Name: Kwantificering van plasmide gemedieerde antibioticaresistentie in een experimentele evolutie benadering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Leer hoe u plasmiddynamiek en antibioticaresistentie in bacteriële populaties kwantificeert met behulp van experimentele evolutie en replica plating. Deze methode biedt inzicht in plasmidestabiliteit onder selectieve en niet-selectieve omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Gor Margaryan voor creatieve ondersteuning en technische assistentie. Dit werk werd gesteund door de ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (toegekend aan TW) en het DFG focus programma 1819 (Grant No. DA1202/2-1 toegekend aan TD).

1. bouw van een model plasmide met een antibioticaresistentie gen
Opmerking: de stam Escherichia coli K-12 MG1655 werd gebruikt als modelorganisme in alle experimenten (DSM No. 18039, Duitse verzameling van micro-organismen en celculturen, DSMZ). De stam E. coli DH5α17 werd gebruikt tijdens de plasmide constructie.
<ol><li>PCR versterkt de plasmide ruggengraat van uw keuze en versterkt het resistentie-gen, inclusief de Promoter regio, met PCR (Figuur 1).<ol>
<li>PCR versterkt de plasmide ruggengraat met behulp van een high-fidelity polymerase en de oligonucleotiden pBBR1_for (5 '-GCGGCCACCGGCTGGCT-3 ') en pBBR1_rev (5 '-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ') op de plasmide template pLC (GenBank acc. nr. MH238456)18.</li>
		<li>PCR versterkt het resistentie-gen Nptii , inclusief de native Tn5 Promoter19 met behulp van een high-fidelity polymerase en oligonucleotiden NPTII_GIB_FOR (5 '-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') en NPTII_GIB_REV (5 '-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 '). Het nptii -gen codeert voor een neomycine fosfotransferaseactiviteit en verleent resistentie aan kanamycine. Opmerking: ontwerp de primers voor het Verzets gen met ongeveer 20 BP van complementaire sequentie tot de plasmide ruggengraat waarmee het wordt samengesmolten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinig beide PCR-fragmenten met een Kit naar keuze.</li>
	<li>Sluit u aan bij het gezuiverde antibioticaresistentie Gene PCR-product (inclusief de Promoter regio) op de gezuiverde plasmide backbone en smelt de homologe regio's met isothermische assemblage20, bij 50 °c gedurende 60 min.</li>
	<li>Elektroporate het gesmolten product in de stam E. coli DH5α.<ol>
<li>Introduceer 2 μL van het product van stap 1,3 in 40 μL elektrocompetente cellen in 2 mm cuvettes bij 4 °C en 2,5 kV. Respendeer cellen in 1 ml lysogeny Bouillon (lb) medium.</li>
		<li>Breng het totale volume over naar een microfugebuis buis en inincuberen 1 uur bij 37 °C schudden bij 250 rpm in een rondschudapparaat om de uitdrukking van de weerstands marker op het plasmide te kunnen geven.</li>
		<li>Plaat 100 μL van de cellen op LB agar platen met het geschikte antibioticum (kanamycine 25 μg/mL) om te selecteren voor het antibioticaresistentie-gen en zo te kiezen voor plasmide dragende cellen. Draai de rest, verwijder de supernatant, regeer de cellen in 100 μL LB en plaat op een selectieve agar plaat. Inincuberen de platen bij 37 °C gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om klonen te verifiëren, haalt u de geconstrueerde plasmiden op via alkalische lysis met behulp van een commerciële mini-prep Kit.<ol>
<li>Oogst 5 mL van de stationaire nachtelijke kweek door centrifugeren op 12.000 x g bij kamertemperatuur. Hervat de cellen in resuspensie oplossing, dan lyse en Neutraliseer de celoplossing. Centrifugeer 5 min bij 12.000 x g.</li>
		<li>Breng het supernatant over in de in de kit meegeleverde DNA-bindings kolom en was de kolom tweemaal met 500 μL wasoplossing centrifugeren 2x voordat het kolom membraan met elutie buffer wordt geelativeerd.</li>
		<li>Voer Sanger-sequencing van het plasmide uit om te bevestigen dat de sequentie correct is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de plasmide geldigheid is geverifieerd, elektroporate de plasmide (nu pCON) in de stam E. coli MG1655 zoals hierboven beschreven. Dit levert stam E. coli MG1655 pCon.</li>
</ol>2. monitoring van plasmide dragende bacteriën onder verschillende omstandigheden in de tijd
Opmerking: het evolutie experiment wordt uitgevoerd met plasmide dragende stammen onder niet-selectieve omstandigheden (LB-media) in twee temperaturen (37 °C en 20 °C) en drie populatie knelpunt grootten. Het experimentele ontwerp wordt gebruikt om plasmide persistentie onder verschillende omstandigheden te bestuderen.
