Name: OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer een enzymatische methode voor polymerisatie van eiwitten met gecontroleerde sequentie voor single-molecule force spectroscopie. Deze techniek behoudt functionele residuen en opent nieuwe mogelijkheden voor eiwitgebaseerde materialen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) en Shuangchuang Programma van de provincie Jiangsu.

1. Eiwitproductie
<ol><li>
Genkloon
	<ol>
<li>Aankoopgenen codering voor het eiwit van belang (POI): Ubiquitine, Rubredoxin (RD)51, de cellulose-bindende module (CBM), dockerin-X domein (XDoc) en cohesie van Ruminococcus flavefacience, tabak etch virus (TEV) protease, elastine-achtige polypeptiden (ELP's).</li>
		<li>Voer polymerase kettingreactie uit en gebruik drie-beperking spijsverteringsenzymsysteem BamHI-BglII-KpnI voor het recombineren van het gen uit verschillende eiwitfragmenten.</li>
		<li>Bevestig alle genen door directe DNA-sequencing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expressie en productie van eiwitten
	<ol>
<li>Transformeer E. coli BL21(DE3) met de pQE80L-POI of pET28a-POI plasmid voor expressie.</li>
		<li>Kies één kolonie in 15 mL LB-medium met respectievelijke antibiotica (bijvoorbeeld 100 μg/mL ampicillin natriumzout of 50 μg/mL, kanamycine). Blijf de culturen schudden bij 200 tpm bij 37 °C gedurende 16-20 uur.</li>
		<li>Verdun de nachtculturen tot 800 mL LB medium (1:50 verdunning). Centrifugeer de cultuur bij 1.800 x gvoor rubredoxine en verwater vervolgens in 15 mL M9 mm ml M9 medium (aangevuld met 0,4% glucose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4) en verdun deze vervolgens tot 800 mL ML M9 medium.</li>
		<li>Incubeer de cultuur bij 37 °C terwijl u trilt bij 200 tpm, totdat de cultuur een optische dichtheid bereikt bij 600 nm (OD600) van 0,6. Bespaar 100 μL monster van de cultuur als de pre-inductie controle voor het testen van eiwitexpressie.</li>
		<li>Induceer eiwitexpressie door IPTG toe te voegen aan een eindconcentratie van 1 mM en schud de cultuur bij 37 °C bij 4 uur bij 200 tpm. Reserveer een monster van 100 μL van de cultuur als de post-inductiecontrole voor het testen van eiwitexpressie.</li>
		<li>Centrifugeer de cultuur bij 13.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °C en bewaar bij -80 °C voor zuivering. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zuivering van eiwit van belang
	<ol>
<li>Resuspend de cellen in 25 mL lysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 met DNase, RNase, PMSF) en gebruik een sonicator (15% amplitude) om het lyse voor 30 min op ijs.</li>
		<li>Verduidelijken van het cellysaat bij 19.000 x g voor 40 min bij 4 °C.</li>
		<li>Pack 1 mL (bedvolume) van Co-NTA of Ni-NTA affiniteit kolom en was de kolom met 10 kolom volumes (CV) van ultrazuiver water en vervolgens 10 CV's van wasbuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 7.4) door zwaartekracht stroom.</li>
		<li>Geef het eiwit supernatant door de kolom door de zwaartekracht stroom voor drie keer.</li>
		<li>Giet wasbuffer op de kolom met 50 cv's om vervuilende eiwitten weg te brengen.</li>
		<li>Elute het gebonden eiwit met 3 cv's van ijskoude elutie buffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 7.4). Als het gaat om rubredoxine eiwitten, verdere anion uitwisseling zuivering met behulp van anion uitwisseling kolom op pH 8,5 bij 4 °C is noodzakelijk.</li>
		<li>Analyseer het voorbeeld op SDS-PAGE.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Functionalisering van coverslip en cantilever oppervlak
<ol><li>
Gefunctionaliseerde coverslipoppervlakvoorbereiding
	<ol>
<li>Los 20 g kaliumchromaat op in 40 mL ultrazuiver water. Voeg langzaam 360 mL geconcentreerd zwavelzuur toe aan de kaliumchromaatoplossing met glazen staaf roer voorzichtig en bereid het chroomzuur voor. LET OP: De chemische stof die hier wordt gebruikt en het uiteindelijke chroomzuur is sterk corrosief en zuur. Werken met de juiste beschermingsmiddelen. De oplossing geeft warmte vrij bij het toevoegen van geconcentreerd zwavelzuur, wat betekent dat u langzaam toevoegt en de juiste pauze voor het afkoelen.</li>
		<li>Maak een glazen dekslip 30 m in 30 min schoon en activeer een glazen dekslip bij 80 °C door chromiczuurbehandeling. Dompel de coverslips volledig onder in 1% (v/v) APTES tolueenoplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur en beschermt ze tegen licht.</li>
