Name: Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer de microfluïdische productie van temperatuurgevoelige liposomen met lysolipiden voor gecontroleerde afgifte van doxorubicine. Deze methode optimaliseert de co-inkapseling van therapeutica en fluorescentiekleurstoffen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), en de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) voor financiering.

1. Uitrustingsopstelling
<ol><li>Monteer de spuitpompen en SHM als volgt.<ol>
<li>Sluit de "To Computer"-poort van de secundaire spuitpomp (Pomp 02, voor waterige oplossing) aan op de "To Network"-poort van de hoofdspuitpomp (Pomp 01, voor ethanollipideoplossing) met behulp van Pomp to Pump-netwerkkabel(figuur 1, geel).</li>
		<li>Sluit de poort "To Computer" van de hoofdpomp aan op de "RS232 Serial"-poort van de computer met behulp van pc op pompnetwerkkabel(figuur 1, blauw).</li>
		<li>Sluit buizen aan op elk van de inhammen en uitlaten van de SHM met behulp van een moer en ferrule. Zet de terminal van de slang voor beide inhammen om in vrouwelijke Luer met behulp van een andere moer en ferrule en een unie vergadering. Langere slang van de inhammen maakt het gemakkelijker gehechtheid aan de spuiten(figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel de pompbesturingssoftware in.<ol>
<li>Wijs het adres van de hoofdspuitpomp en de secundaire spuitpomp toe aan respectievelijk 'Advertentie:01' en 'Advertentie:02', met de knop 'Setup' van de spuitpomp. Dit hoeft alleen maar voor de eerste keer te gebeuren.</li>
		<li>Open de pompbesturingssoftware op de computer. De twee spuitpompen moeten automatisch worden gedetecteerd, gevolgd door een piepend geluid. Klik anders op Pompen en Zoek naar pompen om de verbinding bij te werken. (Figuur 3).</li>
		<li>Geef diameter toe aan 12,45 (mm) door te kiezen voor "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)".</li>
		<li>Wijs Tarief toe aan 0,25 mL/min voor pomp 01 (ethanol lipideoplossing) en 0,75 mL/min voor pomp 02 (waterige oplossing). De stroomsnelheden komen overeen met een totale stroomsnelheid (TFR) van 1 mL/min en water-tot-ethanol stroomsnelheid ratio (FRR) van 3.</li>
		<li>Volume toewijzen aan waarden boven 5 mL. OPMERKING: Het beoogde infusievolume is groter dan het geladen vloeistofvolume, rekening houdend met het lege volume van de slang.</li>
		<li>Selecteer de INF-modus (infusie) voor beide pompen.</li>
		<li>Druk op Set om de instellingen te bevestigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. De LTSL's voorbereiden
<ol><li>Bereid een LTSL10- of LTSL10-ICG-lipidemengsel voor (zie tabel 1).</li>
	<li>Trek 1 mL lipidemengsel en ten minste 3 mL (NH4)2SO4 oplossing met behulp van twee 5 mL Luer lock spuiten.</li>
	<li>Installeer de twee spuiten op de spuitpompen in de rechtopstaande positie door de loopflens van de spuit naar de spuithouder van de pomp te schuiven en de zuigerflens van de spuit naar het duwblok van de pomp te schuiven (figuur 4).</li>
	<li>Wikkel het uiteinde van de verwarmingstape met de waterige oplossing in de spuit. Wikkel het andere uiteinde van de verwarmingstape en temperatuursonde van de thermostaat rond de spuit met de lipideoplossing. Het is nuttig om deze stap te oefenen met lege spuiten op zijn plaats om het assemblageproces te vergemakkelijken (figuur 5A).</li>