<ol><li>Ontwerp van een evolutie experiment te volgen plasmide frequentie na verloop van tijd (Figuur 2)<ol>
<li>Plaat de geconstrueerde plasmide-dragende stam (E. coli MG1655 pCon) op lb agar platen aangevuld met antibiotica (kanamycine 25 μg/ml) en incuberen 's nachts bij 37 °c.</li>
		<li>Bereid 96 diep-goed platen met 1 mL LB medium in elke put. Als de bacteriële voor ouders, kies acht willekeurige geïsoleerde kolonies van de agar plaat in onafhankelijke putten. Inbroed de platen bij 37 °C en 450 RPM op een plaat Shaker voor 24 uur. bereid een bevroren glycerol kolf van de voorouderlijke klonen.</li>
		<li>De volgende dag brengen de acht replicaatpopulaties over naar nieuwe diepliggende platen volgens het experimentele ontwerp (Figuur 2). De culturen worden verdund 1:100 (grote knelpunt, L), 1:1000 (medium knelpunt, M), of 1:10000 (kleine knelpunt, S) in een totaal volume van 1 mL LB met PBS voor verdunning. De verdunde culturen worden beide geïnfiltreerd bij 37 °C en 20 °C. Opmerking: het is zeer belangrijk om te controleren op kruisbesmetting in de 96-Deep-well plate. Gebruik dus een dambord plaat ontwerp door het intercaleren van geënt putten met bacterievrij LB medium. Gebruik dit patroon door het hele evolution-experiment.</li>
		<li>De op 37 °C geïnde culturen worden elke 12 uur overgebracht, terwijl de culturen bij 20 °C elke 24 uur worden overgebracht. Opmerking: tijdens elke overdrachts gebeurtenis wordt de knelpunt grootte behandeling toegepast en wordt de seriële overdracht herhaald over een totaal van 98 overdrachten. Het aantal overdrachten is afhankelijk van het experimentele ontwerp van de lezers.</li>
		<li>Bereid een bevroren glycerol kolf van alle populaties regelmatig, 2x per week.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitoring van de plasmide frequentie door replica plating (Figuur 3) Opmerking: tijdens het Evolution-experiment wordt de frequentie van plasmide dragende cellen in de populatie geschat op basis van het aantal hosts. Het protocol voor het plateren van replica's wordt weergegeven in afbeelding 3.<ol>
<li>Om de plasmide frequentie in de populatie tijdens het Evolution-experiment te bepalen, worden stationaire culturen op een seriële wijze verdund en verguld op niet-selectieve LB agar-platen. Pas de verdunning aan volgens een opbrengst van 250-500 kolonies per plaat. Opmerking: bereid dikke LB agar-platen vóór de beplating (~ 30 mL agar).</li>
		<li>De geplateerde populaties worden geïnineerd voor een nachtelijke groei op basis van hun groei temperatuur in het experiment. Let op: de kolonies moeten klein zijn, dus inbroed < 24 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Na de nachtelijke groei, tellen alle kolonies met behulp van een handmatige of geautomatiseerde kolonie Count station en bereken de totale bacterie populatiegrootte in de culturen. Opmerking: kolonies aan de rand van de agar-plaat mogen niet in het totale aantal bacteriële cellen worden opgenomen.</li>
		<li>Steriliseren vierkante stukken (~ 20 x 20 cm) van katoen fluweel door autoclaven. Opmerking: de fluwelen doek moet 100% katoen zijn om autoclaveerbaar te zijn. Het is belangrijk om het doek na sterilisatie te drogen.</li>
		<li>Na sterilisatie van de fluwelen doek, plaats het doek op een ronde blok en bevestig het met een metalen ring. Het is cruciaal om rimpels te voorkomen. Plaats de plaat voorzichtig met de gekweekte kolonies (agar naar beneden gericht) op het vaste fluwelen doek oppervlak. Zorg ervoor dat alle kolonies het fluwelen oppervlak aanraken door de Petri schaal op een ronde manier zorgvuldig te tikken.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de LB agar plaat en plaats een selectief bord aangevuld met antibiotica (kanamycine 25 μg/mL) op de fluwelen doek. Zorg ervoor dat de plaat alle fluweel aanraakt door voorzichtig op de Petri schaal te tikken zoals eerder beschreven. Verwijder daarna de plaat. Laat de platen bij kamertemperatuur staan voor een nachtelijke groei.</li>
		<li>De volgende dag, evalueer zowel de LB agar plaat en de selectieve plaat. Kolonies die groeien op de selectieve media worden geteld als plasmide hosts (dat wil zeggen, antibiotica resistent), terwijl kolonie-vrije vlekken zijn kolonies die plasmide vrij waren en zijn dus niet resistent tegen het antibioticum (dat wil zeggen, verloor het plasmide). Dit wordt gedaan door de platen over elkaar te plaatsen en de groei te vergelijken (d.w.z. alle ontbrekende kolonies markeren) en het kolonie nummer op beide platen te tellen. Dit levert het aantal cellen op dat tijdens het Evolution-experiment het plasmide verloor.</li>
		<li>Herhaal deze procedure op regelmatige wijze over het hele evolutie-experiment (bijv. elke 14 overdrachten).</li>
	</ol></li>
</ol>3. visualisatie van plasmide multimers met behulp van gel elektroforese
Opmerking: plasmide extractie van laag-Copy plasmiden leidt vaak tot besmetting met hostchromosomaal DNA dat voorafgaand aan visualisatie enzymatisch moet worden verteerd.