		<li>Was de coverslip met tolueen en absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom stikstof.</li>
		<li>Incubeer de coverslip bij 80 °C gedurende 15 min en koel af tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/mL) toe aan dimethylsulfoxide (DMSO) oplossing tussen twee geïmmobiliseerde afdekkingen en uitbroed gedurende 1 uur beschermd tegen licht.</li>
		<li>Was eerst de coverslip met DMSO en vervolgens met absolute ethylalcohol om restsulfo-SMCC te verwijderen.</li>
		<li>Droog de coverslip onder een stroom stikstof.</li>
		<li>Pipet 60 μL van 200 μM GL-ELP50nm-C eiwitoplossing op een gefunctionaliseerde coverslip en uitbroeden voor ongeveer 3 uur.</li>
		<li>Was de coverslip met ultrazuiver water om de niet-gereageerde GL-ELP50nm-C te verwijderen. OPMERKING: Gefunctionaliseerde afdekkingen zijn ongeveer twee weken onder opslag bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gefunctionaliseerde cantilever oppervlaktevoorbereiding
	<ol>
<li>Maak de cantilevers 10 min 10 min schoon bij 80 °C door chromisch zuurbehandeling.</li>
		<li>Functionaliseer de cantilever door amino-silanisatie met 1% (v/v) APTES tolueenoplossing en bak de cantilever op 80 °C gedurende 15 min voordat u conjugeert tot sulfo-SMCC.</li>
		<li>Koppel de C-ELP50nm-NGL gedurende 1,5 uur aan de oppervlakte met de maleimidegroep sulfo-SMCC.</li>
		<li>Was de niet-gereageerde C-ELP50nm-NGL op de coverslip weg met ultrazuiver water.</li>
		<li>Dompel een gefunctionaliseerde cantilever onder in 200 μL van 50 μM GL-CBM-XDoc eiwitoplossing met 200 nM OaAEP1 bij 25 °C gedurende 20-30 min. Gebruik dan de AFM buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) om niet gereageerd eiwit weg te spoelen. LET OP: De oppervlaktechemie van de cantilevers en de coverslip zijn vergelijkbaar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Stapsgewijs polyproteïnepreparaat met gecontroleerde sequenties
<ol><li>Koppel de ligatie-eenheid Coh-tev-L-POI-NGL aan de GL-ELP50nm geïmmobiliseerd op het coverslipoppervlak door OaAEP1 gedurende 30 min.</li>
	<li>Gebruik 15-20 mL AFM buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) om niet gereageerde eiwitten weg te spoelen.</li>
	<li>Voeg 100 μL TEV protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glycerol, pH 8.0) toe om de eiwiteenheid op de TEV-herkenlocatie voor 1 uur bij 25 °C te splijten.</li>
	<li>Gebruik 15-20 mL AFM buffer om resteiwitten weg te spoelen.</li>
	<li>Koppel de ligatie-eenheid Coh-tev-L-POI-NGL gedurende 30 min aan de GL-Ub-NGL-Glass van OaAEP1.</li>
	<li>Herhaal stap 3,3 tot 3,5 N-1 keer om eiwitconstructie GL-(Ub)n-NGL op het glasoppervlak op te bouwen. Laat de laatste TEV decolletéreactie weg om cohesin eer op het eiwit-polymeer als Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass te reserveren.</li>
</ol>4. AFM Experiment meting en data-analyse
<ol><li>
METINGEN AFM
	<ol>
<li>Voeg 1 mL AFM buffer toe aan de kamer met 10 mM CaCl2 en 5 mM Ascorbic Acid.</li>
		<li>Kies de D-tip van de gefunctionaliseerde AFM-sonde voor het experiment. Gebruik de stelling van de equipartition om de cantilever in AFM-buffer vóór elk experiment te kalibreren met een nauwkeurige veerconstante(k)waarde.</li>
		<li>Bevestig de cantilever tip aan het monsteroppervlak om het cohesin/Dockerin-paar te vormen.</li>
		<li>Trek de cantilever in met een constante snelheid van 400 nm−s−1 van het oppervlak. Neem ondertussen de kracht-extensiecurve op met een monstersnelheid van 4000 Hz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gegevensanalyse
	<ol>
<li>Gebruik JPK-gegevensverwerking en selecteer force-extension traces.</li>
		<li>Gebruik software om de sporen te analyseren. Plaats de rondingen met de worm-achtige keten (WLC) model van polymeer elasticiteit en het verkrijgen van ontvouwende kracht en contour lengte toename voor individuele eiwit ontvouwen piek.</li>
		<li>Pas de histogrammen van ontvouwende krachten met het Gaussian-model om de meest waarschijnlijke waarden van ontvouwende kracht (<Fu>) en contourlengtetoename (<ΔLc>) te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben een protocol beschreven voor enzymatische biosynthese en immobilisatie van polyproteïne en geverifieerd de poly-eiwit ontwerp door AFM-gebaseerde SMFS. Deze methodologie biedt een nieuwe benadering voor het bouwen van het eiwitpolymeer in een ontworpen sequentie, die een aanvulling vormt op eerdere methoden voor polyproteïnetechniek en immobilisatie4,6,52,53,<sup class="xre...

