Name: Inducerende harige wortels door Agrobacterium rhizogenes-Gemedieerde transformatie in Tartary Boekweit(Fagopyrum tataricum) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer hoe u harige wortels induceert in Tartary boekweit (Fagopyrum tataricum) via Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie. Deze eenvoudige, kosteneffectieve methode is geschikt voor genomica en microbiomica onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Fundamental Research Funds voor de Centrale Onderzoeksinstituten voor Welzijn ZXKT17002.

De tbc gebruikt in deze studie werd genoemd als BT18, die afkomstig is van het ras van "JinQiao No.2" geteeld door het Research Center of Small Miscellaneous Grain van Shanxi Academy of Agricultural Science. De primaire stappen van dit protocol worden geïllustreerd in figuur 1.
OPMERKING: Bedien explants-gerelateerde manipulatie snel, en waar mogelijk, houd de petrischaaltjes gesloten om verwelking en verontreiniging te voorkomen. Tenzij anders vermeld, werden alle explant incubaties uitgevoerd onder de voorwaarde van een 14-h licht en een 10-h donkere fotoperiode bij 25 °C. Tenzij anders vermeld, alle explants- of bacteriën-gerelateerde operaties werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden in een laminaire stroom kap. Alle media-ingrediënten voor A. rhizogenes en in vitro plantenculturen zijn opgenomen in tabel 1. Na het aanpassen van de pH, werden alle media autoclaved bij 120 °C voor 20 min. Gestolde media werden voorbereid door 25 mL van middel in een Petrischaal van 9 cm diameter te vullen en het toe te staan om te stollen.
LET OP: Stort alle genetisch gemodificeerde bacteriën en planten in de juiste afvalcontainer. Bedien alle gevaarlijke chemicaliën in een rookkast en deponeren ze in de container met gevaarlijk afval.
1. Bereiding van tbc-explanten
<ol><li>Bereiding van tbc-zaden<ol>
<li>Selecteer mollige en onbeschadigde tbc-zaden(figuur 1A1) die gedurende niet meer dan 2 jaar bij een temperatuur van minder dan 20 °C zijn bewaard gebleven.</li>
		<li>Week de zaden ongeveer 20 m in water bij 28 °C, zodat de zaadlaag gemakkelijk kan worden afgepeld (figuur 1A2). Gebruik indien nodig een schaar om een sleuf op de zaden te snijden om de peeling te vergemakkelijken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sterilisatie van tbc-zaden<ol>
<li>Doe 100-200 geschilde zaden in een gesteriliseerde conische kolf van 100 mL.</li>
		<li>Desinfecteer de zaden met 75% ethanol gedurende 30 s.</li>
		<li>Vervang de ethanol door 5% natriumhypochloriet en desinfecteer gedurende 15 min. OPMERKING: Desinfectie met kwikbichloride bij een concentratie van 1 g/L gedurende 8 min kan worden gebruikt als alternatieve sterilisator ter vervanging van natriumhypochloriet in geval van ontoereikende sterilisatie. LET OP: Kwikbichloride is gevaarlijk en geen milieuvriendelijk materiaal. Bedien het in de fumingkast en deponeren in de container voor gevaarlijk afval, als kwikbichloride in ieder geval wordt gebruikt.</li>
		<li>Giet het natriumhypochloriet uit.</li>
		<li>Was de zaden 5 keer met steriel gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Dep de zaden droog met een steriel bibulous papier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van tbc-zaailingen<ol>
<li>Bereid 50 mL Murashige en Skoog (MS) basale medium (1962) aangevuld met 30 g/L sacharose en 7 g/L agar poeder (MSSA) (Tabel 1) in een 300 mL plant weefsel cultuur fles.</li>
		<li>Pas de pH aan tot 5,8 voor het autoclaven.</li>
		<li>Verdeel 10 zaden gelijkmatig per fles MSSA medium.</li>
		<li>Ontkiem de zaden in een kweekruimte bij 25 °C ± 1 °C onder de lichtconditie gedurende 7-10 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van steriele explants<ol>
<li>Selecteer robuuste zaailingen van tbc(figuur 1C),wanneer de 2 stukken cotyledons worden uitgeklapt.</li>
		<li>Snijd de zaailingen van de wortels (Figuur 1C roodstreepje pijlpunten),het vermijden van contact met het medium.</li>
		<li>Leg ze in een steriele petrischaal.</li>
		<li>Snijd de hypocotylen in segmenten van 0,8-1 cm en shoor de cotyledons in stukken van ongeveer 0,5 cm.</li>
		<li>Precultuur deze explants op MSSA medium onder de lichtvoorwaarde voor 24 uur.</li>
		<li>Breng ze in een 100 mL gesteriliseerde conische kolf, die nu klaar zijn voor infectie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van A. rhizogenes voor transformatie
OPMERKING: De A. rhizogenes stam ACCC10060 werd vriendelijk verstrekt door het Instituut voor Medicinale Plantenontwikkeling en bewaard bij −80 °C. A. rhizogenes werd getransformeerd met de binaire vector pK7GWIWG2D (II) die een T-DNA herbergt dat het b4-gen bij een GFP als indicatorgen en het Kan-resistentiegen als selecteerbare marker draagt. Het gen b4 is een lid van de transcriptiefactor bHLH familie, die nog niet is gepubliceerd. Om het potentieel van tbc harige wortels te evalueren, werd A. rhizogenes getransformeerd met de binaire vector pK7WG2D die het MYB116-gen bevat om het effect ervan op de productie van secundaire metabolieten zoals flavonoïden op het niveau van genexpressie en door metabole analyses te onderzoeken. Geactiveerde A. rhizogenes moet tegelijkertijd goed voorbereid zijn met de explants.
<ol><li>Activering van A. rhizogenes
	<ol>
<li>Dooi A. rhizogenes op ijs</li>
		<li>Dompel de bacteriën en lijn ze gelijkmatig op gist mannitol medium (YEB) aangevuld met 15 g/L agar poeder, 50 mg/L rifampicin, en 50 mg/L spectinomycine (YEBARS, pH 7.0).</li>
		<li>Incubeer de bacterie bij 28 °C gedurende 12-16 uur.</li>
		<li>Kies een monoklonale kolonie en cultuur het in een andere petrischaal op dezelfde hierboven beschreven manier.</li>
		<li>Selecteer monoklonale kolonies en kweek ze in een gesteriliseerde conische kolf van 100 mL met 20 mL YEB-medium aangevuld met 50 mg/L rifampicin en 50 mg/L spectinomycine (YEBRS, pH 7.0) bij 28 °C en 200 tpm voor 16-18 uur tot de OD600-waarde 2,0 bereikt.</li>
		<li>Incubeer 2%–4% van de bovengenoemde cultuur in een andere conische kolf van 100 mL met 20 mL YEBRS-medium bij 28 °C en 200 tpm voor 4-5 uur totdat de OD600-waarde ongeveer 0,5 (figuur 1D) bereikt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Infectie en screening van tbc-explants
OPMERKING: Het doel van dit protocol is het verkrijgen van genetisch getransformeerde harige wortels. De wilde wortels werden gebruikt als de negatieve controle om de transgene expressie te beoordelen. In dit protocol werd A. rhizogenes getransformeerd met binaire vector ofwel pK7WG2D die het gen van FtMYB116 of pK7GWIWG2D (II) droeg het gen van b4 op voorhand.
<ol><li>Resuspension van A. rhizogenes
	<ol>
<li>Breng de cultuur verkregen in stap 2.1.6 in een 50-mL gesteriliseerde centrifugaalbuis.</li>
		<li>Draai op 4.000 x g voor 10 min bij 20 °C.</li>
		<li>Verwijder de supernatant en breveer de bacteriële pellet met MS-medium aangevuld met 30 g/L sacharose en 300 μM acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5.8) tot OD600 ∙ 0,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infectie van explants<ol>