<ol><li>Extract plasmide DNA uit een stationaire celkweek van 5 mL met alkalische lysis zoals beschreven in stap 1,5.</li>
	<li>Behandel daarna het geëxtraheerde plasmide DNA met een ATP-afhankelijke DNase die alleen chromosomen DNA snijdt om chromosomale DNA-besmetting te verwijderen (Zie tabel met materialen). Inincuberen bij 37 °C gedurende 30 min. Reinig daarna het DNA met een Kit naar keuze.</li>
	<li>Om open cirkel moleculen van alle plasmide conformaties (monomeren of multimers) te maken, inbroed de plasmide DNA monsters met een picknicken enzym (nb. bsrdi) en inbroed gedurende 30 minuten bij 65 °c.</li>
	<li>Parallel, om lineaire plasmide moleculen (d.w.z. voor plasmide grootte vergelijking) te maken, gebruikt u een restrictie-enzym van uw keuze (bijv. hindiii) dat het plasmide één keer Slaid. Opmerking: Dit resulteert in lineaire DNA-plasmide monomeren. Open cirkel moleculen migreren niet op een lineaire manier.</li>
	<li>Om de grootte en de conformatie van de plasmide te visualiseren, elektroforese de verkreukeld en lineaire plasmide DNA monsters voor 120 min bij 4,3 V/cm in een 1% (w/V) agarose gel en 1 × TAE buffer. De monsters zijn gekleurd met Midori Green en de gel wordt gevisualiseerd op een gelbeeldvormings systeem (Zie tabel met materialen). Gebruik een 1 KBP ladder.</li>
</ol>

<ol><li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li>
<li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+crassostreae%2C+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li>
<li>von Wintersdorff, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).</li>
<li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li>
<li>De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+plasmid+evolution+results+in+host-range+expansion+of+a+broad-host-range+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid.</a> Genetics. 178 (4), 2179-2190 (2008).</li>
<li>Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+compensatory+evolution+stabilizes+plasmids+across+the+parasitism-mutualism+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum.</a> Current Biology. 25 (15), 2034-2039 (2015).</li>
<li>Bouma, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+bacteria%2Fplasmid+association%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of a bacteria/plasmid association.</a> Nature. 335 (6188), 351-352 (1988).</li>
<li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+nonselective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Loftie-Eaton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mutations+improve+general+permissiveness+to+antibiotic+resistance+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids.</a> Nature Ecology & Evolution. 1 (9), 1354-1363 (2017).</li>
<li>Millan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+and+compensatory+adaptation+interact+to+stabilize+non-transmissible+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-11 (2014).</li>
<li>Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+real-time+quantitative+PCR+as+tools+for+assessing+plasmid+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5439-5446 (2014).</li>
<li>Münch, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+fixation+of+plasmids+during+recombinant+protein+production+in+Bacillus+megaterium+results+in+population+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (17), 5976-5986 (2015).</li>
<li>Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Summers, D. K., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimerization+of+high+copy+number+plasmids+causes+instability%3A+ColE1+encodes+a+determinant+essential+for+plasmid+monomerization+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability.</a> Cell. 36 (4), 1097-1103 (1984).</li>
<li>Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+plasmid+instability%3A+the+dimer+catastrophe+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis.</a> Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Ilhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregational+drift+and+the+interplay+between+plasmid+copy+number+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability.</a> Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).</li>
<li>Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+exact+localization+of+the+neomycin+phosphotransferase+gene+from+transposon+Tn5%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5.</a> Gene. 19 (3), 327-336 (1982).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol presenteren we een aanpak die technieken in moleculaire biologie, experimentele evolutie en DNA-visualisatie combineert om de rol van plasmide evolutie voor de persistentie van antibioticaresistentie bij bacteriën te onderzoeken. Hoewel de gepresenteerde aanpak methoden van verschillende onderzoeksgebieden combineert, zijn alle toegepaste technieken eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd in een standaard laboratorium voor microbiologie.
De meest kritische stappen in het protocol omvatten de constructie van de modelsysteem stam die de genetische validering van het plasmide dragende genotype omvat. In het bijzonder coderen veel plasmiden natuurlijk antibioticaresistentiegenen. De lezer kan dus stap 1 van het protocol weglaten en direct doorgaan met stap 2. Vervolgens moeten de evolutie experimenten een willekeurig ontwerp van replicaatpopulaties bevatten, zodat de resultaten niet bevooroordeeld zijn door de positie van de replicaatpopulaties in de diepe-put-plaat. Daarnaast is het vooral belangrijk om de seriële Transfer-en verdunnings stappen in het Evolution-experiment zorgvuldig uit te voeren, omdat besmetting de resultaten zou vervalsen. Ten slotte, replica plating moet worden uitgevoerd met grote zorgvuldigheid. Grote kolonie grootte kan een probleem zijn, maar het kan worden vermeden door het inbroed van de platen voor minder dan 24 h. Evenzo, het aantal kolonies op een plaat kan bias replica plating resultaten. Daarom moeten populaties worden verdund voorafgaand aan het plating en replicatie.