Vergeleken met synthetische polymeren hebben natuurlijke multi-domein eiwitten een uniforme structuur met een goed gecontroleerd aantal en type subdomeinen1. Deze functie leidt meestal tot een verbeterde biologische functie en stabiliteit2,3. Veel benaderingen, zoals cysteïnegebaseerde disulfide bindingkoppeling en recombinante DNA-technologie, zijn ontwikkeld voor het bouwen van een dergelijk gepolymeriseerd eiwit met meerdere domeinen4,5,6,7. Echter, de voormalige methode resulteert altijd in een willekeurige en ongecontroleerde sequentie, en de laatste leidt tot andere problemen, met inbegrip van de moeilijkheid voor de overexpressie van giftige en grote eiwitten en de zuivering van complexe eiwitten met cofactor en andere delicate enzymen.
Om deze uitdaging aan te gaan, ontwikkelen we een enzymatische methode die eiwitmonomeer samenvoegt voor polymeer/polyproteïne op een stapsgewijze manier met behulp van een eiwitligase OaAEP1 gecombineerd met een protease TEV8,9. OaAEP1 is een strikte en efficiënte endopeptidase. Twee eiwitten kunnen in minder dan 30 min als Asn-Gly-Leu-sequentie (NGL) door twee termini van OaAEP1 in minder dan 30 min worden gekoppeld als het N-terminus gly-leuresiduen (GL) en de andere daarvan NGL-residuen10. Het gebruik van OaAEP1 leidt echter alleen om eiwitmonomeer te koppelen tot een eiwitpolymeer met een ongecontroleerde sequentie zoals de op cysteïne gebaseerde koppelingsmethode. Daarom ontwerpen we het N-eindpunt van de eiwiteenheid met een verwijderbare TEV protease site plus een leucine residu als ENLYFQ/G-L-POI. Vóór het TEV-decolleté zou de N-terminal niet deelnemen aan OaAEP1 ligatie. En dan worden de GL-resten bij N-terminus, die compatibel zijn met verdere OaAEP1-ligatie, blootgesteld na het TEV-decolleté. Zo hebben we een sequentiële enzymatische biosynthesemethode van poly-eiwit bereikt met een relatief goed gecontroleerde sequentie.
Hier kan onze stapsgewijze enzymatische synthesemethode worden gebruikt in polyproteïnemonsterbereiding, inclusief sequentiegestuurd en ongecontroleerd, en eiwitimmobilisatie voor enkelmolecuulstudies, vooral voor het complexe systeem zoals metalloproteïne.
Bovendien stellen afm-gebaseerde SMFS-experimenten ons in staat om de constructie en stabiliteit van het eiwitpolymeer op het niveau van één molecuul te bevestigen. Single-molecule krachtspectroscopie, met inbegrip van AFM, optische pincet en magnetische pincet, is een algemeen instrument in nanotechnologie om biomolecule mechanisch te manipuleren en hun stabiliteit te meten11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Single-molecule AFM is veel gebruikt in de studie van eiwit (on)vouwen21,22,23,24,25, de sterkte meting van receptor-ligand interactie26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 en metaalligand binding in metalloproteïne44,45,46,47,48,49,50 . Hier wordt single-molecule AFM gebruikt om de gesynthetiseerde polyproteïnesequentie te verifiëren op basis van het bijbehorende eiwitontvouwende signaal.