<li>Breng de in stap 3.1.3 verkregen bacteriële suspensie in een conische kolf met de explants die in stap 1.4.6 voor 10 min zijn bereid (figuur 1E).</li>
		<li>Haal de explants eruit en dep ze droog met een steriel bibulous papier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cocultuur van explants met A. rhizogenes
<ol><li>Plaats een steriel filterpapier met een diameter van 9 cm op het MS-medium, dat is gestold met 7 g/L agarpoeder aangevuld met 30 g/L sacharose en 100 μM AS (MSSAAS medium, pH 5.2).</li>
	<li>Overlay de explants op het filterpapier op 25 °C gedurende 3 dagen in het donker (figuur 1F).</li>
</ol>5. Inductie en selectieve cultuur
<ol><li>Plaats ongeveer 20 besmette explants op het MSSA-medium aangevuld met 500 mg/L cefotaxime en 50 mg/L kanamycine (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (figuur 1G).</li>
	<li>Bebroed ze verticaal onder de lichttoestand bij 25 °C ± 1 °C. De harige wortels komen ongeveer 1 week na incubatie voor(Figuur 1H black-dash pijlpunten geven het optreden van harige wortels aan). LET OP: Vervang MSSACK medium om de 15 dagen indien nodig.</li>
</ol>6. Subculturing TB harige wortels
OPMERKING: Deze procedure is gericht op het oogsten van krachtige harige wortels. Observeer regelmatig de groei van harige wortels tijdens de voortplanting, en verwijder de besmette en geïnactiveerde degenen in een tijdige wijze. Herhaal indien nodig de volgende stappen om meer harige wortels te verspreiden. Het duurt ongeveer 10-14 dagen van subculturing tot oogst.
<ol><li>Selecteer de harige wortels met een wit uiterlijk en snelle groei.</li>
	<li>Snijd ze in stukken van 2-3 cm.</li>
	<li>Duidelijk nummer ze op een schone bank.</li>
	<li>Subkweek ze in een 100 mL gesteriliseerde conische kolf met 5 mL MS medium aangevuld met 30 g/L sacharose en 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) bij een roterende snelheid van 80 rpm bij 25 °C in het donker totdat ze overspread naar de bodem van de kolf (figuur 1I).</li>
</ol>7. Identificatie van getransformeerde harige wortels en conservering
OPMERKING: Getransformeerde harige wortels kunnen worden geïdentificeerd op basis van de aspecten van morfologie en genniveau. Identificatie kan ook worden uitgevoerd volgens het harige wortelgenoom en de weerstand, die niet in dit protocol worden behandeld. Deze procedure richt zich voornamelijk op reporter gen en doel gen identificatie.
<ol><li>Verwijder tawny en verontreinigde harige wortels en selecteer die met witte uitstraling.</li>
	<li>Evalueren of er groene fluorescentie onder een blauw / licht dual ultraviolet transilluminator.</li>
	<li>Selecteer de harige wortels vertonen een sterke fluorescentie signaal in de genummerde buizen of verpakt met behulp van een gemarkeerd aluminiumfolie na het uitdrogen van hen uit met een absorberend papier.</li>
	<li>Lyophilize ze in vloeibare stikstof, gevolgd door het opslaan van alle oogst op −80 °C voor verder onderzoek.</li>
	<li>Genidentificatie<ol>
<li>Trituraat 0,1 g van de harige wortels in fijn poeder in vloeibare stikstof.</li>
		<li>Bereid het genomische DNA van onafhankelijke transgene lijnen van tbc met behulp van de gewijzigde cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) methode25 volgens de instructie van de fabrikant van de plant genomische DNA kit.</li>
		<li>Polymerase kettingreactie (PCR) uitvoeren met behulp van 100 ng genomische DNA-sjabloon en primers vermeld in tabel 2.</li>
		<li>Voer de versterkingscyclus als volgt uit: predenaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, denaturatie bij 94 °C voor 30 s, primer annealing bij 55 °C voor 30 s en primeruitbreiding bij 72 °C voor 30 s. Na 36 cycli en een laatste uitbreidingsstap bij 72 °C gedurende 10 min, analyseer de versterkingsproducten op 1% agarosegels.</li>
		<li>Vlek de gels met nucleïnezuur vlekken en visualiseren ze onder UV-licht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fabjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartary+Buckwheat+%28+Fagopyrum+tataricum+Gaertn+.%29+as+a+Source+of+Dietary+Rutin+and+Quercitrin%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin.</a> Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Phenolic+Compounds+in+Hairy+Root+Culture+of+Tartary+Buckwheat+%28Fagopyrum+tataricum+Gaertn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crop+Science+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn).</a> Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-chiro-inositol-enriched+tartary+buckwheat+bran+extract+lowers+the+blood+glucose+level+in+KK-Ay+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).</li>
<li>Giri, A., Narasu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Transgenic hairy roots.</a> Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-induced+transcription+factor+FtMYB116+promotes+accumulation+of+rutin+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum.</a> Plant, Cell & Environment. 42, (2018).</li>
<li>Chilton, M. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+thizogenes+inserts+T-DNA+into+the+genomes+of+the+host+plant+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells.</a> Nature. 295 (4), 129(1982).</li>
<li>Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+Roots%3A+a+Powerful+Tool+for+Plant+Biotechnological+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Molecules+and+Medicinal+Plants%22%5BJournal%5D)">Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances.</a> Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).</li>
<li>Srivastava, S., Srivastava, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+for+mass-production+of+high-value+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Veena, V., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes%3A+Recent+developments+and+promising+applications%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).</li>
<li>Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+cultures%3A+Chemical+factories+of+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites.</a> Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).</li>
<li>Palazón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Ginsenoside+Production+in+Hairy+Root+Cultures+of+Panax+ginseng+using+a+Novel+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor.</a> Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).</li>
<li>Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elicitation+of+secondary+metabolites+in+in+vitro+cultures+of+Ammi+majus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L.</a> Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).</li>
<li>Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicidal+activity+of+phenolic+compounds+from+hairy+root+cultures+of+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum.</a> Weed Research. 52, 25-33 (2011).</li>
<li>Christey, M. C., Braun, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hairy+root+cultures+and+transgenic+plants+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).</li>