Een van de grootste voordelen van onze aanpak is dat deze eenvoudig kan worden gereproduceerd zonder de noodzaak van zware apparatuur. Bovendien, een ander voordeel van replica plating te volgen marker genen is dat alleen levende cellen worden geëvalueerd, in tegenstelling tot flow flowcytometrieonderzoeken of qPCR waarin dode cellen kunnen worden geëvalueerd als levend. Dus, replica plating introduceert minder bias voor het tellen van plasmide dragende cellen. Niettemin, een beperking van de replica plating kan de grootte van de bevolking (dat wil zeggen, Cell Number) dat is mogelijk om te evalueren in een experimentele run.
Met behulp van onze aanpak hebben we onlangs laten zien dat plasmide stabiliteits evolutie de persistentie van antibioticaresistentiegenen in bacteriën potentieert. Zo ontwikkelden we een aanpak als een instrument om plasmide gemedieerde resistentie persistentie te volgen, die van groot belang is om resistentie na verloop van tijd te volgen, vooral onder omstandigheden zonder de aanwezigheid van antibiotica.

Plasmiden zijn circulaire, zelfreplicerende genetische elementen die alomtegenwoordig zijn in prokaryoten. Ze zijn agenten van laterale genoverdracht, omdat ze eigenschappen kunnen overdragen tussen microbiële populaties, en dus worden beschouwd als een belangrijke rol in de microbiële evolutie. Plasmiden zijn bestuurders van snelle aanpassing aan groeibeperkende voorwaarden gedurende korte tijd (bijvoorbeeld in aanwezigheid van antibiotica of pesticiden1) en zijn verantwoordelijk voor de lange termijn overgang naar andere lifestyle-modi (bijv. het ontstaan van pathogeniteit2). De meest opvallende voorbeelden voor de impact van plasmiden op overdracht van genen worden gedocumenteerd in ecosystemen die blootgesteld zijn aan fluctuerende niveaus van antibiotica, zoals medische klinieken of in industriële boerderijen3. Als gevolg van sterke positieve selectie, veel plasmiden coderen voor antimicrobiële resistentiegenen en worden vaak gevonden om te verlenen van multiresistance aan hun bacteriële gastheer. Plasmiden maken migratie mogelijk tussen populaties of bacteriesoorten, wat resulteert in een snelle vermeerdering van meervoudige antimicrobiële resistentie. Onder niet-selectieve omstandigheden zijn plasmiden niet essentieel voor de cel en worden ze vaak zelfs parasitaire elementen genoemd. Niettemin, plasmiden zijn alomtegenwoordig in de natuur en hun evolutie is zeer verweven met die van bacteriële chromosomen. Plasmide persistentie in natuurlijke omgevingen (fluctuerend en niet-selectief) blijft slecht begrepen, maar het is van groot belang voor ons begrip van de persistentie van antibioticaresistentiegenen in de natuur.
Experimentele evolutie is een krachtig hulpmiddel voor de studie van microbiële populaties4. Experimentele evolutie toonde aan dat het opleggen van een sterke selectie voor plasmide onderhoud leidt tot compenserende (d.w.z. adaptieve) evolutie van het plasmide of gastheer-chromosoom die de kosten van plasmide fitness vermindert en, op zijn beurt, plasmide overvloed vergemakkelijkt (d.w.z. plasmide persistentie)5,6,7. Dus, na de plasmide-host interactie na verloop van tijd kan belangrijke mechanismen van de aanpassing van beide elementen te onthullen. Bovendien, experimentele evolutie maakt het mogelijk om te kwantificeren de overvloed van plasmide dragende cellen in de tijd onder verschillende omstandigheden8,9,10.
Plasmide persistentie in evolutie experimenten kan worden bewaakt door verschillende strategieën, waaronder Flowcytometrie door fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS)11, kwantitatieve PCR (qPCR)11, of in teelt-gebaseerde methoden. Flow cytometrie vereist een FACS machine en de introductie van een detecteerbaar (fluorescerende) marker gen, zoals het groene fluorescerende eiwit (GFP), op het plasmide. Echter, GFP expressie kan verschillende cellulaire eigenschappen veranderen en verder beïnvloeden de plasmide locatie in de cel12, die op zijn beurt kan invloed hebben op plasmide erfenis tijdens celdeling. Een qPCR-benadering voor het meten van plasmide overvloed kan zeer bevooroordeeld zijn door het plasmide kopie nummer, die sterk kan variëren langs bacteriële groeifase en na verloop van tijd13. Tot slot vereist een benadering op basis van cultuur en plating de introductie van een selecteerbaar marker gen. Dit kan een antibiotica-resistentie-gen zijn, dat vaak wordt gecodeerd op natuurlijke plasmiden; Er is dus geen genetische manipulatie nodig. Antibioticaresistentie kan worden gevolgd door een traditionele replica plating aanpak. Dus, om te studeren natuurlijke plasmide dynamiek, replica plating is zeer geschikt voor het bewaken van plasmide gecodeerde antibiotica resisitance14.