<table><tbody><tr><td>iron (III) chloride hexahydrate</td><td>Energy chemical</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>Zinkchloride</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>100.00%</td></tr><tr><td>calcium chloride hydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>99.9965% kristallijn aggregaat</td></tr><tr><td>L-Ascorbinezuur</td><td>Sigma Life Science</td><td></td><td>Bio Xtra, &ge;99.0%, kristallijn</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>&ge;99%</td></tr><tr><td>sulfosuccinimide-4-(N-maleïmidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>90%</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Macklin</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoëzuur)</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genes</td><td>Genscript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanowizard 4 AFM</td><td>JPK Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLCT cantilever</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mono Q 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC-systeem</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglas</td><td>Sail Brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Image System</td><td>Tanon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oaaep1-gemedeerde enzymatische synthese en immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor single-molecule force spectroscopie

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemische en bio-vervoegingstechnieken zijn de laatste jaren snel ontwikkeld en maken het mogelijk om eiwitpolymeren op te bouwen. Echter, een gecontroleerd eiwit polymerisatie proces is altijd een uitdaging. Hier hebben we een enzymatische methodologie ontwikkeld voor het stapsgewijs construeren van gepolymeriseerde eiwitten in een rationeel gecontroleerde sequentie. Bij deze methode is het C-eindpunt van een eiwitmonomeer NGL voor eiwitvervoeging met oaaep1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), terwijl het N-terminus een cleavable TEV (tabaksetch virus) decolletésite plus een L (ENLYFQ/GL) voor tijdelijke N-terminal bescherming was. Bijgevolg kon OaAEP1 slechts één eiwitmonomeer tegelijk toevoegen, waarna de TEV protease het N-terminus tussen Q en G afhakte om de NH2-Gly-Leu bloot te leggen. Dan is het apparaat klaar voor de volgende OaAEP1 ligatie. Het gemanipuleerde polyproteïne wordt onderzocht door het ontvouwen van individueel eiwitdomein met behulp van atomaire kracht microscopie-gebaseerde single-molecule kracht spectroscopie (AFM-SMFS). Daarom biedt deze studie een nuttige strategie voor polyproteïnetechniek en immobilisatie.

De NGL-residuen die door OaAEP1-ligatie tussen aangrenzende eiwitten worden geïntroduceerd, hebben geen invloed op de eiwitmonomeerstabiliteit in het polymeer, aangezien de uitvouwkracht (<Fu>), en contourlengtetoename (<ΔLc>) vergelijkbaar is met de vorige studie (figuur 1). Het zuiveringsresultaat van het rubredoxine-eiwit wordt weergegeven in figuur 2. Om te bewijzen dat het eiwit na TEV decolleté compatibel is met de volgende OaAEP1 lig...