	<li>Sluit de twee spuiten aan op de vrouwelijke Luer adapters van de overeenkomstige inhammen van de SHM. Zorg ervoor dat de spuiten met het lipidemengsel en (NH4)2SO4-oplossingen respectievelijk ethanolinlaat en waterige inlaat zijn aangesloten. Pas de dompelpositie aan om luchtbellen uit de spuiten te verwijderen (figuur 5B). LET OP: Zorg ervoor dat de spuiten nog steeds veilig op de spuithouder van de pompen zijn geplaatst.</li>
	<li>Verwarm de spuiten op tot boven de 51 °C met behulp van de verwarmingstape met behulp van een 10 s verwarmingssessie. Laat de thermostaat de temperatuur van de spuiten bijwerken. Herhaal deze stap in de volgende stappen om de temperatuur tijdens de infusie te behouden. LET OP: Schakel de verwarmingstape na 10 s uit om temperatuuroverschrijding te voorkomen en laat de thermostaat de werkelijke temperatuur bijwerken. De verwarmingstape moet ook met zorg worden behandeld, omdat de temperatuur zeer snel stijgt. Verwarming kan continu de apparatuur en spuiten beschadigen, als gevolg van de vertraging van de thermostaat voor het bijwerken van de gemeten temperatuur.</li>
	<li>Zodra de temperatuur boven de 51 °C ligt, voert u de spuitpompen uit door op Run All in de pompcontrolesoftware te drukken (figuur 3).</li>
	<li>Zorg ervoor dat de vloeistofstroom vrij is van luchtbellen en eventuele lekkages. Gooi het initiële volume (ongeveer 0,5 mL) vloeistof uit de uitlaat als afval. OPMERKING: Dit initiële afvalvolume is niet definitief en is afhankelijk van het interne volume van de installatie, dat is het volume voor vloeistof om van de spuiten door de slang en SHM naar de uitlaat te reizen.</li>
	<li>Verzamel de rest van de vloeistof als liposoommonsters in een microcentrifugebuis of bijou flacon.</li>
	<li>Pauzeer/stop de infusie wanneer de vloeistof in een van de spuiten bijna leeg is. OPMERKING: De pompen moeten handmatig worden gestopt, omdat de pompen de positie wanneer de spuiten leeg zijn niet nauwkeurig kunnen detecteren.</li>
	<li>Plaats de verzamelde liposoomoplossingen in een waterbad van 60 °C tot 1,5 uur. OPMERKING: Deze stap is essentieel bij het inschakelen van het laden van geneesmiddelen in de liposomen.</li>
	<li>Breng de oplossingen over naar dialysebuizen. Dialyze de oplossingen tegen 1 L van 240 mM (NH4)2SO4 bij 37 °C gedurende ten minste 4 uur om gezuiverde liposomen te verkrijgen. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Liposomen bij deze stap zijn op 5 mM fosfolipide. Gezuiverde liposomen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C.</li>
	<li>Om de SHM schoon te maken voor herhaald gebruik, spoel de SHM achtereenvolgens door met gedeïoniseerd water, ethanol en droog met stikstofgas.</li>
</ol>3. Externe belasting van DOX in LTSLs door transmembraan pH-gradiënt
<ol><li>Wissel externe buffer van LTSLs uit in HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) met behulp van size exclusion chromatografie (SEC) om een transmembraanpH-gradiënt vast te stellen.<ol>
<li>Voeg in totaal 25 mL HBS toe aan de bovenkant van een SEC-kolom om de kolom voor te bereiden. Laat alle eluent door de kolom lopen en gooi het eluaat weg.</li>
		<li>Voeg 1 mL dialyzed liposomen, bereid vanaf stap 2.12, toe aan de kolom en gooi de uitlijn weg.</li>
		<li>Voeg 1,5 mL HBS toe aan de kolom en gooi de uitlaris weg.</li>