Om plasmide moleculen te visualiseren (bijv. om de plasmide grootte te evalueren) kunnen verschillende methoden worden toegepast. Hele plasmiden kunnen worden versterkt met behulp van een PCR-gebaseerde benadering. Dit vereist echter het ontwerp van specifieke primers, die een uitdaging kunnen zijn tijdens een evolutie-experiment, omdat de plasmide sequentie na verloop van tijd kan veranderen. Bovendien is het moeilijk om plasmide multimers te versterken in een PCR-gebaseerde benadering door meerdere bindingsplaatsen voor de PCR-primers. Multimere plasmide moleculen kunnen verschijnen na plasmide replicatie beëindiging of door recombinatie van plasmide moleculen en zijn meestal georiënteerd kop-tot-staart15. Een andere benadering van plasmide visualisatie combineert enzymatische vertering van plasmide moleculen door DNA-enzym die ofwel klieven of Nick een plasmide DNA-streng met agarose gel elektroforese analyse. Hetzelfde plasmide van verschillende groottes (bijv. monomeren versus multimers) resulteert in verschillende gelmobiliteiten die kunnen worden waargenomen bij het visualiseren van de plasmide moleculen. Deze aanpak maakt visualisatie en kwantificering van verschillende plasmide conformaties (d.w.z. multimerization toestanden) mogelijk. De plasmide conformatie kan worden gebruikt als indicator van plasmide stabiliteit, omdat plasmide multimers vaak verloren gaan tijdens Cell Division16.
In een recent werk volgden we plasmide persistentie in omstandigheden die niet selectief waren voor plasmide overvloed (d.w.z. zonder antibiotica selectie). We vergeleek plasmide persistentie bij twee verschillende temperaturen (20 °C en 37 °C) en drie bevolkings grootten (d.w.z. verdunnings percentages). Door verschillende verdunnings percentages of bevolkings knelpunten toe te passen kan het onderzoek naar de invloed van de bevolkingsomvang op de bacteriële en plasmide evolutie worden onderzocht. Op basis van onze resultaten stellen we voor dat plasmiden neutraal kunnen zijn voor hun bacteriële gastheer en de stabiliteit kunnen evolueren zonder enige selectiedruk8. De geëvolueerde plasmide stabiliteit wordt verleend door de reductie van de plasmide multimer formatie8.
Hier presenteren we een protocol voor de kwantificering van plasmide persistentie en onderzoek naar plasmide evolutie met betrekking tot het behoud van antibioticaresistentiegenen. De methode heeft verschillende stappen, met inbegrip van het inbrengen van een antibioticumresistentie gen aan een model plasmide (die kan worden weggelaten bij gebruik van een natuurlijke resistentie plasmide), gevolgd door het gebruik van experimentele evolutie om te beoordelen van het potentieel van het plasmide te behouden onder niet-selectieve omstandigheden tijdens het bepalen van de plasmide frequentie dynamiek in de tijd met behulp van replica plating, en de analyse van het plasmide genoom door visualisatie. Het hier beschreven protocol is ontworpen om de evolutie en persistentie van plasmiden te onderzoeken, maar het kan ook worden toegepast om de evolutie van de chromosoom resistentiegenen (of andere marker genen) na verloop van tijd te volgen.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>96-deep-well plates</td>
 <td>Starlab</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-deep-well plates</td>
 <td>Roth</td>
 <td>EN07.1</td>
 <td>2 ml, vierkant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-deep-well plates (cryo)</td>
 <td>Starlab</td>
 <td>E1702-8400</td>
 <td>Micro-Dilution Tube System</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Colony counter</td>
 <td>Stuart</td>
 <td>SC6+</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton velvet</td>
 <td>drapery shop</td>
 <td></td>
 <td>100 % katoen vereist</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electrophoresis chamber</td>
 <td>BioRad</td>
 <td></td>
 <td>Agarose gel electrophoresis</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electrophoresis power supply</td>
 <td>BioRad</td>
 <td>1645070</td>
 <td>Agarose gel electrophoresis</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporation cuvettes</td>
 <td>BioRad</td>
 <td>1652089</td>
 <td>0.1 cm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>BioRad</td>
 <td>1652660</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>K0832</td>
 <td>PCR fragment clean-up</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>K0503</td>
 <td>Plasmid extraction kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gibson Assembly</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>E2611S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Incubator</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>50125852</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Incubator (plate shaker)</td>
 <td>Heidolph</td>
 <td>1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Incubator (shaker)</td>
 <td>New Brunswick Scientific</td>
 <td>Innova 44</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inoculating loops</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-channel pippetes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>3125000052, 3125000028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-channel pippetes</td>
 <td>Capp</td>
 <td>ME8-1250R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 2000/2000c</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>ND2000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oligonucleotides</td>
 <td>Eurofines</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion Polymerase</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>F533S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PlasmidSafe enzyme</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>10059400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reaction tubes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>30125150</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Replica block & metal ring</td>
 <td>VWR</td>
 <td>601-3401</td>
 <td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Resctriction enzymes</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermocycler</td>
 <td>BioRad</td>
 <td>T100</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
```

kwantificering van plasmide gemedieerde antibioticaresistentie in een experimentele evolutie benadering

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmiden spelen een belangrijke rol in microbiële ecologie en evolutie als voertuigen van laterale genoverdracht en reservoirs van accessoire-genfuncties in microbiële populaties. Dit is met name het geval bij snel veranderende omgevingen zoals fluctuerende antibiotica blootstelling. We hebben onlangs laten zien dat plasmiden de genen van antibioticaresistentie in Escherichia coli behouden zonder positieve selectie voor de plasmide aanwezigheid. Hier beschrijven we een experimenteel systeem dat het mogelijk maakt om zowel het plasmide genotype als het fenotype te volgen in lange termijn evolutie experimenten. We gebruiken moleculaire technieken om een model plasmide te ontwerpen die vervolgens wordt geïntroduceerd in een experimentele evolution batch-systeem benadering in een E. coli -host. We volgen de plasmide frequentie na verloop van tijd door het toepassen van replica plating van de E. coli populaties tijdens het kwantificeren van de antibioticaresistentie persistentie. Daarnaast monitoren we de conformatie van plasmiden in gastheer cellen door het analyseren van de omvang van plasmide multimer vorming door plasmide picknicken en agarose gel elektroforese. Een dergelijke aanpak stelt ons in staat om niet alleen de genoom grootte van veranderende plasmiden te visualiseren, maar ook hun topologische conformatie-een factor die zeer belangrijk is voor plasmide overname. Ons systeem combineert moleculaire strategieën met traditionele microbiologie benaderingen en biedt een set-up om plasmiden in bacteriële populaties gedurende een lange tijd te volgen. De gepresenteerde aanpak kan worden toegepast om in de toekomst een breed scala aan mobiele genetische elementen te bestuderen.

