Kwantificering van plasmide gemedieerde antibioticaresistentie in een experimentele evolutie benadering

Plasmiden zijn extrachromosomale elementen die alomtegenwoordig zijn in de meeste bacteriële soorten en habitats waar ze zeer belangrijke middelen van laterale genoverdracht zijn omdat ze kunnen migreren tussen cellen en tussen populaties. Een van de meest opvallende en prominente voorbeelden van een dergelijke overdracht is de verspreiding van antibioticaresistentie genen die zijn gecodeerd op plasmiden. Om een model plasmide te bouwen dat een gen van de resistentie van antibiotica codeert, kiest u een plasmidbackbone en versterken PCR de ruggengraat met behulp van een high fidelity polymerase en primers die binden aan de plasmidesjabloon. In ons geval gebruikten we een pBBR1 plasmid backbone. Vervolgens versterken van de weerstand gen nptII met inbegrip van de inheemse Tn5 promotor met behulp van een high fidelity polymerase. Ontwerp de primers voor het resistentiegen met ongeveer 20 basisparen sequentie complementariteit aan de plasmide ruggengraat. Na de PCR's, zekering van de homologie regio van de gezuiverde weerstand gen PCR product aan de gezuiverde plasmid ruggengraat met behulp van isothermale assemblage op 50 graden gedurende 60 minuten. Zet het gesmolten product om in E.Coli DH5-Alpha met behulp van elektroporatie. Plaat 100 microliter van het mengsel op selectieve media en incubeer op 37 graden gedurende ongeveer 24 uur. De plasmide kan vervolgens worden geëxtraheerd, gevalideerd en omgezet in de E.coli wilde type stam MG1655. Dit levert stam MG1655 pCON.Tijdens blootstelling aan antibiotica, bacteriën moeten de plasmide om te overleven. Zo is de plasmide onder positieve selectie. Onder niet-selectieve omstandigheden, dus zonder antibiotica, is de plasmide wegwerpbaar voor de cel. Het doel van onze studie was om de plasmiden te volgen onder dergelijke niet-selectieve omstandigheden in de tijd. Hiervoor hebben we de kleine plasmiden uitgerust met een antibioticaresistentiegen en het geïntroduceerd bij Escherichia coli. We voerden een evolutionair experiment uit en controleerden de plasmidenfrequentie via replica plating. De plasmide dragende stam mg1655 pCON wordt nu geïntroduceerd in een evolutie-experiment. Ten eerste, plaat mg1655 pCON op LB agar platen aangevuld met antibiotica en incubeer 's nachts op 37 graden. Kies uit deze plaat willekeurig de 8 voorouderkolonies en broeder 's nachts bij 37 graden met constant schudden. Op de volgende dag, worden de bevolking overgebracht naar het experiment dat in 96 diepe putplaten wordt uitgevoerd. Het is zeer belangrijk om willekeurig verdelen de replica's over de plaat. Bijvoorbeeld in een checkerboard aanpak. In ons experiment worden de culturen verdund en overgedragen met verschillende verdunningspercentages en in twee temperaturen. Tijdens elke overdracht wordt de verdunningsbehandeling toegepast en wordt de seriële overdracht herhaald over een totaal van 98 overdrachten. Langs het evolutieexperiment wordt de frequentie van plasmiden in de bevolking geschat van het aandeel plasmide dragende cellen. Replica plating werd gepopulariseerd door Esther en Joshua Lederberg in de jaren 1950, waar ze het gebruikten om resistentie tegen geneesmiddelen in bacteriën te bestuderen. De methode zal hen in staat stellen om hun scannen voor fenotypen op te schalen en aan het einde van de studie bleek dat penicillineresistentie kan ontstaan in bacteriën als gevolg van spontane mutaties in het genoom. Om de plasmidefrequentie in de bevolking tijdens het experiment te bepalen, worden stationaire culturen serieel verdund en verguld op niet-selectieve LB agarplaten. Pas de verdunning aan op basis van een opbrengst van 250 tot 500 kolonies per plaat. De vergulde populaties zijn geïncubeerd voor 's nachts groei op 37 graden voor minder dan 24 uur. Kolonies kunnen het best worden gerepliceerd als ze nog klein zijn. Na nachtgroei tellen alle kolonies met behulp van een geautomatiseerde kolonie teller van de keuze van de lezer. Dit levert de totale omvang van de bacteriënpopulatie in de culturen op. Houd er rekening mee dat kolonies aan de rand van de plaat moeten worden weggelaten. Om de platen te repliceren, moet u selectieve agar platen aangevuld met antibiotica, een rond blok, een metalen ring die het blok past, en steriele fluwelen doek. Het doek moet 100% katoen zijn, omdat dit gesteriliseerd kan worden door autoclavatie. Leg de doek op het blok en bevestig het met de metalen ring.Plaats de plaat voorzichtig met de getelde kolonies op het vaste fluwelen doekoppervlak. Tik op de plaat in cirkelbewegingen, zodat al het plaatoppervlak de doek raakt. Het is heel belangrijk dat alle kolonies het fluweel aanraken. Verwijder de LB-plaat en plaats de selectieve plaat op het fluweel. Herhaal het voorzichtig tikken. Het is opnieuw belangrijk dat de plaat het fluweel volledig raakt. Verwijder daarna de selectieve plaat. De platen worden 's nachts bij kamertemperatuur geïncubeerd. De volgende dag zijn zowel de LB als de antibioticaplaat nodig voor evaluatie. Plaats de platen boven elkaar en vergelijk de groei. U gemakkelijk kolonievrije ruimtes spotten. Dit zijn de kolonies die niet resistent zijn tegen de antibiotica. Zo verloren deze kolonies de plasmide. Op het einde, mark hoeveel kolonies ontbreken op de antibiotica plaat. Dit nummer geeft je het plasmide verlies. Herhaal de replica beplating van alle populaties tijdens de evolutie experiment wekelijks. Plasmide verlies kan worden veroorzaakt door plasmide multi misvorming. Bij het werken aan een plasmide constructie zeggen voor de expressie van een bepaald gen in uw voorkeur gastheer stam het inheemse gedrag van een plasmide in vivo met betrekking tot de bevestiging van een staat kan nemen is meestal iets dat over het hoofd wordt gezien. Maar in een evolutionaire context kan een dergelijke bevestiging van veranderingen van zeer groot belang zijn. De analyse van plasmide bevestigingen kan een zeer lastige onderneming. Vooral plasmide multimers zijn moeilijk te analyseren omdat ze niet goed kunnen worden geïdentificeerd door PCR of door sequencing. Aan de andere kant, plasmid multimers zijn moeilijk te analyseren door gel elektroforese vanwege hun potentieel grote omvang en hun langzame elektroforetische mobiliteit. Ons protocol biedt een eenvoudige en eenvoudige methode voor de screening en identificatie van plasmide multimers in ik zou zeggen elke gegeven plasmide voorbereiding. Om te visualplasmid moleculen extract de plasmide uit 5 mL stationaire nachtelijke celcultuur met behulp van alkalische lyse. Plasmid extractie van lage kopie plasmiden leidt vaak tot besmetting met gastheer chromosomale DNA dat moet worden verteerd voorafgaand aan visualisatie. Om chromosomale DNA-besmetting te verwijderen behandel het geëxtraheerde plasmide DNA met Plasmid-Safe