		<li>Voeg 3 mL HBS toe aan de kolom en verzamel de 3 mL uituit. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Liposomen worden verzameld bij deze stap en zijn op 1,67 mM fosfolipiden. Buffer uitgewisseldliposomen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer LTSLs met doxorubicin (DOX) en zuiver LTSLs.<ol>
<li>Voeg DOX-oplossing toe in 1:20 DOX-to-fofolipide molverhouding in 1 mL buffer-exchanged liposomen oplossing (1,67 mmol) in een bijou flacon. Dit kan worden bereikt door toevoeging van 48,4 μL van 1 mg/mL DOX-oplossing (83,4 μmol).</li>
		<li>Plaats de bijou flacon gedurende 1,5 uur in een waterbad van 37 °C om DOX in de liposomen te kunnen laden.</li>
		<li>Meng 10 μL van de liposomen met 170 μL HBS en 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 oplossing in een zwarte 96-put plaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "vóór zuivering" DOX-gehalte.</li>
		<li>Meng bij de voorbereiding van LTSL10-ICG 40 μL van de liposomen met 160 μL DMSO in een duidelijke 96-putplaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "vóór zuivering" ICG-gehalte.</li>
		<li>Zuiver de liposoomoplossing zoals beschreven in stap 3.1. OPMERKING: Om de kolom te hergebruiken voor toekomstige zuivering, reinigt u de kolom van gratis DOX door eerst 1 mL verdunde 0,5 M NaOH-oplossing toe te voegen voordat u stap 3.1.1 uitvoert. Gratis DOX in het rood zal worden violet-blauw en elute door de kolom snel.</li>
		<li>Meng 30 μL van de gezuiverde liposomenoplossing met 150 μL HBS en 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 oplossing in een zwarte 96-put plaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "nazuivering" DOX-gehalte.</li>
		<li>Meng in het geval van LTSL10-ICG 40 μL van de gezuiverde liposomenoplossing met 160 μL DMSO in een heldere 96-putplaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "nazuivering" ICG-gehalte.</li>
		<li>Meet de DOX fluorescentieintensiteit van de putten vóór (stap 3.2.3) en na (stap 3.2.5) zuivering, met behulp van een microplate reader (λex = 485 nm, λem = 590 nm).</li>
		<li>Bereken de inkapselingsefficiëntie van DOX (DOX EE) door de verhouding van de fluorescentieintensiteiten voor en na de zuivering in te nemen. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq1.jpg">
</li>
		<li>Meet de ICG-absorptie van de putten voor en na zuivering met behulp van een microplaatlezer (600 tot 1000 nm).</li>
		<li>Bereken de inkapselingsefficiëntie van ICG (ICG EE) door de verhouding van de absorptie op 792 nm voor en na zuivering te nemen, rekening houdend met de verdunningsfactor (3 keer) tijdens de zuivering. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq2a.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dynamic Light Scattering (DLS)
<ol><li>Voeg 50 μL liposomenoplossing (stap 2.12) toe aan 450 μL gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Plaats de cuvette in het DLS-instrument en voer de meting uit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Noteer de gemiddelde Z-gemiddelde diameter en dispersie van drie metingen voor elk monster.</li>
</ol>5. Differentiële scancalorimetrie (DSC)
<ol><li>Concentraat 1 mL van de liposomen monsters (stap 2.12) met een centrifugale filter eenheid tot 0,5 mL (uiteindelijke lipide concentratie van 10 mM). Met behulp van een rotor met vaste hoek draait u ongeveer 15 min op 7500 x g.</li>