Hier presenteren we een benadering voor het bestuderen van plasmide evolutie door plasmide persistentie in een populatie te kwantificeren. Ten eerste laten we zien hoe het bouwen van de plasmide dragen E. coli stam MG1655 pCon die vervolgens wordt geïntroduceerd om een evolutie experiment. Ten tweede presenteren we een eenvoudige methode om de overvloed aan plasmide te volgen in de zich ontwikkelende bacteriële populaties. Ten slotte laten we zien hoe plasmide molecuul grootte en conformatie te visualiseren.
In ons vorige werk8 met behulp van de gepresenteerde aanpak voerden we een evolutie experiment na de persistentie van antibioticaresistentie plasmiden in E. coli bij afwezigheid van antibiotica (Figuur 4). Onze representatieve resultaten tonen de evolutie van populaties bij 37 °C en een verdunnings percentage van 10-4. Na de overvloed aan plasmide dragende cellen, observeerden we in de loop van de tijd een afname van de frequentie plasmide ontvangende cellen (Figuur 4). Onze aanpak stelde ons in staat om te ontdekken dat het plasmide verlies het gevolg was van de gecondenseerde plasmide genoom architectuur, die leidde tot plasmide instabiliteit veroorzaakt door conflicten geïntroduceerd door transcriptie van het Verzets gen en replicatie van het plasmide zelf. Door het visualiseren van de plasmide moleculen konden we ontdekken dat deze conflicten leidden tot een instabiele plasmide conformatie (d.w.z. plasmide multimer formatie, Figuur 5). Niettemin, we waargenomen plasmide stabiliteits evolutie zonder de blootstelling aan antibiotica (Figuur 4). De geëvolueerde stabiliteit werd verleend door een plasmide intrinsieke duplicatie die de transcriptie-replicatieconflicten afgeschaft en leidde tot de vorming van stabiel geërfd plasmiden. Onze resultaten tonen dus het belang van recombinatie en genoom versterking in adaptieve evolutie van genetische elementen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> Figuur 1: plasmide ontwerp van pCON. Schematische weergave van de kloon strategie die wordt gebruikt om het plasmide pCON te bouwen. De plasmide backbone (pBBR1) en het antibioticumresistentie-gen (nptii) zijn PCR-versterkt en gefuseerd door isotherme Fusion20. Dit levert de plasmide pCON en de stam MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> Figuur 2: ontwerp van het lange termijn evolutie experiment. Schematische weergave van de seriële overdracht experiment. De plasmide-dragende (pCON) populaties worden geplateerd op selectieve media. Voorouderlijke kolonies worden willekeurig uit de plaat gekozen en geïntroduceerd in een seriële transfersysteem. De overdrachten worden uitgevoerd met drie verschillende verdunnings benaderingen om bevolkings bottlenecks van verschillende groottes te simuleren. De verdunningen worden sereen herhaald. Het experiment wordt uitgevoerd in twee temperatuur regimes. De plasmide-host frequentie wordt gemeten langs het experiment via replica plating. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> Figuur 3: replica plating. Schematische weergave van de stappen die worden gebruikt in replica plating van bacteriële populaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> Figuur 4: representatieve pCON-frequentie in de loop van de tijd. pCON persistentie wordt weergegeven als het aantal hosts (representatieve replicaten) tijdens het Evolution-experiment. Voor 98 overdrachten evolueerden pCON plasmide populaties onder niet-selectieve omstandigheden met een verdunningsfactor van 10-4. Alle replicaten die de plasmide pCON dragen daalden in de populatie. Daarna werden de populaties blootgesteld aan antibiotica voor een nachtelijke incubatie en werden ze opnieuw gekweekt onder niet-selectieve omstandigheden om te testen op de evolutie van plasmide stabiliteit. Dit cijfer is gewijzigd van Wein et al.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> Figuur 5: representatieve analyse van de plasmide conformatie. Visualisatie van het model plasmide pCON. Gevisualiseerd is het onbehandelde plasmide DNA direct na het uitpakken, gelineariseerd plasmide DNA, en behandeld met DNase die alleen chromosomaal DNA snijdt, evenals enzymatisch verkreukeld DNA (dat wil zeggen, open cirkel plasmide DNA). Linearizing the plasmide toont aan dat alle plasmiden van dezelfde grootte zijn. Het verwijderen van chromosomaal DNA en picknicken pCon onthult de aanwezigheid van Dimeren en andere multimers. Dit cijfer is gewijzigd van Wein et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Onze experimentele aanpak biedt een strategie om plasmide overvloed en antibioticaresistentie na verloop van tijd te volgen in bacteriële populaties.