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Onze enzymatische methode gebruikt eiwit oligomer met een gecontroleerd aantal polymerisatie graad. Het is een perfecte monstervoorbereiding voor single-molecule force spectroscopie studie evenals eiwit-gebaseerde materiaal constructie. Onze methode introduceert geen cysteïne in het doeleiwit.Omdat cysteïne een van de belangrijkste functionele residuen voor eiwitten is, vergemakkelijkt het de bouw van gepolymeriseerde materie-eiwitten of enzymen. Het aantonen van de procedure zal Yibing Deng en Shengchao Shi, grad studenten van mijn laboratorium. Los om te beginnen 20 gram kaliumchromaat op in 40 milliliter ultrazuiver water in een beker.Voeg langzaam 360 milliliter geconcentreerd zwavelzuur toe aan de kaliumdichromaatoplossing en gebruik een glazen staaf om zachtjes te roeren. Plaats een glazen coverslip in het chroomzuur en breng het naar een oven op 80 graden Celsius gedurende 30 minuten. Reinig de coverslip met water en vervolgens absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom van stikstof.Dompel de coverslip volledig onder in 1% volume volume APTES tolueen oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Was eerst de coverslip met tolueen en vervolgens met absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom stikstof. Incubeer de coverslip bij 80 graden Celsius gedurende 15 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.Gebruik een pipet om 200 microliter van een milligram per milliliter Sulfo-SMCC toe te voegen in DMSO-oplossing tussen twee geïmmobiliseerde coverslips en incubaat gedurende een uur beschermd tegen licht. Na een uur was je eerst de covers met DMSO en daarna met absolute ethylalcohol om de resterende Sulfo-SMCC te verwijderen. Droog de coverslip onder een stroom stikstof.Pipette 60 microliter van 200 micromolar GL-ELP-50 cys-eiwit oplossing op een gefunctionaliseerde coverslip en incubaat bij 25 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur. Daarna was je de coverslip met ultrazuiver water om de niet-gereageerde GL-ELP-50-cys te verwijderen. Om het gefunctionaliseerde cantileveroppervlak voor te bereiden, dompel je eerst de cantilevers onder in chromisch zuur en reinig je de cantilevers op 80 graden Celsius gedurende 10 minuten.Gebruik water en absolute ethylalcohol om het zuur weg te spoelen. Dompel de cantilever onder met 1% volume volume APTES tolueen oplossing om aminoverzilting uit te voeren in een plastic buis dop voor een uur. Spoel de cantilever met absolute ethylalcohol en bak de cantilever vervolgens 15 minuten op 80 graden Celsius.Dompel de cantilever een uur onder in Sulfo-SMCC oplossing en spoel de cantilever vervolgens af met absolute ethylalcohol. Om de cys-ELP-50-NGL aan het oppervlak te koppelen, dompel je de cantilevers 1,5 uur onder in de cys-ELP-50-NGL met de maleimidegroep sulfo-SMCC. Was vervolgens de niet-gereageerde cys-ELP-50-NGL op de cantilever weg met ultrazuiver water.Dompelen vervolgens een gefunctionaliseerde cantilever onder in een oplossing die 200 microliter van 50 micromolar GL-CBM-XDockerin eiwitoplossing met 200 nanomolar OaAEP1 bevat en plaats ze gedurende 20 tot 30 minuten op 25 graden Celsius. Gebruik dan de AFM-buffer om ongereacteerd eiwit weg te spoelen. Het is van cruciaal belang om ongereacteerd resteiwit weg te wassen voordat afm experimenteert, omdat het een samenhangend-dockerin paren en het blok van de cantilever zal vormen om nieuw eiwit op het oppervlak op te nemen.Om het ligatie-apparaat samenhangend-T-L-eiwit van belang-NGL te koppelen aan de GL-ELP-50 geïmmobiliseerd op het coverslipoppervlak, voeg 15 microliter OaAEP1 toe aan de coverslip en laat het 30 minuten incuren. Gebruik 15 tot 20 milliliter AFM buffer om alle niet-gereageerd eiwitten weg te wassen. Voeg 100 microliter TEV-protease toe om de eiwiteenheid op de TEV-herkenningsplaats gedurende een uur bij 25 graden Celsius te klijpen.Gebruik