	<li>Breng 20 μL (NH4)2SO4-oplossing en liposomenmonsters over naar twee respectievelijke DSC-pannen. Sluit de pannen af met DSC hermetische deksels met behulp van de DSC sample press kit.</li>
	<li>Meet het monster van 30 °C tot 60 °C met een verwarmingssnelheid van 1 °C/min met behulp van een differentiële scancalorimeter.</li>
	<li>Analyseer de gegevens met de juiste software. Neem de faseovergangstemperatuur (Tm)als het begin van de faseovergang (smeltpiek), die wordt gemeten door de x-interceptie van de raaklijn van het punt van maximale helling.</li>
</ol>6. Doxorubicin release
<ol><li>Verwarm HBS voor bij de aangewezen temperatuur (37 of 42 °C) met behulp van een waterbad. Bereid een ijswaterbad voor om de monsters te blussen.</li>
	<li>Voeg 100 μL gezuiverde DOX-geladen liposomen (stap 3.2.5) toe in 1,9 mL HBS in een microcentrifugebuis. Plaats de buis in het waterbad van de aangewezen temperatuur.</li>
	<li>Trek onmiddellijk 200 μL monsters uit de buis en plaats deze snel in het ijswaterbad om eventuele daaropvolgende medicijnafgifte te blussen. Dit monster komt overeen met het initiële (t = 0) tijdspunt.</li>
	<li>Trek 200 μL monsters op de volgende tijdpunten (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) en plaats het snel in het ijswaterbad om eventuele drugsvrijgave te blussen.</li>
	<li>Meng 50 μL monster van elk tijdpunt met 150 μL HBS in een zwarte 96-putplaat. Meet de DOX fluorescentieintensiteit met behulp van een plaatlezer.</li>
	<li>Voeg 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 toe aan willekeurig geselecteerde putten bereid in stap 6.5. Meet de DOX fluorescentieintensiteit van deze putten met behulp van een plaatlezer. Deze waarden komen overeen met het volledig vrijgegeven (t = ∙; 100% release) tijdpunt.</li>
	<li>Bereken en plot het percentage DOX dat is vrijgegeven door de fluorescentieintensiteit van elke tijdpunten (I(t)) te interpoleren, vergeleken met de initiële (I(0)), en volledig vrijgegeven (I(∙)), waarde. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq3.jpg">
</li>
</ol>7. Laserverwarming en geactiveerde release
<ol><li>Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C en laat de temperatuur stabiliseren.</li>
	<li>Voeg 200 μL DOX geladen LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/mL) toe aan een heldere 96-putplaat en plaats deze vervolgens in het waterbad, houd de bodem ondergedompeld in water.</li>
	<li>Stel de stroom van het lasersysteem in op 2,27 A. Plaats de collimator van het lasersysteem op 5 cm verticaal boven het oppervlak van de 96-putplaat, wat overeenkomt met een energieflux van 0,5 W/cm2 [Figuur 6]. LET OP: Het lasersysteem moet worden gebruikt in overeenstemming met relevante laserveiligheidsmaatregelen.</li>
	<li>Schakel de laser in en controleer de temperatuur elke minuut met behulp van een glasvezeltemperatuursonde.</li>
	<li>Trek bij 5 en 10 min 10 μL laserbestraalde liposomen van de heldere 96-putplaat op en meng met 190 μL HBS voor drie putten in een zwarte 96-putplaat.</li>
	<li>Meng 10 μL van de liposomen met 170 μL HBS en 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 oplossing voor drie putten in een zwarte 96-put plaat. Deze putten komen overeen met de "100% vrijgegeven" DOX-inhoud. Meet de DOX fluorescerende intensiteit en bereken de DOX-release zoals beschreven in stap 6.7.</li>
</ol>