<li>Olhoft, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+method+of+soybean+%5BGlycine+max+%28L.%29+Merrill%5D+using+primary-node+explants+from+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), (2007).</li>
<li>Pistelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPistelli%2C+L+%22Bio-Farms+for+Nutraceuticals%3A+Functional+Food+and+Safety+Control+by+Biosensors%22">Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors</a>. , Chapter 13 (2010).</li>
<li>Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+of+Plumbago+indica+as+a+potential+source+for+plumbagin%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin.</a> Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+Hairy+Root+Transformation+in+lotus+Japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus.</a> Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).</li>
<li>Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+in+Cichorium+intybus+L.+via+removing+macronutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Crops+and+Products%22%5BJournal%5D)">High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients.</a> Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).</li>
<li>Fernández-piñán, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Potato+and+the+Promoter+Activity+of+a+Suberin+Gene+by+GUS+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e1(2019).</li>
<li>Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transgenic+hairy+root+system+in+jute+%28Corchorus+capsularis+L.%29+with+gusA+reporter+gene+through+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+co-transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation.</a> Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).</li>
<li>Sirikantaramas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+controlling+marijuana+psychoactivity.+Molecular+cloning+and+heterologous+expression+of+%CE%941-tetrahydrocannabinolic+acid+synthase+from+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).</li>
<li>Zhou, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Functional+Genes+in+Buckwheat%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding+and+Nutritional+Aspects+of+Buckwheat%22%5BJournal%5D)">Characterization of Functional Genes in Buckwheat.</a> Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+the+Chloroplast+Genomes+of+Four+Salvia+Medicinal+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants.</a> Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).</li>
<li>Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+the+PaAP1+gene+from+sweet+cherry+%28Prunus+avium+L.%29+causes+early+flowering+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Flavonoid+Metabolites+in+Buckwheat+Leaves+Using+UPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. , (2019).</li>
<li>Zhu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+and+health+effects+of+Tartary+buckwheat%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat.</a> Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).</li>
<li>Kaur, B., Malik, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+-a+unique+source+for+metabolites+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture -a unique source for metabolites production.</a> Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).</li>
<li>Thwe, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+Analysis+and+Phenylpropanoid+Biosynthesis+in+Hairy+Root+Culture+of+Tartary+Buckwheat+Cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars.</a> Plos One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Thwe, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Phenylpropanoids+and+Correlated+Gene+Expression+in+Hairy+Roots+of+Tartary+Buckwheat+under+Light+and+Dark+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonate-responsive+MYB+factors+spatially+repress+rutin+biosynthesis+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtSAD2+and+FtJAZ1+regulate+activity+of+the+FtMYB11+transcription+repressor+of+the+phenylpropanoid+pathway+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum.</a> New Phytologist. 216, (2017).</li>
<li>Giri, A., Narasu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+hairy+roots%3A+Recent+trends+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Transgenic hairy roots: Recent trends and applications.</a> Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).</li>
<li>Thwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+Agrobacterium+rhizogenes+strains+on+hairy+root+induction+and+phenylpropanoid+biosynthesis+in+tartary+buckwheat+%28Fagopyrum+tataricum+Gaertn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn).</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+repression+of+SmCPS+%28copalyldiphosphate+synthase%29+expression+in+hairy+roots+of+Salvia+miltiorrhiza+causes+a+decrease+of+tanshinones+and+sheds+light+on+the+functional+role+of+SmCPS%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS.</a> Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Rutin+and+Quercetin+Biosynthesis+through+Flavonoids-Related+Gene+Expression+in+Fagopyrum+tataricum+Gaertn+.+Hairy+Root+Cultures+with+UV-B+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).</li>
<li>Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+acetosyringone+and+pH+on+Agrobacterium-mediated+transformation+vary+according+to+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species.</a> Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).</li>
<li>Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+signal+molecules+produced+by+wounded+plant+cells+that+activate+T-DNA+transfer+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens.</a> Nature. 318 (19), (1985).</li>
<li>Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Phenolic+Compounds+Induce+Expression+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+loci+needed+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence.</a> Science. 232 (10), 983-985 (1986).</li>
<li>Ferri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+treatment+induces+changes+of+protein+expression+profile+and+stilbene+distribution+in+Vitis+vinifera+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions.</a> Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).</li>
<li>Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plant+secondary+metabolites%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Production of plant secondary metabolites: a historical perspective.</a> Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+potato+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots.</a> Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Tbc is gebruikt in verschillende studies in verband met secundaire metabolieten op genetische en metabolische niveaus1,2,5,27,28. Harige wortelcultuur, als een unieke bron voor metabolietproductie, speelt een centrale rol in de metabole techniek29 en kan worden gebruikt om metabole trajecten te veranderen door het invoegen van de verwan...

