TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

NLR immuunreceptoren spelen een cruciale rol bij het bemiddelen van plantenverdediging tegen verschillende ziekteverwekkers. We beschrijven een TurboID-gebaseerde nabijheidslabelmethode voor de identificatie van interactiepartners van Toll/interleukine-1 receptordomein met NLR's zoals immuunreceptoren in Nicotiana benthamiana planten. Dit protocol biedt een belangrijke referentie voor het onderzoeken van eiwit-eiwit interacties in andere plantensoorten en het kan worden uitgebreid tot elk eiwit van belang in Nicotiana benthamiana.

De turboid-gebaseerde nabijheidsetiketteringsbenadering heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van de traditionele benaderingen, omdat het kan worden gebruikt om tijdelijke of zwakke eiwit-eiwitinteracties in vivo vast te leggen. Begin met het kweken van N.benthamiana zaden in natte grond bij een hoge dichtheid. Onderhoud ze in een klimaatkamer met een 18-uurs licht en acht uur durende donkere fotoperiode op 23 tot 25 graden Celsius.

Houd de planten in de kamer voor ongeveer vier weken totdat ze groeien tot een blad stadium van vier tot acht voor de daaropvolgende agro-infiltratie. Bouw TurboID fusies en zet de plasmiden om in Agrobacterium tumefaciens competente cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een een milliliter naaldloze spuit om het entmateriaal van de abaxiale opperhuid van de volledig volwassen N.benthamiana bladeren te infiltreren.

Na 36 uur na filtratie infiltreer je 200 micromolar biotine in de bladeren en onderhoud je de plant nog eens drie tot twaalf uur voordat je het bladweefsel oogst. Om het bladmonster te verzamelen, snijd de geïnfiltreerde bladeren aan de basis van de petiole, verwijder de bladader en flash bevriezen het weefsel in vloeibare stikstof. Maal het bladweefsel met een stamper en mortel en bewaar het poeder in 15 of 50 milliliter Falcon buizen op min 80 graden Celsius.

Om het totale eiwit te extraheren, breng ongeveer 0,35 gram bladpoeder over naar een twee milliliter buis. Zorg ervoor dat u het weefsel op lage temperatuur in de vloeibare stikstof tijdens dit proces te handhaven. Voeg 700 microliter RIPA lyse buffer toe aan het poeder.

Vortex de buis gedurende 10 minuten en laat het monster op ijs gedurende 30 minuten, het mengen van de inhoud om de vier tot vijf minuten door het omkeren van de buizen. Centrifugeren de buizen op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verzamel dan de supernatant.

Verwijder de vrije biotine door het monster door een ontziltingskolom te laten lopen. Verwijder de sealer aan de onderkant van de kolom en plaats deze in een buis van 50 milliliter. Maak vervolgens de dop los en vercentrifuge de kolom op 1,000 keer g en vier graden Celsius gedurende twee minuten.

Plaats de desalting kolom in een verse 50 milliliter buis en equilibrate de kolom drie keer met vijf milliliter RIPA lyse buffer. Centrifuge het op 1.000 keer g en vier graden Celsius gedurende twee minuten en gooi de flow-through elke keer. Voeg 1,5 milliliter eiwitextract toe aan de bovenkant van de hars in de geëquilibreerde kolom.

En wanneer het extract in de hars komt, voeg nog eens 100 microliters ripa lyse buffer. Centrifugeren de kolom gedurende twee minuten en laat de ontzilte monsters op ijs tot verder gebruik. Om de gedesalted eiwitextracten te kwantificeren, meet de OD595 met behulp van een Bio-Rad spectrofotometer.

Teken de standaardcurve op basis van de waarde van de gradiënt BSA-oplossing en bereken de concentratie van de gedesalted eiwitmonsters. Equilibrate de streptavidin C1 geconjugeerde magnetische kralen met een milliliter RIPA lyse buffer voor een minuut bij kamertemperatuur. Gebruik het magnetische rek om de kralen gedurende drie minuten te absorberen en de oplossing voorzichtig aan te trekken.

Herhaal dan de was nog een keer. Breng het eiwitextract over naar de geëquilibreerde magnetische kralen en broed de buis 's nachts bij vier graden Celsius op een rotator om de eiwitten te zuiveren. Op de volgende dag, vangen de kralen met een magnetisch rek en aspirate de supernatant.

Was vervolgens de kralen met 1,7 milliliter wasbuffer een door het toe te voegen aan de buis en uitbroeden op de rotor gedurende acht minuten. Verwijder de supernatant zoals eerder beschreven en herhaal de was met 1,7 milliliter wasbuffer twee en was buffer drie. Voeg 1,7 milliliter 50 millimolar Tris HCL toe om het wasmiddel te verwijderen.

Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek en verwijder de supernatant. Herhaal de was met een milliliter van 50 millimolar Tris HCL en breng de kralen over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Tot slot, was de kralen zes keer met 50 millimolar ammonium bicarbonaat buffer gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Gebruik 100 microliter kralen voor immunoblot-analyse om de verrijking van de biotinyleerde eiwitten te bevestigen en de rest van het monster te bevriezen om bij min 80 graden Celsius te worden opgeslagen. Westerse vlekken werden gebruikt om eiwitexpressie en biotinylation te analyseren in de agroinfiltrrated N.benthamiana bladeren. De gebiotinyleerde eiwitten in de geïnfiltreerde bladeren werden efficiënt verrijkt met streptavidin C1 geconjugeerde magnetische kralen voor latere massaspectrometrieanalyse.

Verschillende eiwitten met verschillende maten werden gevangen en westerse vlekanalyse van de verrijkte eiwitten toonde besmeurde banden. Bij het proberen van deze procedure, vergeet dan niet om de sealer te verwijderen aan de onderkant van desalting kolom en los de doppen voor elke centrifugatie. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere eiwitten van belang in Nicotiana benthamiana en kan ook worden gebruikt om de TurboID PL uit te breiden in andere plantensoorten.