<ol><li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+%28LTSL%29%3A+effects+of+the+lipid+composition+%28lysolipid+and+DSPE-PEG2000%29+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li>
<li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li>
<li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li>
<li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip%3A+microfluidics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li>
<li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li>
<li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer%3A+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li>
<li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Mixing+in+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li>
<li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li>
<li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+Mixer+for+Microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).</li>
<li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+the+influence+of+alcohol%3A+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li>
<li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine%3A+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li>
<li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li>
<li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li>
<li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li>
<li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li>
<li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li>
<li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome%3A+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li>
<li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li>
<li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29(2016).</li>
<li>Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gepresenteerde protocol beschrijft de bereiding van lage temperatuurgevoelige liposomen (LTSLs) met behulp van een gespreide visgraatmicromixer (SHM). De LTSL10-formulering maakt het mogelijk om de temperatuur geactiveerde burst-release van doxorubicin binnen 5 minuten bij een klinisch haalbare hypertherische temperatuur van 42 °C. Indocyanine groen (ICG) kan ook worden meegeladen voor fotothermische verwarming veroorzaakt de release van DOX. De methode is gebaseerd op: i) zelfassemblage van fosfolipiden tot liposome...

LTSL-formulering is een klinisch relevant liposomale product dat is ontwikkeld om het chemotherapeutische medicijn doxorubicin (DOX) te leveren en maakt het mogelijk om een efficiënt burst-medicijn vrij te laten bij klinisch haalbare milde hyperthermie (T ∙ 41 °C)1. De LTSL formulering bestaat uit 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), de lysolipide 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosphatidylcholine (MSPC; M staat voor "mono") en PEGylated lipide 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Bij het bereiken van de faseovergangstemperatuur (Tm ∙ 41 °C) vergemakkelijken de lysolipide en DSPE-PEG2000 samen de vorming van membraanporiën, wat resulteert in een burst-afgifte van het medicijn2. De voorbereiding van LTSLs maakt voornamelijk gebruik van een bulk top-down benadering, namelijk lipide film hydratatie en extrusie. Het blijft een uitdaging om grote partijen met identieke eigenschappen en in voldoende hoeveelheden voor klinische toepassingen te bereiden3.
Microfluidics is een opkomende techniek voor het voorbereiden van liposomen, het aanbieden van tunable nanodeeltjes grootte, reproduceerbaarheid, en schaalbaarheid3. Zodra de productieparameters zijn geoptimaliseerd, kan de doorvoer worden opgeschaald door parallelisatie, met eigenschappen die identiek zijn aan die welke zijn voorbereid op bankschaal3,4,5. Een groot voordeel van microfluidica ten opzichte van conventionele bulktechnieken is de mogelijkheid om kleine vloeibare volumes met een hoge controleerbaarheid in ruimte en tijd te verwerken door middel van miniaturisatie, waardoor een snellere optimalisatie mogelijk is, terwijl het op een continue en geautomatiseerde manier werkt6. De productie van liposomen met microfluïde apparaten wordt bereikt door een bottom-up nanoneerslagbenadering, die meer tijd en energie-efficiënt is omdat homogenisatieprocessen zoals extrusie en sonicatie overbodig zijn7. Typisch, een organische oplossing (bijvoorbeeld ethanol) van lipiden (en hydrofobe payload) wordt gemengd met een verkeerde niet-oplosmiddel (bijvoorbeeld water en hydrofiele payload). Naarmate het organische oplosmiddel zich mengt met het niet-oplosmiddel, wordt de oplosbaarheid voor de lipiden verminderd. De lipideconcentratie bereikt uiteindelijk een kritische concentratie waarbij het neerslagproces wordt geactiveerd7. Nanoprecipitates van lipiden groeien uiteindelijk in omvang en sluiten in een liposoom. De belangrijkste factoren voor de grootte en homogeniteit van de liposomen zijn de verhouding tussen het niet-oplosmiddel en oplosmiddel (d.w.z. water-naar-organische stroomsnelheidverhouding; FRR) en de homogeniteit van het oplosmiddel milieu tijdens de zelfassemblage van lipiden in liposomen8.