Tartary boekweit (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) is een soort dicotyledon behorend tot het geslacht Fagopyrum en de familie Polygonaceae1. Als een soort van Chinese geneeskunde homologe voedsel, tbc heeft aanzienlijke belangstelling ontvangen als gevolg van de onderscheidende chemische samenstelling en diverse bio-activiteiten tegen ziekten. Tbc is voornamelijk rijk aan koolhydraten, eiwitten, vitaminen en carotenoïden, evenals in polyfenolen zoals fenolzuren en flavonoïden1. Verschillende biologische en farmacologische activiteiten van flavonoïden, waaronder antioxidatieve, antihypertensieve2, en ontstekingsremmende evenals antikanker en antidiabetische eigenschappen, zijn aangetoond3.
Agrobacterium rhizogenes is een bodembacterie die bijdraagt aan de ontwikkeling van harige wortelziekte in verschillende hogere planten, vooral dicotyledons, door het infecteren van wondplaatsen4,5. Dit proces wordt geïnitieerd door de overdracht van het T-DNA in het wortelopwekkende (Ri) plasmid5,6 en gaat vaak gepaard met de integratie en expressie van een exogen eergen uit de Ri plasmid en de daaropvolgende stappen van het genereren van het harige wortelfenotype7. A. rhizogenes-gemedieerde transgene harige wortels, als krachtig instrument op het gebied van plantaardige biotechnologie, zijn het meest gebruikt vanwege hun stabiele en hoge productiviteit en gemakkelijke verkregen in een korte periode. Bovendien onderscheiden harige wortels veroorzaakt door A. rhizogenes zich efficiënt door hun plagiotropische wortelontwikkeling en een sterk vertakkende groei in een hormoonvrij medium8. Ze kunnen worden gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, waaronder kunstmatige zaadproductie, wortelknobbelonderzoek, en bij het bestuderen van de interacties met andere organismen zoals mycorrhizal schimmels, aaltjes en wortelpathogenen7,9. Bovendien zijn harige worteltransformatieculturen op grote schaal gebruikt als experimenteel systeem om de biochemische trajecten en chemische signalering te onderzoeken en om secundaire metabolieten van planten te produceren die worden gebruikt als farmaceutische producten, cosmetica en levensmiddelenadditieven8,10. De waardevolle secundaire metabolieten, waaronder indole alkaloïden, aconites, tropane alkaloïden, terpenoïden en flavonoïden, gesynthetiseerd in wilde harige wortels zijn onderzocht voor meerdere decennia in tal van soorten, zoals ginsenoside in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, en fenolverbindingen in TB2,13.
Harige wortels zijn geproduceerd met behulp van A. rhizogenes in 79 plantensoorten uit 27 families14. Bijvoorbeeld, A. rhizogenes-gemedieerde harige wortel transformatie is gemeld in sojabonen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, en witloof(Cichorium intybus L.) 20. TB harige wortel transformatie is ook onderzocht2. Weinig gedetailleerde protocollen zijn beschikbaar met betrekking tot de ontwikkeling van harige wortels bemiddeld door A. rhizogenes ofwel het dragen van een binaire vector of niet. Zo introduceerden Sandra et al.21 een methode voor de productie van transgene aardappelharige wortels die in wilde scheuten worden ondersteund. De volledig ontwikkelde harige wortels kunnen 5-6 weken na de injectie van A. rhizogenes worden gevisualiseerd die het gus reporter gen in de stengelinternodes van aardappelplanten vervoeren. Een andere studie had ook gemeld een transgene harige wortelstelsel geïnduceerd door A. rhizogenes herbergen de gusA reporter gen in jute(Corchorus capsularis L.) 22. Bovendien verkregen Supaart et al.23 transgene tabaksharige wortels met behulp van A. rhizogenes getransformeerd met de expressievector pBI121 die het gen van Δ1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase draagt om THCA te produceren.
Echter, een stap-voor-stap proces voor een effectieve generatie van harige wortel transformatie, vooral in TB, is relatief minder aangetoond. In deze studie hebben we beschreven een gedetailleerd protocol met behulp van A. rhizogenes die de reporter gen (GFP), een selectieve marker (Kan), en een gen van belang (b4, een geïdentificeerd uit onze groep, maar ongepubliceerd gen uit fundamentele helix-loop-helix(bHLH) familie) om harige wortel genetische transformatie in TTb te genereren. Het experiment duurde 5-6 weken, van de inenting van zaden tot het genereren van harige wortels, waarbij de explant voorbereiding, infectie, coculturing, subculturing, en de daaropvolgende voortplanting. Bovendien werd A. rhizogenes die een binaire plasmid bevat die het tbc-transgene van myeloblastosetranscriptiefactor 116(FtMYB116)draagt, gebruikt om te bepalen of FtMYB116 de accumulatie van flavonoïden, met name rutine, in tbc kan bevorderen op gen- en metabolisch niveau door de tbc-harige worteltransformatie. FtMYB116, dat is een licht-geïnduceerde transcriptie factor, regelt de synthese van rutin ei onder verschillende lichtomstandigheden5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoïde-3'-hydroxylase (F3'H), en flavonol synthase (FLS)24 zijn belangrijke enzymen die betrokken zijn bij de metabole route van rutine biosynthese. Daarom toont deze studie de overexpressie van FtMYB116 bij tbc harige wortels en de expressie van belangrijke enzymgenen, evenals de inhoud van rutine en andere flavonoïden zoals quercetine.

