OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Onze enzymatische methode gebruikt eiwit oligomer met een gecontroleerd aantal polymerisatie graad. Het is een perfecte monstervoorbereiding voor single-molecule force spectroscopie studie evenals eiwit-gebaseerde materiaal constructie. Onze methode introduceert geen cysteïne in het doeleiwit.

Omdat cysteïne een van de belangrijkste functionele residuen voor eiwitten is, vergemakkelijkt het de bouw van gepolymeriseerde materie-eiwitten of enzymen. Het aantonen van de procedure zal Yibing Deng en Shengchao Shi, grad studenten van mijn laboratorium. Los om te beginnen 20 gram kaliumchromaat op in 40 milliliter ultrazuiver water in een beker.

Voeg langzaam 360 milliliter geconcentreerd zwavelzuur toe aan de kaliumdichromaatoplossing en gebruik een glazen staaf om zachtjes te roeren. Plaats een glazen coverslip in het chroomzuur en breng het naar een oven op 80 graden Celsius gedurende 30 minuten. Reinig de coverslip met water en vervolgens absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom van stikstof.

Dompel de coverslip volledig onder in 1% volume volume APTES tolueen oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Was eerst de coverslip met tolueen en vervolgens met absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom stikstof. Incubeer de coverslip bij 80 graden Celsius gedurende 15 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.

Gebruik een pipet om 200 microliter van een milligram per milliliter Sulfo-SMCC toe te voegen in DMSO-oplossing tussen twee geïmmobiliseerde coverslips en incubaat gedurende een uur beschermd tegen licht. Na een uur was je eerst de covers met DMSO en daarna met absolute ethylalcohol om de resterende Sulfo-SMCC te verwijderen. Droog de coverslip onder een stroom stikstof.

Pipette 60 microliter van 200 micromolar GL-ELP-50 cys-eiwit oplossing op een gefunctionaliseerde coverslip en incubaat bij 25 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur. Daarna was je de coverslip met ultrazuiver water om de niet-gereageerde GL-ELP-50-cys te verwijderen. Om het gefunctionaliseerde cantileveroppervlak voor te bereiden, dompel je eerst de cantilevers onder in chromisch zuur en reinig je de cantilevers op 80 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gebruik water en absolute ethylalcohol om het zuur weg te spoelen. Dompel de cantilever onder met 1% volume volume APTES tolueen oplossing om aminoverzilting uit te voeren in een plastic buis dop voor een uur. Spoel de cantilever met absolute ethylalcohol en bak de cantilever vervolgens 15 minuten op 80 graden Celsius.

Dompel de cantilever een uur onder in Sulfo-SMCC oplossing en spoel de cantilever vervolgens af met absolute ethylalcohol. Om de cys-ELP-50-NGL aan het oppervlak te koppelen, dompel je de cantilevers 1,5 uur onder in de cys-ELP-50-NGL met de maleimidegroep sulfo-SMCC. Was vervolgens de niet-gereageerde cys-ELP-50-NGL op de cantilever weg met ultrazuiver water.

Dompelen vervolgens een gefunctionaliseerde cantilever onder in een oplossing die 200 microliter van 50 micromolar GL-CBM-XDockerin eiwitoplossing met 200 nanomolar OaAEP1 bevat en plaats ze gedurende 20 tot 30 minuten op 25 graden Celsius. Gebruik dan de AFM-buffer om ongereacteerd eiwit weg te spoelen. Het is van cruciaal belang om ongereacteerd resteiwit weg te wassen voordat afm experimenteert, omdat het een samenhangend-dockerin paren en het blok van de cantilever zal vormen om nieuw eiwit op het oppervlak op te nemen.

Om het ligatie-apparaat samenhangend-T-L-eiwit van belang-NGL te koppelen aan de GL-ELP-50 geïmmobiliseerd op het coverslipoppervlak, voeg 15 microliter OaAEP1 toe aan de coverslip en laat het 30 minuten incuren. Gebruik 15 tot 20 milliliter AFM buffer om alle niet-gereageerd eiwitten weg te wassen. Voeg 100 microliter TEV-protease toe om de eiwiteenheid op de TEV-herkenningsplaats gedurende een uur bij 25 graden Celsius te klijpen.

Gebruik vervolgens 15 tot 20 milliliter AFM-buffer om resteiwitten weg te spoelen. Koppel het ligatie-apparaat cohesin-T-L-protein van belang-NGL gedurende 30 minuten aan het GL-ubiquitine-NGL glas van OaAEP1. Afhankelijk van eiwitconstructies gl-ubiquitine-NGL worden gebouwd op het glasoppervlak, herhaal de polyproteïne voorbereiding stappen n1 keer.

Laat de laatste TEV decolletéreactie weg op reservesdarm op het eiwitpolymeer als cohesin-TEV-L-ubiquitine-n-NGL glas. Voeg een milliliter AFM-buffer met 10 millimolar calciumchloride en vijf millimolar ascorbinezuur toe aan de AFM-vloeistofkamer. Kies de D-tip van de gefunctionaliseerde AFM-sonde voor het experiment.

Dompel de sonde onder in de AFM-buffer. Trek de cantilever met een constante snelheid van 400 nanometer per seconde van het oppervlak. In de tussentijd registreert u de krachtextensiecurve met een monstersnelheid van 4.000 hertz.

Gebruik de stelling van de uitrustingsartition om de cantilever in afm buffer te kalibreren met een nauwkeurige veerconstante K-waarde voor elk experiment. Bevestig de cantilever tip gefunctionaliseerd met dockerine aan het eiwit gedeponeerd oppervlak gefunctionaliseerd met samenhangende cohesine om de samenhangende dockerin paar te vormen. Open vervolgens JPK-gegevensverwerkingssoftware en selecteer de force extension curve met het karakteristieke zaagtand-achtig patroon en een hoge onthechtingskracht.

In deze studie hadden de NGL-residuen die door OaAEP1 ligatie tussen aangrenzende eiwitten werden geïntroduceerd geen invloed op de stabiliteit van eiwitmonomeer in het polymeer, uitgedrukt omdat de ontvouwende kracht en de toename van de contralengte vergelijkbaar waren met eerdere studie. De zuivering van de ferrische vorm rubredoxine gepresenteerd typische UV-gevisualiseerde absorptie pieken op 495 nanometer en 575 nanometer, terwijl de zinkvorm niet. SDS-pagina gel resultaten van de stapsgewijze spijsvertering en ligatie tonen samenhangende TEV-L-ubiquitine, het resultaat eiwit mengsel van TEV decolleté, pure GFP-TEV-protease, en purified product GL-ubiquitine.

Ook het cleaved GL-ubiquitine en cohesin-TEV-L-ubiquitin ligatiemengsel met of zonder OaAEP1 en pure OaAEP1 worden getoond. Het is van cruciaal belang om het oppervlak te functionaliseren met actieve Sulfo-SMCC voor succesvol peptide bevestiging. Hier bieden we een nieuwe methode om gepolymeriseerde eiwitten te bouwen.

Het vergemakkelijkt onderzoekers om complexe eiwit systeem met behulp van single-molecule kracht spectroscopie studie. Chromic zuur is sterk corrosief en zuur. Wees voorzichtig wanneer u zich voorbereidt en ermee omgaat.