Efficiënt mengen van vocht in microfluidica is daarom essentieel voor de bereiding van homogene liposomen, en verschillende ontwerpen van mixers zijn gebruikt in verschillende toepassingen9. Gespreide visgraat micromixer (SHM) vertegenwoordigt een van de nieuwe generaties passieve mixers, die een hoge doorvoer (in het bereik van mL / min) met een lage verdunningsfactor mogelijk maakt. Dit is superieur aan traditionele microfluïde hydrodynamische mengapparaten8,10. De SHM heeft patroon visgraat groeven, die snel mengen vloeistoffen door chaotische advection9,11. De korte mengtijdschaal van SHM (< 5 ms, minder dan de typische aggregatietijdschaal van 10-100 ms) maakt zelfassemblage van lipide mogelijk in een homogene oplosmiddelomgeving, waardoor nanodeeltjes met uniforme grootteverdeling3,12worden geproduceerd.
De bereiding van LTSLs met microfluidics is echter niet zo eenvoudig in vergelijking met conventionele liposomale formuleringen als gevolg van het gebrek aan cholesterol8, zonder welke lipide bilayers gevoelig zijn voor door ethanol geïnduceerde interdigitatie13,14,15. Tot nu toe is het effect van restethanol presenteert tijdens de microfluïde productie van liposomen niet goed begrepen. De meerderheid van de gerapporteerde formuleringen zijn inherent resistent tegen interdigitatie (met cholesterol of onverzadigde lipiden)16, die in tegenstelling tot LTSLs zijn zowel verzadigd en cholesterol-vrij.
Het protocol hierin gebruikt SHM om LTSLs voor te bereiden op de levering van door de temperatuur geactiveerde geneesmiddelen. In de gepresenteerde methode hebben we ervoor gezorgd dat de microfluïde-voorbereide LTSLs nanoformaat (100 nm) en uniform (dispersity < 0.2) zijn door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Verder hebben we DOX ingekapseld met behulp van de transmembraan ammoniumsulfaatgradiëntmethode (ook bekend als remote loading)17 als validatie van de integriteit van de LTSL lipide bilayer. Het laden op afstand van DOX vereist dat het liposoom een pH-gradiënt behoudt om een hoge inkapselingsefficiëntie (EE) te bereiken, wat waarschijnlijk niet zal gebeuren zonder een intacte lipidebilaag. In deze gepresenteerde methode, onderscheidend van typische microfluïde liposoom voorbereiding protocollen, een annealing stap is vereist voordat de ethanol wordt verwijderd om de remote laadvermogen mogelijk te maken; d.w.z. om de integriteit van de lipidebilaag te herstellen.
Zoals eerder vermeld, kunnen hydrofiele en hydrofobe payloads ook worden geïntroduceerd in de eerste oplossingen voor de gelijktijdige inkapseling van payloads tijdens de vorming van LTSLs. Als proof-of-concept, indocyanine groen (ICG), een FDA-goedgekeurde nabij-infrarood fluorescerende kleurstof, die ook een veelbelovende fotothermische agent, wordt ingevoerd om de eerste lipide mengsel en met succes samen geladen in de LTSLs. Een 808 nm laser wordt gebruikt om de DOX/ICG-loaded LTSLs te bestralen en met succes te induceren fotothermische verwarming-geactiveerde burst release van DOX binnen 5 min.
Alle instrumenten en materialen zijn commercieel beschikbaar, gebruiksklaar en zonder de noodzaak van maatwerk. Aangezien alle parameters voor het formuleren van LTSLs zijn geoptimaliseerd, volgens dit protocol, onderzoekers zonder voorkennis van microfluidics kon ook de LTSLs, die dient als basis van een thermogevoelig drug delivery systeem voor te bereiden.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Lipoid</td><td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td><td>Lipoid</td><td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE)</td><td></td></tr><tr><td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td><td>Avanti Polar Lipid</td><td>855775P-500MG</td><td>Gedistribueerd door Sigma-Adrich; ook bekend als Lyso 16:0 PC (Niet te verwarren met 14:0/18:0 PC, dat ook MSPC wordt genoemd)</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adapters, Female Luer Lock tot 1/4"-28UNF</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>P-624</td><td>Vereist 2 eenheden. Voor de ingangen</td></tr><tr><td>Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>P-630</td><td>Vereist 2 eenheden. (Een eenheid bevat 2 moeren en 2 ferrules)</td></tr><tr><td>Ammonium Sulfaat ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31119-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>Bijou-vial</td><td>VWR</td><td>216-0980</td><td>7 mL, heldere, polystyreen-vial</td></tr><tr><td>Centrifugeerfilterunit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801008</td><td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifuge Filter Unit</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 8R</td><td>Met HIGHconic III Fixed Angle Rotor</td></tr><tr><td>Cuvet</td><td>Fisher Scientific</td><td>11602609</td><td>Weggebruikbare polystyreen cuvet, laag volume, voor DLS meting</td></tr><tr><td>Dialyse Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURX12015-1KT</td><td>12-14 kDa