<table><tbody><tr><td>2*Taq PCR MasterMix</td><td>Aidlab, China</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>Agar poeder</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td><td>ThermoFisher Scientific, US</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>A8110</td><td>Verdund in DMSO, 100 mM</td></tr><tr><td>binaire vectoren</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td><td>/</td><td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td></tr><tr><td>Cefotaxime, natrium</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>C8240</td><td>Verdund in Water, 200 mg/mL</td></tr><tr><td>CF15RXII hogesnelheids micro</td><td>Hitachi, Japan</td><td>No. 90560201</td><td></td></tr><tr><td>Beschikbare Petri-schaal</td><td>Guanghua medische instrumentenfabriek, Yangzhou, China</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>DYY-6C elektroforese apparaat</td><td>Bjliuyi, Beijing China</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td><td>Aidlab, China</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab untra bioscience</td><td>ELGA LabWater, UK</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td><td>biotek, US</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP/LR reactie-enzym</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr><tr><td>HYG-C multifunctionele shaker</td><td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>K8020</td><td>Verdund in Water, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>MLS-3750 Autoclaaf sterilisator</td><td>Sanyo, Japan</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MS-zouten met vitaminen</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Andere chemicaliën niet vermeld</td><td>Beijing Chemical Works, China</td><td></td><td>ethanol, kwikbichloride, enz.</td></tr><tr><td>PHS-3C pH meter</td><td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>Plant Genomic DNA Kit</td><td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>R8010</td><td>Verdund in DMSO, 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>S8040</td><td>Verdund in Water, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA Marker</td><td>TransGen Biotech, Beijing, China</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman diameter 9 cm Filterpapier</td><td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Gist Extract poeder</td><td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