Kwantificering van plasmide gemedieerde antibioticaresistentie in een experimentele evolutie benadering

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Plasmiden zijn extrachromosomale elementen die alomtegenwoordig zijn in de meeste bacteriële soorten en habitats waar ze zeer belangrijke middelen van laterale genoverdracht zijn omdat ze kunnen migreren tussen cellen en tussen populaties. Een van de meest opvallende en prominente voorbeelden van een dergelijke overdracht is de verspreiding van antibioticaresistentie genen die zijn gecodeerd op plasmiden. Om een model plasmide te bouwen dat een gen van de resistentie van antibiotica codeert, kiest u een plasmidbackbone en versterken PCR de ruggengraat met behulp van een high fidelity polymerase en primers die binden aan de plasmidesjabloon. In ons geval gebruikten we een pBBR1 plasmid backbone. Vervolgens versterken van de weerstand gen nptII met inbegrip van de inheemse Tn5 promotor met behulp van een high fidelity polymerase. Ontwerp de primers voor het resistentiegen met ongeveer 20 basisparen sequentie complementariteit aan de plasmide ruggengraat. Na de PCR's, zekering van de homologie regio van de gezuiverde weerstand gen PCR product aan de gezuiverde plasmid ruggengraat met behulp van isothermale assemblage op 50 graden gedurende 60 minuten. Zet het gesmolten product om in E.Coli DH5-Alpha met behulp van elektroporatie. Plaat 100 microliter van het mengsel op selectieve media en incubeer op 37 graden gedurende ongeveer 24 uur. De plasmide kan vervolgens worden geëxtraheerd, gevalideerd en omgezet in de E.coli wilde type stam MG1655. Dit levert stam MG1655 pCON.Tijdens blootstelling aan antibiotica, bacteriën moeten de plasmide om te overleven. Zo is de plasmide onder positieve selectie. Onder niet-selectieve omstandigheden, dus zonder antibiotica, is de plasmide wegwerpbaar voor de cel. Het doel van onze studie was om de plasmiden te volgen onder dergelijke niet-selectieve omstandigheden in de tijd. Hiervoor hebben we de kleine plasmiden uitgerust met een antibioticaresistentiegen en het geïntroduceerd bij Escherichia coli. We voerden een evolutionair experiment uit en controleerden de plasmidenfrequentie via replica plating. De plasmide dragende stam mg1655 pCON wordt nu geïntroduceerd in een evolutie-experiment. Ten eerste, plaat mg1655 pCON op LB agar platen aangevuld met antibiotica en incubeer 's nachts op 37 graden. Kies uit deze plaat willekeurig de 8 voorouderkolonies en broeder 's nachts bij 37 graden met constant schudden. Op de volgende dag, worden de bevolking overgebracht naar het experiment dat in 96 diepe putplaten wordt uitgevoerd. Het is zeer belangrijk om willekeurig verdelen de replica's over de plaat. Bijvoorbeeld in een checkerboard aanpak. In ons experiment worden de culturen verdund en overgedragen met verschillende verdunningspercentages en in twee temperaturen. Tijdens elke overdracht wordt de verdunningsbehandeling toegepast en wordt de seriële overdracht herhaald over een totaal van 98 overdrachten. Langs het evolutieexperiment wordt de frequentie van plasmiden in de bevolking geschat van het aandeel plasmide dragende cellen. Replica plating werd gepopulariseerd door Esther en Joshua Lederberg in de jaren 1950, waar ze het gebruikten om resistentie tegen geneesmiddelen in bacteriën te bestuderen. De methode zal hen in staat stellen om hun scannen voor fenotypen op te schalen en aan het einde van de studie bleek dat penicillineresistentie kan ontstaan in bacteriën als gevolg van spontane mutaties in het genoom. Om de plasmidefrequentie in de bevolking tijdens het experiment te bepalen, worden stationaire culturen serieel verdund en verguld op niet-selectieve LB agarplaten. Pas de verdunning aan op basis van een opbrengst van 250 tot 500 kolonies per plaat. De vergulde populaties zijn geïncubeerd voor 's nachts groei op 37 graden voor minder dan 24 uur. Kolonies kunnen het best worden gerepliceerd als ze nog klein zijn. Na nachtgroei tellen alle kolonies met behulp van een geautomatiseerde kolonie teller van de keuze van de lezer. Dit levert de totale omvang van de bacteriënpopulatie in de culturen op. Houd er rekening mee dat kolonies aan de rand van de plaat moeten worden weggelaten. Om de platen te repliceren, moet u selectieve agar platen aangevuld met antibiotica, een rond blok, een metalen ring die het blok past, en steriele fluwelen doek. Het doek moet 100% katoen zijn, omdat dit gesteriliseerd kan worden door autoclavatie. Leg de doek op het blok en bevestig het met de metalen ring.Plaats de plaat voorzichtig met de getelde kolonies op het vaste fluwelen doekoppervlak. Tik op de plaat in cirkelbewegingen, zodat al het plaatoppervlak de doek raakt. Het is heel belangrijk dat alle kolonies het fluweel aanraken. Verwijder de LB-plaat en plaats de selectieve plaat op het fluweel. Herhaal het voorzichtig tikken. Het is