Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen

Microfluidics is een opkomende techniek voor het voorbereiden van liposomen van een tunable nanodeeltjesgrootte en met grote reproduceerbaarheid en schaalbaarheid. Dit protocol maakt de continue hoge door de productie van lage temperatuur gevoelige liposomen voor co-laden met een chemotherapeutische drug zoals doxorubicine en een fluorescerende kleurstof zoals indocyanine groen. Celvoorbereiding voornamelijk gebruik maken van een top down aanpak, zoals lipide film hydratatie en extrusie.

Het blijft een uitdaging om grote en reproduceerbare batches voor klinische toepassingen voor te bereiden. Een groot voordeel van microfluidics is de mogelijkheid om klein vloeibaar volume te verwerken met een hoge controleerbaarheid in ruimte en tijd tijdens het werken op een continue en geautomatiseerde manier. Het aantonen van de procedure met Calvin Cheung zal Guanglong Ma en Amalia Ruiz, de post-doctorale onderzoekers van mijn laboratorium.

Voor het monteren van de spuitpompen, gebruik maken van de pomp-to-pomp netwerkkabel om de computer poort van de secundaire spuit pomp aan te sluiten op de netwerkpoort van de master spuit pomp. Gebruik de pc om netwerkkabel te pompen om de computerpoort van de hoofdpomp aan te sluiten op de RS-232 seriële poort van de computer. Gebruik een moer en ferrule om de staggardrebotmicromixer microfluïde apparatuur te monteren om buizen aan te sluiten op elk van de inhammen en uitlaten van het apparaat.

Gebruik dan een tweede moer en ferrule en een vakbondsvergadering om de terminal van de slang voor beide inhammen om te zetten in een vrouwelijke luer. Als u de pompbesturingssoftware wilt instellen, gebruikt u de installatieknop van de spuitpomp om het adres van de hoofdspuitpomp en de secundaire spuitpomp toe te wijzen aan respectievelijk Ad:01 en Ad:02 en opent u vervolgens de pompbesturingssoftware op de computer. De twee spuitpompen moeten automatisch worden gedetecteerd, gevolgd door een piepend geluid.

Selecteer de diameter HSW Norm-Ject 5cc is gelijk aan 12,45 om de diameter toe te wijzen aan 12,45 millimeter. Stel de snelheid in op 0,25 milliliter per minuut voor pomp één en 0,75 milliliter per minuut voor pomp twee. Stel het volume in op een waarde van meer dan vijf milliliter en selecteer de infusiemodus voor beide pompen.

Klik vervolgens op ingesteld om de instellingen te bevestigen. Om een LTSL10 of LTSL10 ICG lipide mengsel voor te bereiden, gebruik maken van een vijf milliliter luer lock spuit om een milliliter lipide mengsel en nog eens vijf milliliter luer lock spuit te trekken ten minste drie milliliter van ammoniumsulfaat oplossing. Schuif de vatflens van de spuit naar de spuithouder van de pomp om de geladen spuiten rechtop op de spuitpompen te installeren en bevestig de zuigerflens van de spuit aan het duwblok van de pomp en wikkel het andere uiteinde van de verwarmingstape en de temperatuursonde met de thermostaat rond de spuit met de lipideoplossing.

Wikkel het uiteinde van de verwarmingstape op de spuit met de waterige oplossing, sluit de spuit met het lipidemengsel aan op de ethanolinlaat en sluit de spuit met de ammoniumsulfaatoplossing aan op de waterige inlaat. Pas de zuigerpositie aan om eventuele luchtbellen uit de spuiten te verwijderen en sluit de verwarmingstape in intervallen van 10 seconden aan totdat de temperatuur van de spuiten ongeveer 51 graden bereikt. Wanneer de thermostaat een geschikte temperatuur toont, klikt u op alles in de pompbesturingssoftware om de spuitpompen uit te voeren en te controleren of de vloeistofstroom vrij is van luchtbellen en eventuele lekkage.

Verzamel de liposoom monsters in een flacon en pauzeer of stop de infusie wanneer een van beide spuit is bijna leeg. Anneal de verzamelde liposoom oplossingen in een 60 graden Celsius waterbad voor 1-1/2 uur voor de overdracht van de oplossingen voor dialyse buizen voor dialyse tegen een liter van 240 millimolar ammoniumsulfaat gedurende ten minste vier uur bij 37 graden Celsius. Bewaar vervolgens de gezuiverde liposomen op vier graden Celsius.