MWCO</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34943-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>DLS Instrument</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicine Hydrochloride (DOX)</td><td>Apollo Scientific</td><td>BID0120</td><td></td></tr><tr><td>DSC Instrument</td><td>TA Instruments</td><td>TA Q200 DSC</td><td></td></tr><tr><td>DSC Tzero Hermetic Lids</td><td>TA Instruments</td><td>901684.901</td><td>Voor DSC meting</td></tr><tr><td>DSC Tzero Pans</td><td>TA Instruments</td><td>901683.901</td><td>Voor DSC meting</td></tr><tr><td>DSC Tzero Sample Press Kit</td><td>TA Instruments</td><td>901600.901</td><td>Voor DSC meting</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>Absoluut, &ge;99,8%</td></tr><tr><td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td><td>CNI Optoelectronics Tech</td><td>FC-808-8W-181315</td><td>FOC-01-B Fiber Collimator inbegrepen.</td></tr><tr><td>Ferrule, 1/4"-28UNF naar 1/16" OD</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>P-200</td><td>Voor de uitlaat</td></tr><tr><td>Fibre Optic Temperatuur Sonde</td><td>Osensa</td><td>PRB-G40</td><td></td></tr><tr><td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingstape</td><td>Omega</td><td>DHT052020LD</td><td>Kan worden vervangen door andere spuitverwarming zoals "HTC" of "SRT series" voor langzamere verwarming. Handmatig aansluiten op een 3-pins stekker vereist voor 240V modellen</td></tr><tr><td>Indocyaangroen</td><td>Adooq</td><td>A10473-100</td><td>Gedistribueerd door Bioquote Limited (U.K.)</td></tr><tr><td>Luer-lock spuit, 5 mL</td><td>VWR</td><td>613-2043</td><td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-delige spuiten, O.D. 12.45 mm</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td>Geïnstalleerd met 485 nm (excitatie) en 590 nm (emissie) filters</td></tr><tr><td>Microplate, 96-well, Zwart, Flat-bottom</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>611F96BK</td><td>Voor fluorescentiemeting in microplate reader</td></tr><tr><td>Microplate, 96-well, Helder, Flat-bottom</td><td>Grenier</td><td>655101</td><td>Voor absorptiemeting microplate reader</td></tr><tr><td>Moer, 1/4"-28UNF naar 1/16" OD</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>P-245</td><td>Voor de uitlaat</td></tr><tr><td>PC naar Pomp Netwerk Kabel voor Aladdin, 7ft</td><td>World Precision Instruments</td><td>NE-PC7</td><td>Optioneel: Spuitpompen kunnen handmatig worden bediend</td></tr><tr><td>Pompbesturingssoftware - SyringePumpPro Software Licentie voor 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td><td>Optioneel: Spuitpompen kunnen handmatig worden bediend</td></tr><tr><td>Pomp naar Pomp Netwerk Kabel voor Aladdin, 7 ft</td><td>World Precision Instruments</td><td>NE-NET7</td><td>Optioneel: Spuitpompen kunnen handmatig worden bediend</td></tr><tr><td>Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) kolom</td><td>GE Life Science</td><td>17085101</td><td>Sephadex G-25 hars in PD-10 Desalting Kolommen</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpompen &amp; Kabel (DUAL-PUMP-NE-1000)</td><td>World Precision Instruments</td><td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermostaat Temperatuur Controller</td><td>Inkbird</td><td>ITC-308</td><td>Kan worden vervangen door andere spuitverwarming kit/thermostaat</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubing, ETFE (1/16" OD)</td><td>IDEX Health &amp; Science</td><td>1516</td><td></td></tr><tr><td>USB naar RS-232 Converter</td><td>World Precision Instruments</td><td>CBL-USB-232</td><td>Optioneel: Voor computer zonder RS-232 poort</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant Instruments Ltd.</td><td>JB Nova 12</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Het gepresenteerde protocol maakt een continue voorbereiding met hoge doorvoer mogelijk van lage temperatuurgevoelige liposomen (LTSLs), die chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen laden, zoals doxorubicin (DOX). Om dit te bereiken, worden een ethanolisch lipidenmengsel en ammoniumsulfaatoplossing geïnjecteerd in een gespreide visgraatmicromixer (SHM) microfluïdisch apparaat. De oplossingen worden snel gemengd door de SHM, het verstrekken van een homogene oplosmiddel omgeving voor liposomen zelfassemblage. Verzamelde liposomen worden eerst ingeannealed, vervolgens dialyseerd om resterende ethanol te verwijderen. Een ammoniumsulfaatpH-gradiënt wordt vastgesteld door bufferuitwisseling van de externe oplossing met behulp van grootteuitsluitingschromatografie. DOX wordt dan op afstand geladen in de liposomen met een hoge inkapseling efficiëntie (> 80%). De verkregen liposomen zijn homogeen in grootte met Z-gemiddelde diameter van 100 nm. Ze zijn in staat om door de temperatuur geactiveerde burst-release van ingekapselde DOX in aanwezigheid van milde hyperthermie (42 °C). Indocyanine groen (ICG) kan ook worden meegeladen in de liposomen voor bijna-infrarood laser-triggered DOX release. De microfluïde benadering zorgt voor een hoge doorvoer, reproduceerbare en schaalbare voorbereiding van LTSLs.

