Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Single molecule force spectroscopie stelt ons in staat om fysieke parameters te meten die de mechanische en kleefeigenschappen van polymeren beschrijven. Bij het gebruik van afm-gebaseerde krachtspectroscopie om enkele moleculen te bestuderen, is het essentieel om een betrouwbaar en efficiënt protocol te hebben om deze moleculen covalent te binden aan een AFM cantilever tip. Dit protocol kan worden aangenomen om veel verschillende polymeren, ongeacht de contourlengte of hydrofobeiteit.

Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een rookkap om inademing van organische dampen te voorkomen. Daarnaast zijn oplosmiddelbestendig glas, labcoat en oogbescherming vereist. Gebruik eerst vers gereinigde pincet om AFM cantilever chips in de plasmakamer te plaatsen.

Start het plasmakameroppervlak activeringsprogramma door start te selecteren en dan ja. Controleer of het plasmaproces goed werkt. Een plasmaproces met een hoog zuurstofgehalte toont een lichtblauwe kleur.

Terwijl het oppervlakteactiveringsprogramma wordt uitgevoerd, los silane-PEG-mal in tolueen op om een concentratie van 1.25 milligram per milliliter te verkrijgen. Plaats drie milliliter van de oplossing in een platte petrischaal. Nadat het plasmaproces is voltooid, ventileer de plasmakamer door bevestigen te selecteren en vervolgens te ontluchten.

Ga onmiddellijk naar de volgende stap om absorptie van verontreinigingen te voorkomen. Plaats de chips in de petrischaal en broed de chips drie uur lang uit op 60 graden Celsius. Haal de petrischaal uit de oven en laat hem minstens 10 minuten afkoelen.

Spoel vervolgens de chips. Voor PEG- of polystyreenbinding spoelt u de spanen drie keer met tolueen. Voor polynipambinding moeten chips eenmaal met tolueen en twee maal met ethanol worden gespoeld.

Om de impact van capillaire krachten op de AFM cantilever te verminderen, kantel je de chips iets bij het spoelen. De AFM cantilever chips moeten goed worden gespoeld om eventuele overtollige fysieke polymeren die het experiment kunnen beïnvloeden te verwijderen. Spoelen moet zorgvuldig worden uitgevoerd om eventuele schade aan de AFM cantilevers te voorkomen.

Ten slotte, bereid ten minste twee chips om te dienen als controles die niet zal ondergaan covalente polymeer bevestiging. Voor controles versus PEG- en polystyreenchips spoelt u twee maal met ethanol en één keer met water. Voor controles versus polynipamchips, spoel twee keer met water.

Om covalente bevestiging van PEG of polystyreen uit te voeren, bereidt u drie milliliter polymeeroplossing in tolueen bij een concentratie van 1,25 milligram per milliliter. Voeg de oplossing en de chips toe aan een petrischaaltje en broed de chips een uur lang uit op 60 graden Celsius. Na incubatie met PEG of polystyreen laat u de chips 10 minuten afkoelen.

Spoel de chips twee keer met tolueen, twee keer met ethanol, en een keer met water. Om covalente bevestiging van polynipam uit te voeren, bereidt u drie milliliter polymeeroplossing in ethanol voor met een concentratie van 1,25 milligram per milliliter. Voeg de oplossing en de chips toe aan een petrischaaltje en broed de chips drie uur lang op kamertemperatuur uit.

Na incubatie met polynipam, spoel de chips twee keer met ethanol en twee maal met water. Om de chips op te slaan tot het gebruik in een experiment, plaats elke chip afzonderlijk in een een milliliter petrischaal gevuld met water. Hou de petrischaaltjes op vier graden Celsius.

Plaats eerst de gefunctionaliseerde AFM cantilever chip in een chiphouder. Lijm het voorbereide oppervlak in een monsterhouder die geschikt is voor metingen in vloeistof. Gebruik een pipet om de chip onder te dompelen in water.

Monteer het monsteroppervlak in de AFM. Dompel het monsteroppervlak onder in water. Sluit de chiphouder aan op de AFM.

Nader vervolgens de chip naar het monsteroppervlak. Gebruik het omgevingspaneel om de doeltemperatuur in te stellen en schakel de modus en de feedback-radioknoppen aan. Laat het systeem vervolgens ongeveer 15 minuten in evenwicht zijn.

Om een krachtuitbreidingscurve te nemen, benader je de AFM cantilever tip naar het oppervlak en selecteer je single force. De resulterende curve geeft de afbuiging tegen de piëzoafstand weer met de benadering van het in het rood weergegeven oppervlak en de in het blauw weergegeven intrekking. Vouw het gedeelte van de curve dat de inkeping van de AFM cantilever tip vertegenwoordigt in het onderliggende oppervlak.

