evalueren en hun metabolische status dysmetabolic beoordelen van gezonde.

Karakterisering van Metabolic Status in niet-humane primaten met de intraveneuze glucosetolerantietest

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Zuurstofverbruik (OCR) is een veel voorkomende proxy voor mitochondriale functie en kan worden gebruikt om verschillende ziektemodellen te bestuderen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen die fysiologisch relevanter is dan andere methoden.

Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Dit protocol beschrijft procedures voor het isoleren van hoogwaardige kernen uit bevroren niet-menselijke pancreaseilandjes van primaten voor gebruik in single-nucleus gelijktijdige RNA-sequencing en ATAC-sequencing, terwijl de bulkcytosolische fractie voor metabolomische analyses uit dezelfde monsters behouden blijft.

Bereiding van ingevroren foetale eilandjes van niet-menselijke primaten voor gecombineerde RNA-sequencing met één kern en ATAC-sequencing, en bulkmetabolomics

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Ontdek hoe je zuurstofverbruik meet in pancreas-eilandjes van niet-menselijke primaten. Deze methode evalueert mitochondriale functie en verbetert de reproduceerbaarheid van assays met kleine monsters.

Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik

Meer video's verkennen