opnieuw belangrijk dat de plaat het fluweel volledig raakt. Verwijder daarna de selectieve plaat. De platen worden 's nachts bij kamertemperatuur geïncubeerd. De volgende dag zijn zowel de LB als de antibioticaplaat nodig voor evaluatie. Plaats de platen boven elkaar en vergelijk de groei. U gemakkelijk kolonievrije ruimtes spotten. Dit zijn de kolonies die niet resistent zijn tegen de antibiotica. Zo verloren deze kolonies de plasmide. Op het einde, mark hoeveel kolonies ontbreken op de antibiotica plaat. Dit nummer geeft je het plasmide verlies. Herhaal de replica beplating van alle populaties tijdens de evolutie experiment wekelijks. Plasmide verlies kan worden veroorzaakt door plasmide multi misvorming. Bij het werken aan een plasmide constructie zeggen voor de expressie van een bepaald gen in uw voorkeur gastheer stam het inheemse gedrag van een plasmide in vivo met betrekking tot de bevestiging van een staat kan nemen is meestal iets dat over het hoofd wordt gezien. Maar in een evolutionaire context kan een dergelijke bevestiging van veranderingen van zeer groot belang zijn. De analyse van plasmide bevestigingen kan een zeer lastige onderneming. Vooral plasmide multimers zijn moeilijk te analyseren omdat ze niet goed kunnen worden geïdentificeerd door PCR of door sequencing. Aan de andere kant, plasmid multimers zijn moeilijk te analyseren door gel elektroforese vanwege hun potentieel grote omvang en hun langzame elektroforetische mobiliteit. Ons protocol biedt een eenvoudige en eenvoudige methode voor de screening en identificatie van plasmide multimers in ik zou zeggen elke gegeven plasmide voorbereiding. Om te visualplasmid moleculen extract de plasmide uit 5 mL stationaire nachtelijke celcultuur met behulp van alkalische lyse. Plasmid extractie van lage kopie plasmiden leidt vaak tot besmetting met gastheer chromosomale DNA dat moet worden verteerd voorafgaand aan visualisatie. Om chromosomale DNA-besmetting te verwijderen behandel het geëxtraheerde plasmide DNA met Plasmid-Safe

quantification-plasmid-mediated-antibiotic-resistance-an-experimental

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Source: Erdogan, F.,et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for transferring an F plasmid from donor to recipient E. coli cells using a rescue plasmid and selecting transconjugants through dual antibiotic resistance. The process includes mixing bacterial cultures, incubation without shaking, disrupting mating pairs, and plating on selective media to confirm...

F Plasmid Transfer and Dual Antibiotic Selection in E. coli

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

We beschrijven een goedkope, configureerbare morbidostat die de karakterisering van antibioticaresistentie mogelijk maakt door de medicijnconcentratie dynamisch aan te passen. Het apparaat kan worden geïntegreerd met een multiplex microfluïdisch platform. De benadering kan worden opgeschaald voor laboratoriumstudies naar antibioticaresistentie.

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.

De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Conjugatie bemiddelt horizontale genoverdracht door plasmide-DNA over twee verschillende cellen te mobiliseren, waardoor de verspreiding van nuttige genen wordt vergemakkelijkt. Dit werk beschrijft een veelgebruikte methode voor de efficiënte detectie van conjugatieve plasmideoverdracht, gebaseerd op het gebruik van differentiële markers in het conjugatieve plasmide, donor en ontvanger om transconjugatie te detecteren.

Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in E. coli

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de single-copy chromosomale complementatie van een effluxpompgen met behulp van een mini-Tn7-gebaseerd expressiesysteem in een gemanipuleerde efflux-deficiënte stam van Acinetobacter baumannii. Dit nauwkeurige genetische hulpmiddel maakt gecontroleerde genexpressie mogelijk, wat essentieel is voor de karakterisering van effluxpompen in multiresistente pathogenen.

Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem

Een toegankelijke, open-source microfluïdische workflow wordt gepresenteerd voor de geparallelliseerde analyse van plasmideretentie in bacteriën. Door fluorescentiemicroscopie toe te passen om de aanwezigheid van plasmide in eencellige microkolonies in gelmicrodruppels te kwantificeren, biedt deze methode een nauwkeurig, toegankelijk en schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.

Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Leer hoe u plasmiddynamiek en antibioticaresistentie in bacteriële populaties kwantificeert met behulp van experimentele evolutie en replica plating. Deze methode biedt inzicht in plasmidestabiliteit onder selectieve en niet-selectieve omstandigheden.

Kwantificering van plasmide gemedieerde antibioticaresistentie in een experimentele evolutie benadering

Meer video's verkennen