Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Dit protocol maakt gebruik van lasermicrodissection en RNA sequencing om het differentiële mRNA-expressie van intratumor heterogeniteit te analyseren, zoals gebieden van accumulatie van mesenchymale cellen of gebieden van tumorinvasie. Deze methode is geoptimaliseerd om een goede kwaliteit weefsel histologie en RNA integriteit te behouden om de verwerving van hoge kwaliteit laser microdissection monsters te vergemakkelijken. Deze methode is gevoelig en zeer reproduceerbaar.

Het kan worden gebruikt om tumormorfologie en heterogeniteit te bestuderen in verschillende tumormodellen. Laser microdissection van bevroren hersentumorweefsel is een kosteneffectieve, betrouwbare techniek voor de isolatie van discrete anatomische gebieden van celpopulaties uit tumorweefsels om hun moleculaire profielen te bestuderen. LMD kan worden gebruikt om diepgaande mechanistische kennis over de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens tumorprogressie te krijgen, en kan nieuwe therapeutische doelen onthullen.

Een in vivo bioluminescentie van de muistumorlast bereikt een signaal tussen één keer 10 aan zes en één keer 10 aan de 7de fotonen. Spoel zuurstofhoudende tyrode oplossing door de bloedsomloop van de geëuthanaseerde tumordragende muis totdat de lever en longen volledig zijn gewist van bloed. Blijf het dier met 30% sacharoseoplossing nog 15 minuten oplossen in tyrodeoplossing.

Om het succes van de perfusie te evalueren, bevestig dan dat de nek, staart en benen stijf zijn aan het einde van de circulatie. Oogst dan de hersenen volgens standaard protocollen en bewaar de hersenen 's nachts in verse 30% sacharose oplossing. Ter voorbereiding op de cryopreservatie, vul een pot met koude isopentane-2-methylbutaan en plaats de pot in een container gevuld met vloeibare stikstof.

Terwijl het oplosmiddel is koelen, dep de hersenen droog op een stuk filter papier en plaats de hersenen in een gelabeld Cryomold. Voorzichtig bij ongeveer vijf milliliter van optimale temperatuur snijden medium naar het centrum van de Cryomold en plaats de hersenen in de mal in de gewenste oriëntatie. Met behulp van schone tangen, plaats de Cryomold snel in de gekoelde isopentane-2-methylbutaan gedurende 30 tot 40 seconden.

Zodra het snijmedium is gestold, breng de Cryomold op droog ijs en wikkel de Cryomold en snap bevroren hersenweefsel in aluminiumfolie voor min 80 graden Celsius opslag. Om bevroren hersentumorweefselsecties te verwerven, stel u eerst de temperatuur van een cryostat in tussen min 20 en min 24 graden Celsius en plaatst u het monsterblok gedurende 30 tot 60 minuten in de cryostatkamer. Terwijl het monster in evenwicht is, reinigt u de kamer- en messenhouder met 100% ethanol en spuit u de sectieborstels met RNase reinigingsoplossing.

Wanneer het monster klaar is, verwijder de mal en gebruik vers snijmedium om het bevroren weefselblok aan de monsterschijf van de cryostat te bevestigen. Plaats het blok in de schijfhouder en lijn het blok uit met het mes. Verkrijg 10 micrometersecties van de hersenen met behulp van een van de Rnase-vrije borstels om de weefselstukken zorgvuldig af te vlakken en te ontwierpen op het snijoppervlak.

Om de hersenweefselsecties op de dia's te monteren, drukt u soepel op de positief geladen kant van een gelabelde RNase-vrije PEN-glasschaars op de sectie en plaatst u de schuif in een opbergvak in de kamer. Wanneer alle dia's zijn verzameld, plaatst u de opbergdoos op min 80 graden Celsius. Om het snijmedium op te lossen voor lasermicro dissectie, dompel de dia's onder in 30-seconden sequentiële aflopende ethanol onderdompelingen, gevolgd door kristal violette oplossing vlekken gedurende 20 seconden en vijf seconden in 0,5% eosine Y oplossing.

Gebruik aan het einde van de eosine Y-incubatiefilterpapier om de dia's droog te blokkeren en de dia's te dehydrateren in opeenvolgende opgaande ethanolonderdompelingen. Na de onderdompeling van 60 seconden spoelt u de glijbanen drie minuten in een container met xyleen. Droog vervolgens de glijbanen op het RNase-vrije oppervlak op kamertemperatuur gedurende 10 seconden voordat u de monsters in montagemedium monteert die is bereid met RNase-vrij water.

Breng na 10 tot 20 seconden de dia's over op het microdissectionplatform. Voor laserafvang microdissection, zet de macht voordat u op de laser. Schakel vervolgens de microscoopcontroller in de computer in en start de laser capture microdissection software.

Selecteer in het deelvenster Microscoopbediening de 10 keer vergroting. Stel onder Laser Control de laserparameters voor weefseldissectie in en selecteer een laserfrequentie van 120 hertz en een laserstroom van 100%Voor nauwkeurige lasermicrodissection, stel de snelheid in op 10 en stel het diafragma in op 10 micrometer. Stel dan de stroom in op 53.

Laad de weefselcollector die het weefsel na de sectie zal vastleggen en klik op de tweede ontlaadknop. Vervang de lege collector door DNase en Rnase-vrije 0,5 milliliter PCR flathead buizen met 30 microliter lyse buffer per buis. Breng de collector terug naar de machine en klik verder.

Laad het verwerkte monster op de microscoop en klik op Lossen in de lasermicrodissection software. Het monster op de schuifhouder omhoog en de schuifhouder op het podium plaatsen. Klik op Doorgaan om door te gaan en selecteer Knippen in het venster Shapes knippen.

Gebruik de microscoop controles om het gebied van belang te vinden en een overzicht te trekken rond het gebied van belang. Selecteer vervolgens een buis van de bestemmingscollector en klik op Knippen starten om de weefselmicrodissection te laten verlopen. Wanneer alle gebieden van belang zijn ontleed, breng de collector buizen van de houder op droog ijs totdat ze downstream verwerking.

Om weefsels met een superieure morfologie en RNA-integriteit te verwerven, werden verschillende perfusiebenaderingen geëvalueerd. Om de gebieden van belang te ontleden, is het noodzakelijk om de weefsels te bevlekken met onschadelijke kleurstoffen voor RNA. De daaropvolgende perfusie van tumordragende muizen met tyrode oplossing en 30% sacharose gevolgd door een nachtelijke incubatie in 30%sucrose resulteert in het behoud van de morfologie en RNA-integriteit van het muizenweefsel.

Hoewel paraformaldehyde weefselfixatie resulteert in een hoogwaardige weefselmorfologie, wordt de RNA-integriteit negatief beïnvloed. Andere benaderingen, zoals het gebruik van een tyrode oplossing incubatie, of tyrode oplossing plus 30% sacharose oplossing incubaties hebben geen invloed op de RNA-kwaliteit, maar een verminderde resolutie in de weefselmorfologie wordt waargenomen. Als de weefsels niet zijn gemonteerd met montagemedium, worden de secties uitgedroogd en verslechtert de morfologie tijdens de montage van de weefselmonsters met 15% montagemedium opgelost in water een hoogwaardige weefselmorfologie.

Laser vangen microdissectie microdiscopentie microbeeldvorming maakt selectie van het tumorweefsel voor dissectie. Deze regio van belang selectie maakt dan dissectie van gebieden van belang binnen elk weefsel monster voor RNA integriteit analyse. Het handhaven van een hoge kwaliteit tumorweefsel morfologie en RNA integriteit is van cruciaal belang.

Tyrode-oplossing en 30%sucroseperfusie met nachtelijke bewaring in 30% sacharose verbeteren de weefselmorfologie voor LMD aanzienlijk. Snelle lyomafixatie, kleuring en montage met GAN-oplossing is een cruciale stap in het behoud van de RNA-kwaliteit en het voorkomen van scheuren in het weefsel. We raden aan om ten minste 2,5 keer 10 tot de 6e vierkante micrometer totale tumor per weefselgebied te sectioneren om de juiste hoeveelheden RNA te verkrijgen voor zowel RNA-kwaliteitscontrole als transcriptieanalyse.

LMD maakt de analyse mogelijk van de moleculaire signaleringstrajecten die glioomheterogeniteit en invasie reguleren, die nieuwe potentiële doelen voor toekomstige translationele ontwikkeling in preklinische glioommodellen kunnen onthullen.