inducerende harige wortels door agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie in tartary boekweit(fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Tartary boekweit (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] bezit verschillende biologische en farmacologische activiteiten omdat het overvloedige secundaire metabolieten zoals flavonoïden, vooral rutine bevat. Agrobacterium rhizogenes zijn geleidelijk wereldwijd gebruikt om harige wortels in medicinale planten te induceren om genfuncties te onderzoeken en de opbrengst van secundaire metabolieten te verhogen. In deze studie hebben we een gedetailleerde methode beschreven om A. rhizogenes-gemedieerde harige wortels in tbc te genereren. Cotyledons en hypocotyledonaire as op 7-10 dagen werden geselecteerd als explants en besmet met A. rhizogenes die een binaire vector, die onvoorziene harige wortels die verscheen na 1 week veroorzaakt. De gegenereerde harige worteltransformatie werd geïdentificeerd op basis van morfologie, resistentieselectie (kanamycine) en reporter genexpressie (groen fluorescerend eiwit). Vervolgens werden de getransformeerde harige wortels naar behoefte zelf gepropageerd. Ondertussen werd een myeloblastose (MYB) transcriptiefactor, FtMYB116, omgezet in het TB-genoom met behulp van de A. rhizogenes-bemiddelde harige wortels om de rol van FtMYB116 in het synthetiseren van flavonoïden te verifiëren. De resultaten toonden aan dat de expressie van flavonoïde-gerelateerde genen en de opbrengst van flavonoïde verbindingen (rutine en quercetine) aanzienlijk waren (p < 0,01) gepromoot door FtMYB116, wat aangeeft dat A. rhizogenes-bemiddelde harige wortels kunnen worden gebruikt als een effectief alternatief instrument om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten te onderzoeken. Het gedetailleerde stapsgewijze protocol dat in deze studie wordt beschreven voor het genereren van harige wortels kan worden aangenomen voor elke genetische transformatie of andere geneeskrachtige planten na aanpassing.

Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde TB harige worteltransformatie Deze studie beschrijft het stapsgewijze protocol dat is ingesteld om genetisch getransformeerde harige wortels te verkrijgen met behulp van A. rhizogenes. Het duurde ongeveer 5-6 weken van de inenting van tbc-zaden tot het oogsten van de geïdentificeerde harige wortels, en enkele belangrijke stappen zijn afgebeeld in figuur 1 (A-H). Kort werden gesteriliseerde gepelde zad...

We beschrijven een methode om harige wortels te induceren door Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie in Tartary boekweit(Fagopyrum tataricum). Dit kan worden gebruikt om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten in Tartary boekweit te onderzoeken, worden aangenomen voor elke genetische transformatie, of gebruikt voor andere geneeskrachtige planten na verbetering.

Inducerende harige wortels door Agrobacterium rhizogenes-Gemedieerde transformatie in Tartary Boekweit(Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Met behulp van dit protocol zullen we het stapsgewijze proces demonstreren voor het opwekken van harige wortels in tartary boekweit voor de eerste keer. Deze techniek is een gemakkelijke en goedkope voor het starten van genomics en microbiomics voor tartary boekweit en andere planten. Hoewel deze gedetailleerde methode is ingesteld voor tartary boekweit, kan het worden toegepast op andere dicot planten met een aantal wijzigingen.Hoewel deze methode is gemakkelijk uit te voeren, het heeft veel gedetailleerde stappen. Visuele demonstratie kan onderzoekers helpen om een efficiëntere harige wortelinductie te bereiken. Het demonstreren van de procedure zal Guangtao Qian zijn, een Masters student van mijn lab.Begin met het selecteren van mollige en onbeschadigde tartary boekweitzaden en het weken van de zaden in 28 graden Celsius water voor ongeveer 20 minuten. Wanneer de zaadlaag gemakkelijk kan worden verwijderd, plaats 100 tot 200 geschilde zaden in een gesteriliseerde 100 milliliter conische kolf met 75% ethanol gedurende 30 seconden. Vervang aan het einde van de sterilisatie de ethanol door 5%natriumhypochloriet.Na 15 minuten decanteer je de natriumhypochloriet en was je de zaden vijf keer met steriel gedeïioniseerd water. Dep vervolgens de zaden droog met een stuk steriel bipbuleus papier. Om tartary boekweit zaailingen te verkrijgen, voeg 10 zaden per fles aan individuele 300 milliliter plant weefsel kweekflessen met 50 milliliter MSSA medium.Ontkiem de zaden in een kweekkamer op 25, plus of min 1 graden Celsius onder lichte omstandigheden. Selecteer na 7 tot 10 dagen robuuste zaailingen met twee stukken uitgeklapte cotyledons en snijd de zaailingen van de wortels. Plaats de zaailingen in een steriele petrischaal en snijd de hypocotyls in 0,8 tot 1 centimeter segmenten.Pureer de cotyledons in ongeveer 0,5 centimeter stukken en pre-cultuur de resulterende explants onder lichte omstandigheden voor 24 uur. De volgende dag, breng de explants in een gesteriliseerde 100 milliliter conische kolf. Om A.rhizogenes te activeren, ontdooit u de cultuur op ijs voordat de bacteriën gelijkmatig op yeb-vast medium met antibiotica worden belaagd voor een incubatie van 12 tot 16 uur bij 28 graden Celsius.De volgende ochtend, kies een monoklonale kolonie voor cultuur in een nieuwe petrischaal zoals net aangetoond. Na nog eens 12 tot 16 uur incubatie, inenting van de resulterende monoklonale kolonies in een gesteriliseerde 100 milliliter conische kolf met 20 milliliter yeb vaste medium met antibiotica bij 28 graden Celsius en 200 omwentelingen per minuut gedurende 16 tot 18 uur tot de optische dichtheid bij 600 bereikt 2,0. Breng vervolgens 2-4% van de bacteriële celcultuur over in een nieuwe conische kolf van 100 milliliter met 20 milliliter vers YEB-vast medium met antibiotica bij 28 graden Celsius en 200 omwentelingen per minuut gedurende 4 tot 5 uur tot de optische dichtheid op 600 nanometer ongeveer 0,5 bereikt.Om harige worteltransformatie te induceren, breng je de A.rhizogenes cultuur over in een steriele conische buis van 50 milliliter en verzamel je de bacteriën door centrifugeren. Resuspend de pellet in MSSAS medium tot een optische dichtheid van ongeveer 0,2 en de suspensie in de kolf van explanten. Na 10 minuten, verwijder de explants uit de kolf en dep ze met een stuk steriel bibulous papier.Plaats vervolgens een steriel stuk filterpapier met een diameter van 9 centimeter op een schotel van MSSAAS-medium en leg de explants op het filterpapier voor een driedaagse incubatie bij 25 graden Celsius in het donker. Breng aan het einde van de incubatie ongeveer 20 geïnfecteerde explants over op MSSACK-medium en broed de planten verticaal onder lichte omstandigheden bij 25, plus of min 1, graden Celsius. Na 10 tot 14 dagen cultuur, selecteer de harige wortels waaruit een wit uiterlijk en snelle groei en snijd de wortels in twee tot drie centimeter stukken.Duidelijk nummer de wortels op een schone bank. Subcultuur de wortelstukken in een gesteriliseerde 100 milliliter conische kolf met MSSK medium op 25 graden Celsius en 80 omwentelingen per minuut in het donker totdat ze overspread naar de bodem van de kolf. Om de harige wortels te identificeren, verwijder elke tawny en besmette harige wortels en selecteer die met een witte uitstraling.Als een reporter gen werd gebruikt, controleer de wortels voor fluorescentie onder een blauwe of lichte dubbele ultraviolet transilluminator en selecteer de harige wortels die een sterk fluorescerend signaal vertonen. Droog vervolgens de wortels met absorberend papier en wikkel ze in gemarkeerde aluminiumfolie voor onmiddellijke analyse. Voor langdurige opslag, lyophilize de wortels in vloeibare stikstof en plaats de wortels op min 80 graden Celsius tot hun onderzoek.Na genetische transformatie en cultuur, zoals aangetoond, zullen de harige wortels vertonen een pluizige witte kleur en een plagiotrope manier in de wondplaatsen van de explants en vormen een zeer vertakte en met elkaar verbonden matrix. Een reporter gen kan worden gebruikt om differentiatie van de transgene harige wortels onder een blauwe of lichte dubbele ultraviolette transillumination, of de identificatie van een doelgen van belang te vergemakkelijken. Hier wordt de relatieve expressie van een licht-geïnduceerde transcriptiefactor in de transgene lijnen van tartary boekweitharige wortels weergegeven.Met name de biosynthese van rutin en quercetine worden ook bevorderd op metabolisch niveau in reactie op de geïnduceerde transcriptiefactor overexpressie. Verder, de relatieve genexpressie van flavenoïde synthese traject genen in alle drie transgene lijnen, zijn opmerkelijk hoger dan die gemeten in de controlegroep, wat wijst op een succesvolle harige wortel transformatie in tartary boekweit explants. Dat is infectie van de zaden, selectie van de explants, en de concentratie van de bacteriën direct van invloed op het succes van de harige wortel inductie.We kunnen de genexpressie, DNA-eiwit of eiwiteireacties of massaproductie van secundaire metabolieten beoordelen om transcriptieregulatie secundaire metabolieten te bestuderen. De gemanipuleerde bacteriën zijn gevaarlijk voor mens en milieu. Zorg ervoor dat de bacteriën goed worden behandeld, bedienen en verwijderen.

