Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Ons protocol vergemakkelijkt de bereiding van genetisch gemodificeerde muizen gemakkelijk, efficiënt en snel uit eencellige muisembryo's. Ons protocol combineert het gebruik van bevroren eencellige embryo's en elektroporatie waardoor de snelle generatie van genetisch gemodificeerde muizen, waaronder de gemuteerde muizen met een hoge efficiëntie en lage mozaïeksnelheden. Voor in vitro fertilisatie, beginnen met super ovuleren vier of acht weken oude vrouwelijke C57BL/6J muizen via intraperitoneale injectie van 7,5 internationale eenheden van zwangere merrie serum gonadotropin gevolgd door intraperitoneale injectie van 7,5 internationale eenheden van de menselijke chorionic gonadotropine 48 uur later.

Verwijder vervolgens cauda epididymis uit seksueel volwassen drie tot vijf maanden oude mannelijke C57BL/6J muizen en gebruik een ontledende naald om stolsels van spermatozoa te extraheren. Vervolgens incubeer de stolsels in een 200 microliter daling van HTF bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 1,5 uur voor capacitatie. 16 tot 18 uur na de injectie van de menselijke choronic gonadotropine, verzamel cumulus eicellen complexen uit de eiducten en incuberen de complexen met 200 microliters van HTF bedekt met vloeibare paraffine voor een niet meer dan twee uur durende incubatie in de celcultuur incubator.

Voeg aan het einde van de incubatie een tot vijf microliter spermasuspensie van de grens van het incubatiemedium toe aan de 200 microliterdruppel van cumulus eicellencomplexen en plaats de co-cultuur drie uur lang in de celkweek incubator. Aan het einde van de incubatie, was de eicellen met kalium aangevuld simplex optimalisatie medium drie keer om alle resterende sperma en cumulus cellen te verwijderen en gebruik maken van een omgekeerde microscoop om de pronucleaire vorming en de rang van de een cel embryo's te controleren. Breng voor één cel embryo cryopreservatie de embryo's over in een verse druppel HTF van 200 microliter, aangevuld met 20%foetaal runderserum voor een incubatie van 10 minuten in de incubator van de celkweek.

Breng aan het einde van de incubatie 20 tot 100 embryo's over naar 50 microliter van één molaire dimethylsulfoxideoplossing en breng tot 100 embryo's in vijf microliter van oplossing over naar de bodem van een cryotube. Koel de embryo's vijf minuten af bij nul graden Celsius voordat u 45 microliter DAP213-oplossing aan de zijkant van de buis toevoegt. Na het afdekken, houd de cellen voor een extra vijf minuten op nul graden Celsius voordat snel het opslaan van de buis in vloeibare stikstof.

Bereid één microgram per microliter CRISPR RNA en één microgram per microliter tracrRNA voor in een verlaagd serum minimaal essentieel medium. Voeg zes microliters van elke RNA-oplossing toe aan 42 microliters van nuclease-vrije buffer en plaats het mengsel gedurende drie minuten in een droge kachel bij 95 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, koel het mengsel op kamertemperatuur gedurende vijf minuten en bereid een microgram per microliter van HiFi Cas9 eiwit met een verlaagd serum minimale essentiële medium.

Voeg zes microliter van de verdunde HiFi Cas9-oplossing toe aan de RNA-oplossing en breng tot 100 ontdooide embryo's over in 25 microliter van de resulterende ribonucleoprotein complexe oplossing in een hele glazen schuif. Dan incubeer embryo's gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voor embryo-elektroporatie stelt u aan het einde van de incubatie de elektroporatorparameters in en laadt u de glijbaan op de elektroporator.

Elektroporatie moet worden uitgevoerd binnen een uur na het ontdooien van embryo's om ervoor te zorgen dat genoombewerking plaatsvindt vóór de eerste replicatie van DNA en om mosaicisme te voorkomen. Na de elektroporatie, was de embryo's drie keer met gemodificeerde Krebs-Ringer bicarbonaat buffer twee medium in twee wasbeurten met een druppel kalium aangevuld simplex optimalisatie medium bedekt met vloeibare paraffine. Vervolgens incubeer de embryo's in verse kalium aangevuld simplex optimalisatie medium in de cel cultuur incubator 's nachts.

Met behulp van deze gemodificeerde cryopreservatiemethode voor eencellige embryo's verbetert de ontwikkelingssnelheid van de bevroren embryo's naar het tweecellige stadium. Met behulp van deze methode, alle gegenereerde muizen in dit representatieve experiment waren albino met slechts een mozaïek muis met een laag met witte en zwarte vlekken. Hier kan een representatief deel van een chromatogram van een albinomuis met het M1-allel worden waargenomen.

Zoals geïllustreerd, kan het protocol knock-out en knock-in muizen genereren met een hoge efficiëntie en lage mozaïeksnelheden. Inderdaad, de F1 nakomelingen van homozygoot F0 nakomelingen zijn heterozygoot met een mutant en een wild type allel zonder ongelijksoortige mutaties. Vergeet niet dat de bevruchte eicel is kwetsbaar in een cel stadium.

De toevoeging van foetaal runderserum versterkt het embryo. Echter, het moet zorgvuldig worden behandeld bij elke stap. Deze methode kan bijdragen aan de analyse van genfunctie en onderzoek bij menselijke ziekten door een snellere en efficiëntere productie van genetisch gemodificeerde muizen te vergemakkelijken.