De bereiding van LTSLs door microfluidics vereist de lipidesamenstelling van DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molaire verhouding; LTSL10). Figuur 7A (links) toont het uiterlijk van as-prepared LTSL10 vanaf stap 2.9, als een duidelijke en niet-viskeuze vloeistof. LTSL10 formulering is ontwikkeld uit de conventionele formulering, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar ratio) sinds LTSL4 vormt een gel-achtige viskeu...

Het protocol presenteert de geoptimaliseerde parameters voor de voorbereiding van thermogevoelige liposomen met behulp van de gespreide visgraat micromixer microfluidics apparaat. Dit maakt het ook mogelijk co-inkapseling van doxorubicin en indocyanine groen in de liposomen en de fotothermale geactiveerde release van doxorubicin voor gecontroleerde / getriggerde drug release.

Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluidics is een opkomende techniek voor het voorbereiden van liposomen van een tunable nanodeeltjesgrootte en met grote reproduceerbaarheid en schaalbaarheid. Dit protocol maakt de continue hoge door de productie van lage temperatuur gevoelige liposomen voor co-laden met een chemotherapeutische drug zoals doxorubicine en een fluorescerende kleurstof zoals indocyanine groen. Celvoorbereiding voornamelijk gebruik maken van een top down aanpak, zoals lipide film hydratatie en extrusie.Het blijft een uitdaging om grote en reproduceerbare batches voor klinische toepassingen voor te bereiden. Een groot voordeel van microfluidics is de mogelijkheid om klein vloeibaar volume te verwerken met een hoge controleerbaarheid in ruimte en tijd tijdens het werken op een continue en geautomatiseerde manier. Het aantonen van de procedure met Calvin Cheung zal Guanglong Ma en Amalia Ruiz, de post-doctorale onderzoekers van mijn laboratorium.Voor het monteren van de spuitpompen, gebruik maken van de pomp-to-pomp netwerkkabel om de computer poort van de secundaire spuit pomp aan te sluiten op de netwerkpoort van de master spuit pomp. Gebruik de pc om netwerkkabel te pompen om de computerpoort van

microfluidic-production-lysolipid-containing-temperature-sensitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide...

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.

Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen ten opzichte van deze met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van één keten amfifielen. Hier beschrijven we technieken voor de voorbereiding, zuivering, en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van deze amfifielen.

Voorbereiding, zuivering, en het gebruik van vetzuur-bevattende liposomen

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

Deze beginnershandleiding presenteert een algemeen protocol voor de bereiding van Giant Unilamellaire blaasjes (GUV's) via de druppeloverdrachtsmethode, bespreekt de kritieke stappen en biedt inzichten om mogelijke aanpassingen te helpen die nodig zijn voor verschillende toepassingen, waaronder synthetische biologie en microrobotica.

De druppeloverdrachtsmethode gebruiken om op betrouwbare wijze gigantische unilamellaire blaasjes te bereiden

Leer de microfluïdische productie van temperatuurgevoelige liposomen met lysolipiden voor gecontroleerde afgifte van doxorubicine. Deze methode optimaliseert de co-inkapseling van therapeutica en fluorescentiekleurstoffen.

Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen

Meer video's verkennen