Als u een lineaire pasvorm wilt uitvoeren, stelt u cursors in op de nadering of de intrekcurve en selecteert u INVOLS bijwerken in het contextmenu. De resulterende waarde voor de inverse gevoeligheidswaarde voor optische hendel wordt weergegeven in het paneel linksboven. Bereken na het herhalen van deze procedure ten minste vijf keer een gemiddelde voor de gevoeligheid van de inverse optische hendel en voer het gemiddelde in het paneel in.

Plaats de AFM cantilever op een hoogte van ongeveer 100 micrometer boven het oppervlak door te selecteren bewegen om vooraf in te schakelen. Om een bevredigende signaal-ruisverhouding voor het thermische ruisspectrum te krijgen, stelt u het gemiddelde aantal gemiddelden in op ten minste 10 en kiest u de hoogst mogelijke frequentieresolutie. Vervolgens registreert u het thermische ruisspectrum door het vastleggen van thermische gegevens te selecteren.

Om het thermische ruisspectrum te passen met een eenvoudige harmonische oscillatorfunctie, vouwt u het gedeelte van de curve uit dat de eerste resonantiepiek vertegenwoordigt. Selecteer vervolgens de fit initialiseren. Tot slot, verfijnen van de pasvorm met behulp van de fit thermische data knop.

De respectievelijke krachtconstante verschijnt in het paneel. Stel de parameters voor het experiment in om te beginnen met het verzamelen van de gegevens. Stel treksnelheid in op één micrometer per seconde en krachttrekker tot één nanonewton.

Benader de AFM cantilever tip naar het oppervlak en selecteer enkele kracht om een enkele curve op te nemen en te bepalen of de parameters moeten worden aangepast zoals beschreven in het manuscript. Selecteer F-kaart in het hoofdpaneel. Om een krachtkaart met 100 curven te verkrijgen, stelt u het aantal krachtpunten en krachtlijnen in op 10.

Begin met het opnemen van de force map door te selecteren doe F-kaart. Neem kracht uitbreiding bochten in een grid-achtige manier om eventuele lokale oppervlakte-effecten te voorkomen en om de gemiddelde verschillende oppervlakte. Herhaal na het experiment de bepaling van de inverse optische hendelgevoeligheid en de veerconstante om de consistentie en de stabiliteit van het systeem te controleren.

Enkele polynipam en PEG polymeren waren covalently gebonden aan een AFM cantilever tip aan de ene kant en fysisorbed op het siliciumdioxide oppervlak aan de andere kant. Om temperatuurafhankelijk rekgedrag te meten, werd een duidelijke single-molecule stretching gebeurtenis geïdentificeerd gevolgd door een laatste maximum aan het einde van de respectievelijke krachtextensiecurve. Vervolgens werd voor elke temperatuur één mastercurve gegenereerd.

Voor PEG werd een afname van de rekkracht waargenomen bij toenemende temperatuur. Voor polynipam werd de tegenovergestelde trend waargenomen. De desorptie van polystyreen uit een SAM-oppervlak in water kan worden gebruikt om de desorptiekracht en -lengte te bepalen.

Toen de polymeerbevestiging succesvol was, toonden de krachtuitbreidingscurven plateaus van constante kracht. Elk plateau was uitgerust met een sigmoïdale curve om de desorptiekracht en desorptielengte te bepalen. De waargenomen desorptiekrachten beantwoordden aan eerder verkregen waarden.

Wanneer meer dan één polymeer aan de AFM cantileverpunt werd bevestigd, werden cascades van plateaus waargenomen in de krachtuitbreidingscurven. Met twee polymeren bevestigd, werd een bimodale distributie gevonden voor de desorptielengte terwijl de desorptiekracht een smalle distributie toonde. Een gefunctionaliseerde AFM cantilever tip kan worden gebruikt om de krachtrespons van enkele moleculen in een vloeibare omgeving en met externe stimuli te kwantificeren.

Het gebruik van schone apparatuur, oplosmiddelen, AFM cantilever tips, en herhaalde spoeling is zeer belangrijk om een hoog niveau van reinheid die moet worden bevestigd voorafgaand aan de beschreven gecontroleerde experimenten te bereiken. De gepresenteerde protocollen en procedures maakten de weg vrij voor een beter begrip van responsieve polymeersystemen. De resultaten kunnen direct worden vergeleken met moleculaire dynamische simulaties.