vervolgens 15 tot 20 milliliter AFM-buffer om resteiwitten weg te spoelen. Koppel het ligatie-apparaat cohesin-T-L-protein van belang-NGL gedurende 30 minuten aan het GL-ubiquitine-NGL glas van OaAEP1. Afhankelijk van eiwitconstructies gl-ubiquitine-NGL worden gebouwd op het glasoppervlak, herhaal de polyproteïne voorbereiding stappen n1 keer.Laat de laatste TEV decolletéreactie weg op reservesdarm op het eiwitpolymeer als cohesin-TEV-L-ubiquitine-n-NGL glas. Voeg een milliliter AFM-buffer met 10 millimolar calciumchloride en vijf millimolar ascorbinezuur toe aan de AFM-vloeistofkamer. Kies de D-tip van de gefunctionaliseerde AFM-sonde voor het experiment.Dompel de sonde onder in de AFM-buffer. Trek de cantilever met een constante snelheid van 400 nanometer per seconde van het oppervlak. In de tussentijd registreert u de krachtextensiecurve met een monstersnelheid van 4.000 hertz.Gebruik de stelling van de uitrustingsartition om de cantilever in afm buffer te kalibreren met een nauwkeurige veerconstante K-waarde voor elk experiment. Bevestig de cantilever tip gefunctionaliseerd met dockerine aan het eiwit gedeponeerd oppervlak gefunctionaliseerd met samenhangende cohesine om de samenhangende dockerin paar te vormen. Open vervolgens JPK-gegevensverwerkingssoftware en selecteer de force extension curve met het karakteristieke zaagtand-achtig patroon en een hoge onthechtingskracht.In deze studie hadden de NGL-residuen die door OaAEP1 ligatie tussen aangrenzende eiwitten werden geïntroduceerd geen invloed op de stabiliteit van eiwitmonomeer in het polymeer, uitgedrukt omdat de ontvouwende kracht en de toename van de contralengte vergelijkbaar waren met eerdere studie. De zuivering van de ferrische vorm rubredoxine gepresenteerd typische UV-gevisualiseerde absorptie pieken op 495 nanometer en 575 nanometer, terwijl de zinkvorm niet. SDS-pagina gel resultaten van de stapsgewijze spijsvertering en ligatie tonen samenhangende TEV-L-ubiquitine, het resultaat eiwit mengsel van TEV decolleté, pure GFP-TEV-protease, en purified product GL-ubiquitine.Ook het cleaved GL-ubiquitine en cohesin-TEV-L-ubiquitin ligatiemengsel met of zonder OaAEP1 en pure OaAEP1 worden getoond. Het is van cruciaal belang om het oppervlak te functionaliseren met actieve Sulfo-SMCC voor succesvol peptide bevestiging. Hier bieden we een nieuwe methode om gepolymeriseerde eiwitten te bouwen.Het vergemakkelijkt onderzoekers om complexe eiwit systeem met behulp van single-molecule kracht spectroscopie studie. Chromic zuur is sterk corrosief en zuur. Wees voorzichtig wanneer u zich voorbereidt en ermee omgaat.

oaaep1-mediated-enzymatic-synthesis-immobilization-polymerized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Een nieuwe aanpak wordt beschreven voor de constructie van een elektronische tong (eT), die het ontwerp en de productie van sensormaterialen aanzienlijk vereenvoudigt en het mogelijk maakt voor de eT om continue evolutieprofielen en landschappen voor monsters in vloeibare vorm te genereren. De verkregen eT is efficiënt voor gebruikelijke eiwitanalyse, zoals onderscheiding.

Elektronische tong genereren Continuous Erkenning Patronen voor Protein Analysis

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Hier presenteren we een protocol voor de genetische opneming van L-dihydroxyphenylalanine levende van eenvoudige grondstoffen en de toepassing ervan op eiwit-vervoeging.

Genetische opneming van levende L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en de toepassing ervan op eiwit Woordherkomst en-opbouw

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Leer een enzymatische methode voor polymerisatie van eiwitten met gecontroleerde sequentie voor single-molecule force spectroscopie. Deze techniek behoudt functionele residuen en opent nieuwe mogelijkheden voor eiwitgebaseerde materialen.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Meer video's verkennen