inducing-hairy-roots-agrobacterium-rhizogenes-mediated-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.

Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

Vanwege de veelzijdige toepassing als modelsoort in verschillende vakgebieden, is er behoefte aan een toolkit voor genetische transformatie in smalbladige weegbree (Plantago lanceolata).  Hier wordt met behulp van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie een protocol gepresenteerd dat resulteert in stabiele transgene lijnen met een transformatie-efficiëntie van 20%.

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische transformatie van smalbladige weegbree

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Hier bieden we het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om samengestelde planten te produceren.

Een efficiënte en reproduceerbare methode voor het produceren van samengestelde planten door Agrobacterium rhizogenes-gebaseerde harige worteltransformatie

Het protocol beschrijft de inductie van harige wortels met behulp van Arabidopsis primaire bloeiwijzestengels en Brassica napus hypocotyls. De harige wortels kunnen worden gekweekt en gebruikt als explantaten om transgene planten te regenereren.

Transformatie en regeneratie van harige wortels bij Arabidopsis thaliana en Brassica napus

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Gen deletie mutanten gegenereerd door homologe recombinatie zijn de gouden standaard voor genfunctie studies. De OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) methode voor snelle generatie van deletieconstructen wordt beschreven. Agrobacterium gemedieerde schimmel transformatie volgt. Tenslotte wordt een PCR-gebaseerde bevestigingsmethode van gendeleties in zwamtransformanten gepresenteerd.

Snelle verwijdering Productie in Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Gemedieerde Transformatie van OSCAR Deletion Constructs

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Leer hoe u harige wortels induceert in Tartary boekweit (Fagopyrum tataricum) via Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie. Deze eenvoudige, kosteneffectieve methode is geschikt voor genomica en microbiomica onderzoek.

Inducerende harige wortels door Agrobacterium rhizogenes-Gemedieerde transformatie in Tartary Boekweit(Fagopyrum tataricum)

Meer video's verkennen