Voor het op afstand laden van de liposomen door transmembrane pH-gradiënt, laad 25 milliliter HBS op de bovenkant van een grootteuitsluitingschromatografiekolom en laat het hele eluent door de kolom stromen. Laad een milliliter dialyseerde liposomen aan de kolom. Wanneer alle lipideoplossing door de kolom is gegaan, voegt u 1,5 milliliter verse HBS toe aan de kolom.

Wanneer alle buffer door de kolom is gegaan, voegt u drie milliliter verse HBS toe aan de kolom en verzamelt u het eluent. Voeg vervolgens DOX-oplossing toe bij een 1:20 DOX:fosfolipid molar ratio tot een milliliter bufferuitwisseling liposoom oplossing in een Biju flacon en plaats de flacon in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 1-1/2 uur. Na het laden, zuiveren van de liposomen door grootte uitsluiting chromatografie zoals net aangetoond.

Voor laser verwarming geïnduceerde trigger release van de liposoom inhoud, zet het waterbad op 37 graden Celsius. Wanneer de temperatuur is gestabiliseerd, voeg 200 microliters van DOX geladen liposomen aan elke put van een duidelijke 96-put plaat en plaats de plaat in het water bad met de bodem ondergedompeld in het water. Stel vervolgens de stroom van het lasersysteem in op 2,27 ampère en plaats de collimator van het lasersysteem vijf centimeter verticaal boven het oppervlak van de 96-putplaat.

Schakel de laser in en gebruik een glasvezeltemperatuursonde om de temperatuur één keer per minuut te controleren. Op vijf en 10 minuten, aspirate 10 microliters van DOX geladen liposomen uit elke put van de heldere 96-put plaat en voeg 190 microliter van HBS aan drie individuele putten van een zwarte 96-put plaat. Om de volledige afgifte van geneesmiddelen te beoordelen, meng je 10 microliter van de liposomen met 170 microliter HBS en 20 microliters van 1%Triton X-100 wasmiddeloplossing in drie afzonderlijke putten van de zwarte 96-putplaat.

Meet vervolgens de DOX fluorescentieintensiteit op een plaatlezer. Microfluïde productie van LTSL4 resulteert in een gelachtige viskeuze oplossing geïllustreerd door het grote aantal gevangen luchtbellen, terwijl de voorbereiding van LTSL10 resulteert in de vorming van een duidelijke niet-viskeuze vloeistof. Dynamische lichtverstrooiingsmeting van LTSL10 die bij 51 graden Celsius wordt bereid, toont de verwachte Z-gemiddelde diameter en spreiding aan die het succes van het experiment aangeven.

Wanneer LTSL10 wordt bereid bij 20 graden Celsius, worden echter grotere en meer verspreide liposomen verkregen, wat resulteert in een suboptimaal product. LTSLs bereid door de conventionele methode van lipide film hydratatie met extrusie tonen een DOX inkapseling efficiëntie van 50-80%Met annealing, LTSL10 bereid door microfluidics resulteert in een aanzienlijke toename van dox inkapseling efficiëntie tot een gemiddelde van 85%, wat wijst op het succes van de externe belasting van DOX en de aanwezigheid van de transmembrane pH gradiënt. Het DOX-releaseprofiel van LTSL10 is bepaald dat het temperatuurgevoelig is.

LTSL10 heeft een relatief brede fase overgang met het begin op 41,6 graden Celsius die pieken op 42,6 graden Celsius. De efficiëntie van de ICG-belasting is afhankelijk van de initiële ICG-concentratie en de grootte en spreiding van de monsters. Verder, LTSL10 ICG bestraling met een nabij infrarood laser induceert fotothermale verwarming triggering de release van DOX.

Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om een stabiele vloeistofstroom te garanderen, zodat het mengen van vloeistof en dus de vorming van liposomen reproduceerbaar blijven. Liposoom annealing en dialyse zijn twee belangrijke stappen voor het waarborgen van een stabiele liposoom formulering met een hoge laadcapaciteit. In vivo testen kunnen ook worden uitgevoerd om LTSL10 bio-distributie, drug release, en antikanker activiteit te beoordelen.

Ons protocol kan worden gebruikt voor de succesvolle microfluïde productie van cholesterolvrije lysolipid-bevattende thermogevoelige liposomen voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen.