Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

Eiwitproducerende synthetische cellen bieden een veelzijdig platform voor het bestuderen van de oorsprong van het leven en synthetische celgebaseerde therapieën voor geavanceerde drugslevering. Deze methode is eenvoudig en betaalbaar voor RNA en eiwitexpressie en kan worden toegepast voor on-site therapeutische eiwitproductie direct in het lichaam. De systemen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van een breed scala van ziekten van metabole ziekten en eiwitvervangers tot kanker en eventueel diabetes.

Dit protocol in meerdere stappen heeft een gedefinieerd stoppunt. Bij het uitvoeren van het voor de eerste keer, is het raadzaam om het werk te verdelen over meerdere dagen. Het protocol voor synthetische celproductie begint met de voorbereiding van de celvrije S30-T7 lysaat.

Vervolgens zijn de membraanlipiden en de cellulaire voedingsoplossing voorbereid om de innerlijke omgeving te simuleren en de eiwitproductie te ondersteunen. De laatste stap is de bereiding van de synthetische cellen zelf. Bereid dubbele starter culturen in 100 milliliter Erlenmeyer kolven.

Voeg aan elke kolf vijf milliliter LB-media toe, aangevuld met 50 microgram per milliliter ampicilline en inentule met één E.coli-kolonie. Kweek de cultuur 's nachts in een vloer incubator shaker bij 250 rpm en 37 graden Celsius. Bereid vervolgens twee liter verbijsterde Erlenmeyer-kolven met 500 milliliter tb-media, aangevuld met 50 microgram per milliliter ampicilline.

Inenting elke twee liter kolf met een vijf milliliter starter cultuur. Plaats de kolven in een shaker bij 250 tpm en 37 graden Celsius. Monitor de culturen periodiek met behulp van een spectrofotometer en laat de culturen groeien tot OD600 tussen 0,8 en 1.

Om T7 RNA polymerase expressie te induceren, voeg aan elke kolf drie milliliter van 100 millimolar IPTG toe om 0,6 millimolar te bereiken. Blijven groeien de culturen tot OD600 is ongeveer vier. Nadat de culturen de gewenste optische dichtheid hebben bereikt, breng je de suspensie van elke Erlenmeyer-kolf over in twee gesteriliseerde centrifugebuizen van 250 milliliter.

Centrifugeren de buizen op 7,000 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg. Resuspend elke pellet in 250 milliliter koude S30 lysate buffer met behulp van een roerder indien gewenst.

Centrifuge op 7.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg alle pellets samen in 15 milliliter koude S30 lysate buffer. Filter de vering met gaaspads.

Voordat u doorgaat naar de volgende stap, u de tips vooraf koelen in 1,5 milliliter flesjes die nodig zijn voor het opslaan van het lysaat. Homogenize de schorsing twee keer. Gebruik een werkdruk van 15.000 PSI met een luchtdruk van vier bar voor celbreuk.

Verzamel het homogenaat. Voeg 100 microliter van 0,1 molaire DTT per 10 milliliter van de gehomogeniseerde suspensie toe. Centrifuge de suspensie op 24, 700 keer g op 30 minuten bij vier graden Celsius.

DTT en chloroform worden geclassificeerd als irriterend en schadelijk en moeten daarom met zorg worden behandeld. Chloroform dat later in het protocol wordt gebruikt, moet worden gebruikt in een gebied met rookextractie. Voer de stap snel uit om de lysate-activiteit te behouden.

Plaats 200 microliter aliquots van supernatant in voorgekoelde flesjes en onmiddellijk snap bevriezen met vloeibare stikstof. Bewaar de flesjes op negatieve 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Los POPC en cholesterol in chloroform afzonderlijk op tot een uiteindelijke concentratie van 100 milligram per milliliter.

Vortex elk flesje afzonderlijk. Combineer de componenten in een twee milliliter glazen flacon. Voeg 50 microliter van de cholesterol-chloroform oplossing, 50 microliter van de POPC-chloroform oplossing, en 500 microliters van minerale olie.

Vortex de flacon, dan om de chloroform verdampen, verwarm het voor ongeveer een uur op 80 graden Celsius in een chemische kap. Bereid voor het begin van de productiefase van synthetische cellen de buitenste, pre-innerige en voedingsoplossingen voor, zoals beschreven in het manuscript. Plaats vervolgens 1,2 milliliter van de buitenste oplossing in een buis van 15 milliliter en voeg langzaam een laag van 500 microliter lipiden-in-olie oplossing van de eerste glazen flacon.

Broed de buis 20 minuten op kamertemperatuur. Om de innerlijke oplossing voorbereiding af te ronden, meng op ijs tot een uiteindelijk volume van 100 microliter door het toevoegen van S30-T7 lysate en DNA plasmid. Voeg 100 microliter van de binnenoplossing met lysaat en plasmid toe aan de tweede twee milliliter glazen flacon met 500 microliter lipiden-in-olie oplossing.

Pipet op en neer krachtig voor een minuut en dan vortex voor een minuut op niveau vijf. Na het uitbroeden van de resulterende emulsie gedurende 10 minuten op gemalen ijs, langzaam voeg de emulsie op de top van de oliefase in de 15 milliliter buis. Centrifugeren de buis gedurende 10 minuten op 100 keer g en vier graden Celsius.

Dan centrifugeren gedurende 10 minuten op 400 keer g en vier graden Celsius. Tegen het einde van de centrifugatie moet een pellet aan de onderkant van de buis waarneembaar zijn. Om de pellet te extraheren, verwijder eerst de overtollige olielaag.

Laad vervolgens een bijgesneden pipetpunt met ongeveer 400 microliters buitenoplossing en gebruik de pipetpunt om de pellet te verzamelen, waardoor de buitenste oplossing vrijkomt als de pipetpunt door de oliefase gaat. Veeg de pipetpunt af en breng de pellet over op een schone buis van 1,5 milliliter. Centrifugeren de pellet gedurende 10 minuten op 1,000 keer g en vier graden Celsius.

Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 100 microliter van voeding oplossing. Voor eiwitexpressie, incubeer de suspensie gedurende twee uur bij 37 graden Celsius zonder te schudden. Plasmids die het model eiwit sfGFP en Renilla luciferase uitdrukken werden geïntroduceerd in celvrije eiwitsynthese, CFPS bulkreacties en synthetische cellen.

De eiwitproductie werd geëvalueerd met behulp van verschillende methoden. Westerse vlek analyse gedetecteerd sfGFP His6 productie in zowel CFPS bulk reacties en in synthetische cellen. Gezuiverde sfGFP His6 werd gebruikt als een positieve controle.

Een fluorescerende microscoop met een Brightfield en een GFP filter tonen synthetische cellen die sfGFP produceren. Flow cytometrie werd gebruikt om sfGFP producerende synthetische cellen te analyseren. De berekening van de actieve synthetische celpopulatie was gebaseerd op de sfGFP-fluorescentieintensiteitsdrempel gedefinieerd door het negatieve DNA-monster dat wordt vertegenwoordigd door het rode histogram.

Gemiddelde fluorescentie intensiteit van sfGFP produceren synthetische cellen werd berekend van de actieve synthetische cel populatie en genormaliseerd tot de negatieve DNA-monster. De diameterverdelingen van de actieve synthetische cellen werden berekend op basis van het sfGFP-signaal. Renilla luciferase activiteit werd gekwantificeerd met luminescentie metingen.

Deze methode is zeer veelzijdig en kan worden geoptimaliseerd voor verschillende doeleiwitten door het veranderen van lysate oorsprong, lipide samenstelling en innerlijke oplossing concentraties. FACS-analyse van synthetische cellen die een fluorescerend markereiwit produceren, kan worden uitgevoerd om kwantitatieve waarde te leveren van de fractie van actieve synthetische cellen. Westerse vlekanalyse zou de eiwitproductie meten.